Посещений:
ВИЧ ИНФЕКЦИЯ



Терапия с помощью редактирования генов CCR5 5

The Strategies and Challenges of CCR5 Gene Editing in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for the Treatment of HIV
• Karthik V Karuppusamy, • Prathibha Babu & • Saravanabhavan Thangavel
Stem Cell Reviews and Reports (2021)



Вирус иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) был идентифицирован в 1983 году как ретровирус, вызывающий синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), и до сих пор остается неизлечимым иммунным заболеванием, несмотря на десятилетия целенаправленных исследований. Более того, клиническое лечение смертельной ВИЧ-1 инфекции становится все более сложным из-за генерации устойчивых штаммов и стабильных латентных резервуаров ВИЧ-1 в различных тканях и кроветворных клетках. Различные генотерапии генетических заболеваний и рака разрабатываются с целью решения ряда проблем, включая высокую стоимость лечения, разработку технологий переноса генов и редактирования генома с достаточно высокой эффективностью, подавление инсерционных мутаций от вирусных векторов, предотвращение внецелевого редактирования с помощью систем редактирования генома и контроль иммунного ответа на векторы для лечения in vivo. Поскольку генотерапия является дорогостоящим методом лечения, а ее безопасность еще не установлена, необходимо тщательно оценить необходимость и применение генотерапии, включая ее эффективность, прежде чем приступать к ее практическому использованию.
АРТ является на сегодня стандартом лечения ВИЧ-1-положительных пациентов, при котором назначаются антагонисты против одного или разных этапов ВИЧ-1 инфекции, таких как проникновение и распространение. Сюда входят ингибиторы обратной транскриптазы, ингибиторы протеазы и ингибиторы интегразы. В 1987 году был разработан зидовудин (zidovudine (AZT)) как первый антиретровирусный препарат, который снизил перинатальную передачу ВИЧ [1]. Доступность саквинавира (saquinavir), препарата-ингибитора протеазы, открыла возможность Highly Activated Anti-retroviral therapy (HAART) , при которой для подавления размножения вируса назначаются несколько препаратов в комбинации [2]. HAART была признана передовым методом лечения ВИЧ-1 инфекции. Антиретровирусная терапия позволяет снизить общее бремя ВИЧ-1 у пациента, постоянно удаляя из организма обнаруживаемые уровни вируса, тем самым задерживая прогрессирование СПИДа и продлевая жизнь людей. Несмотря на то, что АРТ является эффективной стратегией лечения, она не обеспечивает окончательного излечения, поскольку сохраняется риск, связанный с латентными вирусными резервуарами. Последние данные свидетельствуют о том, что ВИЧ-1 также инфицирует HSPC. ВИЧ-1 интегрирует весь свой геном в клетки хозяина и сохраняется, не производя инфекционных вирусов, что известно как латентность [3]. Латентность позволяет инфицированным клеткам избегать иммунного распознавания и удаления, что может привести к созданию резервуаров в HSPC. Поскольку инфицированные HSPC само-обновляются и дифференцируются в гемопоэтические линии на протяжении всей своей жизни, это приводит к сохранению вирусов в крови в организме пациента. Другой недостаток заключается в том, что, хотя терапия поддерживает уровень РНК ВИЧ-1 в организме ВИЧ-1-инфицированных пациентов на низком уровне, она не устраняет латентную провирусную ДНК. Для подавления репликации ВИЧ-1 из латентной провирусной ДНК пациенты зависят от приема cART в течение всей жизни, поскольку прекращение приема cART приводит к рецидиву вирусной инфекции [4]. Кроме того, длительный прием cART ассоциируется с развитием лекарственно-устойчивых штаммов ВИЧ-1 и метаболическими изменениями в клетках хозяина, приводящими к повреждению органов [5].
Многие попытки разработать вакцины против ВИЧ оказались тщетными: лишь немногие из них дошли до клинических испытаний, и ни одно из исследований не дало достаточного терапевтического эффекта. Испытание RV144, проведенное в 2009 году, было единственным зарегистрированным клиническим испытанием вакцины, продемонстрировавшим заметную эффективность в 31,2% [6]. Даже довольно недавнее исследование вакцины против ВИЧ-1 HVTN702, проведенное Национальным институтом здоровья (США) среди жителей Южной Африки, было прекращено из-за его неэффективности [7].
Определение тропизма вируса ВИЧ-1 и основных ко-рецепторов, CCR5 и CXCR4, опосредующих проникновение ВИЧ-1, привело к появлению ко-рецепторной таргетной терапии в качестве альтернативы cART или в качестве дополнительного лечения наряду с cART [8]. Ингибирование CCR5 с помощью маравирока (maraviroc), малой молекулы, которая избирательно блокирует CCR5, привело к ограничению проникновения ВИЧ-1 в иммунные клетки и продемонстрировало значительный уровень вирусной супрессии и улучшение количества клеток CD4 на 48-й неделе наблюдения [9]. В настоящее время маравирок одобрен FDA для лечения ВИЧ-1. Другими доступными вариантами являются ингибирование CXCR4 с помощью препарата AMD3100 или как CCR5, так и CXCR4 с помощью препарата AMD3541. Таким образом, лечение, направленное на корецепторы, является интересным подходом к лечению ВИЧ [10]. Результатом лечения ВИЧ может быть стерилизующее излечение (полное уничтожение вируса), функциональное излечение (подавление вирусной нагрузки) или ремиссия не обнаруживаемого вирусного груза.

The CCR5 and CXCR4 Co-Receptor Mediated HIV Infection


ВИЧ-1 проникает в иммунные клетки через рецепторы CD4 и обусловливает инфекцию, проходя следующие этапы: 1) слияние с клеточной мембраной 2) обратная транскрипция его РНК в ДНК 3) интеграция вирусной ДНК в ДНК хозяина 4) транскрипция и трансляция вирусной ДНК 5) сборка вируса и разрушение клетки хозяина, что приводит к истощению иммунных клеток. Значительное истощение иммунных клеток в конечном итоге приводит к СПИДу (рис. 1).



Fig. 1 Co-receptor mediated HIV infection: 1. R5 HIV-1 finds CD4 expressing cells (Macrophages and T-cells) 2. Establishment of interaction with CD4 receptor and gp120 of HIV 3. Recruitment of CCR5 co-receptor and binding of co-receptor for fusion 4. HIV starts releasing viral Capsid into target cells 5. Released capsid in target cells 6. Release of viral RNA into the target cells 7. Reverse transcription of viral RNA into cDNA. 8. Proviral DNA integration into host genome

Хемокиновые рецепторы CCR5 и CXCR4 играют важную роль в качестве ко-рецепторов для ВИЧ-1 инфекции. CCR5 принадлежит к семейству рецепторов, связанных с белками G, кодируется в коротком плече хромосомы 3 и экспрессируется на иммунных клетках, таких как CD4 T-клетки, макрофаги и дендритные клетки. CXCR4, закодированный в хромосоме 2, экспрессируется на клеточной поверхности гемопоэтических клеток и специфичен для стромального клеточно-производного фактора-1. Гликопротеин оболочки ВИЧ-1 (gp) состоит из шипов, сформированных из тримеров гетеродимеров gp120-gp41. Во время инфекции внешняя субъединица gp120 связывается с рецептором CD4, действуя как имитатор хемокина, после чего происходит конформационное изменение белков оболочки, обнажающее трансмембранную субъединицу gp41. Теперь Gp41 взаимодействует либо с CCR5, либо с CXCR4, выбор которых определяет вирусный тропизм, тем самым соединяясь с мембраной клетки-мишени для доставки вирусной капсиды. Существует три основных тропизма ВИЧ-1, основанных на использовании ко-рецепторов для проникновения в клетку-хозяина: R5 (использует CCR5), X4 (использует CXCR4) и R5X4 (использует оба рецептора) [11]. Тропизм R5 ВИЧ инициирует раннюю стадию инфекции, а на более поздних стадиях, по мере прогрессирования СПИДа, преобладает более вирулентный тропизм X4 [12, 13].

HIV-1 Remission through CCR5 Δ32 Allogenic Haematopoietic Stem Cell Transplantation


Примерно 1% европейского населения имеет гомозиготный генотип CCR5Δ32, который приводит к отсутствию экспрессии CCR5, обеспечивая естественную устойчивость к ВИЧ-1 [14]. Аллогенная трансплантация стволовых клеток с использованием HSPC, полученных от таких CCR5Δ32 доноров, показала многообещающие результаты против R5-тропной ВИЧ-1 инфекции.
Hutter и др. (2009) сообщили о первом прорывном случае ремиссии ВИЧ-инфекции, известном как берлинский пациент [15]. Берлинский пациент был диагностирован как ВИЧ-1 положительный и проходил курс HAART в течение 4 лет. В 2006 году у него был диагностирована Acute Myeloid Leukemia (AML). Трансплантация стволовых клеток была проведена от HLA-соответствующего (10/10) донора с гомозиготным генотипом CCR5Δ32. Пациент прошел строгую схему кондиционирования с тотальным облучением тела (TBI) и приемом циклофосфамида. В связи с рецидивом AML после первой трансплантации ему была проведена вторая трансплантация стволовых клеток от того же донора. Долгосрочное наблюдение за берлинским пациентом показало 100% химеризм при наличии гомозиготного генотипа CCR5Δ32, без выявления вирусов в лимфатических узлах, кишечнике, мозге и CD4-клетках [16].
Недавно второй пациент, получивший название "лондонский пациент", достиг ремиссии ВИЧ-1 с помощью того же подхода. Как и в первом случае, ему была проведена трансплантация HSPC от HLA-соответствующего (9/10) донора с гомозиготным генотипом CCR5Δ32, и АРТ терапия была прекращена через 16 месяцев после трансплантации [17]. Вирусный рецидив не наблюдался даже после 30 месяцев отмены АРТ. Резервуар ВИЧ-1, проанализированный с помощью высокочувствительного анализа, не выявил вирусов в жидкостях организма, таких как сперма, плазма, а также в лимфоидных органах, прямой и ободочной кишке, сигмовидной кишке и терминальной части подвздошной кишки. Также низкий уровень вирусной нагрузки наблюдался в центральных Т-клетках памяти CD4 и тканях лимфатических узлов, а положительный сигнал для LTR и env указывал на то, что для стерилизующего излечения может потребоваться более длительное время.
Дальнейшие проявления заболевания, связанные с ВИЧ-1, не появились у пациентов из Берлина и Лондона даже после отмены АРТ в течение 12 лет и 30 месяцев соответственно. Эти результаты служат доказательством успешной ремиссии ВИЧ-1 с использованием CCR5-нулевых HSPC. Клинические результаты у пациентов из Берлина и Лондона приведены в таблице 1. Стерилизующее излечение у этих пациентов до сих пор остается неизвестным, поскольку низкие уровни вирусной РНК ВИЧ-1 и провирусной ДНК были обнаружены в некоторых тканях обоих пациентов при длительном наблюдении. Низкое число копий РНК ВИЧ-1 было обнаружено в плазме крови и прямой кишке у пациента из Берлина и не обнаружено у пациента из Лондона, в то время как дефектная провирусная ДНК ВИЧ-1 была обнаружена как у пациентов из Берлина, так и Лондона. Примечательно, что последовательности Env и LTR вирусного генома были обнаружены в лимфатическом узле лондонского пациента, но Integrase и Ψ отсутствовали, что привело к неспособности производить инфекционные частицы ВИЧ-1 [18].



Таблица 1 Клинические исходы у пациентов из Берлина и Лондона, перенесших аналогичную аллогенную трансплантацию стволовых клеток от CCR5-нулевых доноров

Было ли уничтожение ранее созданных резервуаров ВИЧ-1 у берлинского пациента обусловлено аллогенной HSCT или интенсивным режимом кондиционирования, включающим тотальное облучение тела, остается неясным. У инфицированных SHIV обезьян, получивших тотальное облучение организма, наблюдалось быстрое истощение CD4 клеток периферической крови, а также CD4 клеток в лимфоидных тканях, таких как селезенка и подмышечные лимфатические узлы. Только 30-40% CD4-клеток были уничтожены в селезенке, что указывает на то, что остаточные инфицированные ВИЧ-1 клетки все еще могут сохраняться в лимфоидных тканях и TBI может быть недостаточно для ликвидации вирусных резервуаров [19]. В соответствии с этим, другое исследование продемонстрировало эффективное сокращение резервуаров ВИЧ-1 в лимфоидных тканях у ВИЧ-1-инфицированных обезьян, которым трансплантировали аутологичные стволовые клетки, модифицированные по CCR5. Эти данные свидетельствуют о том, что стволовые клетки, с модифицированными CCR5, а не тотальное облучение организма устраняют вирусные резервуары на длительный срок [20]. Это предположение подкрепляется ремиссией у пациента из Лондона, который не подвергался тотальному облучению. Необнаруженные уровни резервуара в большинстве образцов тканей и периферической крови у пациентов Лондона и Берлина доказали, что трансплантация CCR5-нулевых HSPC уничтожает тканевые резидентные латентные резервуары ВИЧ-1. Это также подтверждается тем, что использование аллогенных стволовых клеток с диким типом CCR5 или гетерозиготным генотипом CCR5Δ32 у ВИЧ-инфицированных пациентов привело к прекращению вирусного рецидива после отмены АРТ [21].
В целом, трансплантация аллогенных стволовых клеток от донора с генотипом Δ32 является перспективным подходом для достижения ремиссии ВИЧ-1.

Remission against R5 Tropic Virus by CCR5 Disruption


Drug Mediated CCR5 Inhibition Improves CD4 Cell Count


После пионерской работы Cocchi et al., показавшей, что CCR5 является важным ко-рецептором, используемым R5-тропным вирусом ВИЧ-1 для проникновения в Т-клетки и макрофаги, он был утвержден в качестве стандартной терапевтической мишени против ВИЧ-1.
Несколько антагонистов CCR5 были идентифицированы путем высокопроизводительного фармакологического скрининга, и эти антагонисты стабилизируют неактивный белок CCR5, ограничивая связывание хемокинов и gp120 [22]. Маравирок (Maraviroc), антагонист CCR5, показал многообещающие результаты в клинических испытаниях с минимальной токсичностью, низким уровнем копий РНК ВИЧ-1 и увеличенным количеством клеток CD4 [23, 24]. Маравирок связывается с внеклеточной петлей белка CCR5 и вызывает конформационное изменение, тем самым предотвращая взаимодействие ВИЧ-1 с рецептором CCR5. Впоследствии несколько других хемокиновых препаратов, таких как викривирок и аплавирок, потенциально подавляли ВИЧ-1 в течение 24 месяцев, но в конечном итоге приводили к развитию злокачественных опухолей [25] и гепатотоксичности [26]. Также сообщалось об устойчивости к препаратам, направленным на CCR5, что ставило под сомнение их долгосрочную эффективность.

Disruption of CCR5 Gene Using Genome Editing Approaches


Недавно разработанные инструменты редактирования генома, такие как Zing Finger Nucleases (ZFN), Transcription Activator like Effector nucleases (TALEN) и Clustered Regularly Interspaced Short palindromic repeats (CRISPR-Cas9), позволяют ученым вызывать нокаут белка CCR5 путем индукции двухцепочечных разрывов ДНК (DSB) в открытой рамке считывания CCR5 в иммунных клетках, а также в гемопоэтических стволовых клетках.

B.1 ZFN Mediated CCR5 Disruption


ZFN представляют собой искусственно созданные гетеродимеры, синтезированные путем слияния ДНК-связывающего домена с цинковыми пальчиками и ДНК-расщепляющего домена. ДНК-связывающий домен состоит из двух модулей цинковых пальцев, которые позволяют распознавать уникальные гексамерные последовательности в геноме. Домен расщепления ДНК включает эндонуклеазу FokI, которая после димеризации при распознавании ДНК-связывающего домена расщепляет ДНК, что приводит к образованию DSBs в локусе мишени. Репарация ДНК по пути негомологичного концевого соединения приводит к встраиванию/замене/удалению нуклеотидов, препятствуя экспрессии функционального белка. Несколько исследований продемонстрировали разрушение CCR5 с помощью ZFN в клетках CD4 и HSPC.
Опосредованная аденовирусом преходящая экспрессия ZFN, нацеленная на первый трансмембранный домен белка CCR5 в клетках CD4 человека, вызывала разрушение CCR5 со средней частотой 50%. CD4-клетки с нарушенным CCR5 проявляли устойчивость к R5-HIV-1 как in vitro, так и in vivo. Исследования приживления у мышей NOG показали снижение вирусной нагрузки и увеличение количества CD4 клеток с 3-кратным селективным обогащением CCR5 отрицательных клеток при ВИЧ-1 инфекции [27]. Компания Sangamo therapeutics провела клиническое исследование с участием 12 ВИЧ-1-инфицированных лиц, которые находились на АРТ. Аутологичные CD4-клетки были собраны у пациентов. CCR5 был отредактирован с помощью ZFN и введен пациентам. Во время перерыва в АРТ количество CD4 клеток дикого типа начало снижаться, в то время как количество CD4 Т-клеток, модифицированных CCR5, оставалось стабильным. Хотя редактирование CD4 клеток по CCR5 с помощью ZFN было безопасным для человека, полной ремиссии ВИЧ-1 не наблюдалось, возможно, из-за низкой эффективности редактирования генов и сохранения резервуаров в других тканях [28]. Одновременное редактирование CCR5 и CXCR4 в CD4-клетках человека обеспечивало защиту от тропного вируса X4 и R5 у мышей [29, 30].
ZFN также используются для редактирования CCR5 в HSPC. Ad5/F35-опосредованная доставка ZFN в HSPCs может редактировать клетки, но с низкой эффективностью - 5% indels. Они смогли увеличить частоту редактирования до 30% с помощью активаторов Protein Kinase C. Активаторы PKC работают посредством пути ERK/MEK для повышения эффективности редактирования генов. Взрослые HSPC, модифицированные по CCR5, сохранили потенциал мультиклональности у мышей NSG и продемонстрировали устойчивость к R5-тропному ВИЧ-1 [31, 32].
Для преодоления токсичности, связанной с плазмидной ДНК или Ad5/F35, мРНК, кодирующая ZFN, доставлялась с помощью электропортации, что позволило достичь максимальной 50% эффективности редактирования генов при минимальной токсичности [33]. Этот подход исследован в клиническом испытании (#NCT02500849).
Для достижения 100% эффективности после манипулирования с локусом CCR5 мРНК ZFN была осуществлена электропортация донорской матрицы с AAV6, кодирующей зеленый флуоресцентный белок, во взрослые мобилизованные HSPC периферической крови. Эта стратегия позволяет отбирать CCR5-отредактированные клетки для трансплантации путем сортировки GFP-позитивных клеток [34]. Однако перенос в клинику такой стратегии будет непростым. Другие подходы, используемые для обогащения ген-модифицированных стволовых клеток мышей, включают избыточную экспрессию альдегиддегидрогеназы-1 или мутанта лекарственной устойчивости метилгуанинметилтрансферазы в HSPCs с помощью лентивирусных векторов, которые обеспечивают устойчивость клеток к цитотоксическим агентам, таким как циклофосфамид и темозоломид. Используя этот подход, они наблюдали значительное увеличение количества ген-модифицированных клеток у модельных мышей и не человеко-образных приматов [35, 36].
Также сообщалось о нарушении гена CCR5 в аутологичных HSPC от обезьян. Эти исследования показали 64% модификацию ex vivo и 40% in vivo после трансплантации. CCR5-измененные HSPC сохранили способность к приживлению и многоклональный потенциал у крупных модельных животных [37]. Кроме того, CCR5-модифицированные иммунные клетки были обнаружены в кишечнике и лимфатических узлах, где обычно преобладают латентные резервуары ВИЧ-1, что свидетельствует об успешном замещении клеток резервуара ВИЧ-1-инфекции CCR5-модифицированными клетками. Защищенные CCR5-модифицированные клетки обладали потенциалом для уничтожения вирусных резервуаров посредством эффекта "трансплантат против ВИЧ-1". Однако результаты долгосрочного наблюдения за теми же обезьянами показали снижение частоты модификации CCR5 с 40% до 4%, что может оказаться недостаточным для длительной вирусной ремиссии без АРТ [20].

B.2 TALEN Mediated CCR5 Disruption


TALE был идентифицирован как естественный белок в патогенных для растений бактериях Xanthomonas Species. Он искусственно сконструирован для слияния нуклеазы Fok1 на С-конце TALE и используется для направленного редактирования генома. Плазмиды, кодирующие варианты TALEN, были трансфецированы в клетки HEK293T для получения 45% редактирования генов локуса CCR5 с лучшей жизнеспособностью и меньшим количеством эффектов вне мишени, чем с ZFN [38]. Доставка TALEN в клетки в виде плазмиды связана с сильной цитотоксичностью. Чтобы преодолеть этот барьер, в другом исследовании было показано слияние проникающего в клетки пептида TAT с TALEN, который продемонстрировал 5% частоту модификации локуса CCR5 в iPSCs (индуцированные плюрипотентные клетки) человека [39]. Впоследствии трансфекция мРНК, кодирующей TALEN, в клеточной линии PM1 и первичных Т-клеток человека показала увеличение частоты редактирования примерно на 90% и 50% соотв. [40]. Кроме того, Shi et al. провели скрининг 28 новых TALEN в клеточной линии GHOST-CCR5-CXCR4 и первичных CD4-клетках человека. Они отметили, что TALEN-опосредованное разрушение CCR5 придает клеткам устойчивость к ВИЧ-1 при низкой цитотоксичности по сравнению с ZFN [41].

B.3 CRISPR/Cas9 Mediated CCR5 Ablation


CRISPR/Cas9 - это врожденная иммунная система бактерий, которая уничтожает вторгшиеся вирусы. Нацеливание на локус осуществляется с помощью sgRNA, состоящей из РНК CRISPR и транс-действующей РНК, а воздействие на мишень осуществляется с помощью нуклеазы Cas.
Первоначально CRISPR/Cas9 поставлялись в виде плазмид и экспрессировались под промотором Pol III, что приводило к снижению эффективности редактирования генов [42]. Недавние усовершенствования позволили упростить две РНК до одной синтетической направляющей гид РНК и повысить стабильность путем включения фосфотиоратных модификаций, что улучшило нацеливание и активность расщепления ДНК [43-46]. Подобно ZFN и TALENS, CRISPR/Cas9 также разрушает CCR5 как в CD4 T-клетках, так и в человеческих HSPC с эффективностью 42% и 34% соотв. [47]. Сравнительные исследования TALEN и CRISPR/Cas9, нацеленных на ген CCR5 в клетках HEK293T, показали усиление редактирования с помощью CRISPR/Cas9 [48].
AAV-опосредованная доставка отдельных компонентов CRSIPR/Cas9 в клетки CD4 приводила к абляции белка CCR5 до 30% [49] Упаковка компонентов Cas9 и sgRNA в одну конструкцию AAV могла бы повысить эффективность, но размер spCas9 не позволяет реализовать такие усилия. В альтернативном подходе для преодоления ограничений по размеру был использован Cas9 меньшего размера, выделенный из Staphylococcus aureus, что привело к успешной модификации гена CCR5 в первичных клетках CD4 и HSPC [50]. Опосредованное CRISPR/Cas9 уменьшение CCR5 в HSPC, полученных из печени плода человека, продемонстрировало приживление и мультиклональный потенциал. Иммунные клетки, полученные из HSPC со снижением CCR5, продемонстрировали устойчивость к ВИЧ-1 у мышей NPG [51].
Лентивирусный вектор, кодирующий CRISPR/Cas9 против локуса CCR5, был трансдуцирован в HSPC обезьян для удаления гена CCR5. В качестве контроля использовали лентивирусный вектор, экспрессирующий GFP. После введения экспрессия GFP составляла 70%, а спустя 8 месяцев после введения она снизилась до 6,5%. Примечательно, что при отмене АРТ через 8 месяцев после трансплантации количество клеток, модифицированных CCR5, увеличилось в 3 раза, но ремиссия SIV не была достигнута из-за снижения частоты редактирования [52].
Кроме того, ранние данные, представленные на 5-й конференции по клеточной и генной терапии для излечения ВИЧ-1 в 2019 году, показали, что аутологичные гемопоэтические стволовые и клетки предшественники, модифицированные по CCR5 с помощью ZFN, были приживлены у пациентов с ВИЧ-1 с успешным созданием потенциала многоклеточного восстановления в двух различных группах. Несколько клинических испытаний, направленных на излечение ВИЧ с использованием различных подходов генной терапии, перечислены в таблице 2.



Таблица 2 Список клинических испытаний с использованием HSPCs для генной терапии ВИЧ-инфекции<

Проблемы, связанные с редактированием CCR5 в HSPCs


Несмотря на обширные исследования ВИЧ-1 инфекции на протяжении многих лет, успешная ремиссия ВИЧ была достигнута только в двух случаях. Временной промежуток между берлинским и лондонским случаями составляет почти десятилетие, это указывает на то, что трансплантация гомозиготных CCR5δ32 ограничена множеством факторов, включая доступность доноров, вирусную реакцию и риски, связанные с трансплантацией. Некоторые из этих факторов могут также препятствовать прогрессу терапии с помощью редактирования генов HSPCs (рис. 2).



Fig. 2 Challenges associated with CCR5 based gene therapy using Hematopoietic stem and Progenitor cells (Challenges highlighted in red)



Failure of HSPCs Mobilization in HIV-1 Patients


Для манипуляций и последующей аутологичной или аллогенной трансплантации рекомендуется минимальная доза клеток не менее 5 х 106 HSPC на кг веса пациента. Если у здоровых доноров такая концентрация может быть достигнута с помощью мобилизационных реагентов, таких как G-CSF и Plerixafor, то целесообразность такого подхода у ВИЧ-1-инфицированных лиц неясна. Пациент из Лондона первоначально подвергся мобилизационным реагентам на основе CXCR4 для сбора стволовых клеток, что оказалось неудачным. Другое исследование показало неудачу мобилизации G-CSF у 27% исследуемой популяции, состоящей из 155 пациентов с ВИЧ-1. Эта частота относительно высока по сравнению со здоровыми людьми, у которых частота неудач мобилизации составляет около 5% [53, 54]. Недавно компания City of Hope совместно с Sangamo therapeutics попыталась провести два раунда мобилизации у ВИЧ-инфицированных людей с использованием плериксафора и G-CSF для получения 7,5 х 106 HSPCs/кг. Причины плохой мобилизации с использованием доступных мобилизующих агентов у ВИЧ-инфицированных людей в основном неизвестны.

The Un-Optimized Conditioning Regimen


Режимы кондиционирования играют критическую роль в успешности генотерапии, поскольку плохая подготовка (conditioning) может снижать частоту отредактированных по CCR5 фракций HSPCs. Берлинский пациент стал объектом кондиционирования высокой интенсивности с TBI и воздействия cyclophosphamide, тогда как Лондонский пациент получал воздействие только cyclophosphamide. Cyclophosphamide вместе с TBI был использован в клиническом испытании в Китае, где HLA отобранные аллогенные HSPCs редактировали по CCR5, и используя CRISPR/Cas9 трансплантировали (NCT03164135.) Проводящееся клиническое испытание с помощью City of Hope вместе с Sangamo therapeutics тестировало дозы busulphan в двух группах и они обнаружили увеличение восстановления CD4 T клеток в группе, получавшей высокую дозу busulphan (NCT02500849). Мало исследований, тестирующих режимы оптимального кондиционирования, для трансплантации модифицированных по CCR5 HSPCs. Режимы кондиционирования могут снижать груз вируса, что может быть благоприятным эффектом для редактирования генов HSPCs.

Graft Versus Host Disease


Аутологичные HSPC являются оптимальными кандидатами для редактирования гена CCR5, поскольку они не провоцируют GVHD. Однако ВИЧ-инфицированные пациенты, имеющие следующие проблемы, такие как 1) гематологические злокачественные опухоли 2) плохая мобилизация HSPC 3) низкое качество HSPC, нуждаются в редактировании CCR5 только в аллогенных HSPC от HLA-сопоставимых доноров. Хотя это может быть интересной стратегией, существует риск GVHD, связанный с этим подходом. О таком GVHD сообщалось у пациента с ВИЧ, который получил ex vivo измененные по CCR5 аллогенные HSPC от полностью совпадающего по HLA донора [55]. Это предупреждает GVHD - и это критический фактор при трансплантации стволовых клеток.

The Low-Frequency of Gene Edited Cells In Vivo


Первый случай трансплантации HSPCs с отредактированным геном CCR5 с помощью CRISPR/Cas9 оказался безопасным, но показал низкую эффективность против ВИЧ-1 инфекции. Эффективность редактирования введенного продукта составила 17,8%, что было значительно ниже допустимого, а in vivo она снизилась до 2,5%. Как и в данном исследовании, предварительные результаты исследования City of Hope с Sangomo показали, что частота редактирования введенного продукта составляла около 23% и 28% в группе 1 и группе 2, соотв. Но только 4% прижившихся CD4 Т-клеток сохранили генную модификацию после 800 дней трансплантации (NCT02500849). Это может быть связано со следующими причинами: 1) частота долгосрочного повторного заселения стволовых клеток или редактирования генов в долгосрочно повторно заселяющихся стволовых клетках очень низкая 2) гетерозиготное редактирование CCR5 может не обеспечить устойчивость к ВИЧ, поскольку отредактированные клетки уничтожаются инфекцией, что приводит к снижению частоты этих клеток 3) чистота CD34+ HSPC, используемых для манипуляции, низкая. В китайском исследовании только 71% клеток были положительны по маркеру CD34 (NCT03164135). 4) Процедура генной манипуляции нуждается в дальнейшей оптимизации. В китайском исследовании для доставки большой дозы HSPC использовалась повторная электропортация. Это может привести к изменению частоты редактирования генов. Электропортация в клинических масштабах была бы предпочтительнее, чтобы избежать вариаций в редактировании генов.

The Pre-Existing X4-Tropic Virus


Как и пациентам из Берлина и Лондона, пациенту из Эссена были пересажены аллогенные HSPCs с CCR5Δ32/Δ32. Однако, в отличие от предыдущих случаев, у пациента из Эссена при длительном наблюдении наблюдался вирусный рецидив. Результаты исследования показали наличие незначительной доли вирусов с Х4-тропностью до трансплантации, и эти вирусы инфицировали прижившиеся CCR5Δ32/Δ32 HSPC, используя рецептор CXCR4. Более того, данные скрининга пациентов из City of Hope with Sangamo therapeutics, показали, что 40% людей имели X4-тропный ВИЧ. Ранее существовавший X4-тропный ВИЧ все еще мог заражать клетки, отредактированные по гену CCR5, и вызвать неудачу генотерапии. Если разрушение CCR5 в HSPC является вполне осуществимым подходом, то разрушение CXCR4 в HSPC может привести к дефектам приживления и приживления отредактированных HSPC в костном мозге [56].

Cell to Cell Transmission of HIV


Передача ВИЧ-1 от клетки к клетке выше, чем при бесклеточных зависимых от рецепторов вирусных инфекциях. Механизмом передачи ВИЧ-1 от клетки к клетке является образование вирусных синапсов между инфицированными и неинфицированными Т-клетками и фагоцитоз инфицированных, умирающих и мертвых Т-клеток макрофагами [57]. По этому механизму могут передаваться как тропные вирусы R5, так и тропные вирусы X4. Блокирование передачи ВИЧ-1 от клетки к клетке считается более сложной задачей, как с помощью широко нейтрализующих антител, так и с помощью cART. Можно ли с помощью генетической абляции CCR5 предотвратить передачу ВИЧ от клетки к клетке, еще предстоит выяснить.
Совместное культивирование макрофагов, полученных от гомозиготных индивидуумов с геном Δ32, с CCR5-положительными ядерными клетками периферической крови приводит к преобразованию CCR5-ve клеток в CCR5+ve клетки и делает их восприимчивыми к R5-тропной инфекции ВИЧ-1. Исследование доказало, что белок CCR5 переносится из положительных клеток в отрицательные через микровезикулы. Ингибирование образования внеклеточных везикул блокирует перенос CCR5. Также наблюдается перенос белка CCR5 из периферических одноядерных клеток в эндотелиальные клетки во время трансэндотелиальной миграции, что позволяет предположить, что CCR5-ve клетки также могут быть инфицированы ВИЧ через приобретенный CCR5 рецептор от CCR5+ve клеток [58]. В другом исследовании было доказано, что даже усеченный белок CCR5 сохраняет свои функциональные свойства в клетках HEK293T [59]. Все эти результаты рекомендуют использовать CCR5-нулевые CD4 Т-клетки и макрофаги против передачи ВИЧ-1 от клетки к клетке.

HSPCs Harbouring HIV DNA


Все субпопуляции Т-клеток несут сходные уровни интактной провирусной ДНК ВИЧ-1, и инфекционный вирус может быть сформирован из любой из этих субпопуляций [60]. Несколько исследований доказали, что ВИЧ-1 инфицирует гемопоэтические клетки-предшественники, что приводит к гематологическим нарушениям и цитотоксичности. HSPC, выделенные от ВИЧ-1-инфицированных людей с высоким грузом вирусов, показали индукцию gag при культивировании с GM-CSF и TNF-α Это указывает на то, что HSPC являются носителями провирусной ДНК ВИЧ-1 [61, 62]. Однако ВИЧ-1 инфекция в субпопуляциях HSPC и индукция образования вируса во время дифференцировки линии плохо изучены. Около 1% HSPC экспрессируют рецепторы CD4/CCR5, а 2,5% HSPC экспрессируют рецепторы CD4/CXCR4, что, возможно, является причиной R5 и X4 тропности ВИЧ-1, приводящей к образованию в них латентных резервуаров [63]. HSPC гетерогенны по своей природе, и определенные субпопуляции способствуют долгосрочному приживлению. Следовательно, инфекционность и индуцируемость ВИЧ-1 среди различных популяций HSPC должны быть тщательно проверены на большом количестве доноров.

CCR5 and CXCR4 Independent HIV-1 Infections


Внеклеточные везикулы и частицы ВИЧ-1 относительно одинаковы по размеру и составу, они окружены липидным бислоем с гликопротеинами. Недавние исследования также показали, что дендритные клетки и макрофаги, инфицированные ВИЧ-1, выделяют экзосомные частицы с белками и молекулами РНК ВИЧ-1, которые могут быть аккумулированы HSPCs [64]. Этот процесс может привести к развитию ВИЧ-1 инфекции в CD4-нулевых примитивных HSPC [65]. Демонстрация in vitro EV-опосредованной ВИЧ-1 инфекции HSPC сильно затруднена ограничениями, такими как лизис HSPC при обработке стержневыми белками ВИЧ-1. Эту концепцию необходимо проверить на надежной платформе [66].

Conclusion and Future Perspectives


Секвенирование всего генома и полногеномное генотипирование продемонстрировали отсутствие повышенного риска смертности у гомозиготных индивидуумов с генотипом Δ32 CCR5 по сравнению с CCR5-позитивными индивидуумами. С этого момента создание нулевого генотипа CCR5 стало основной целью в области генной терапии ВИЧ. Для создания CCR5-отредактированных HSPC используются различные инструменты и стратегии редактирования генов. Основными проблемами в применении этого подхода являются наличие тропного вируса X4, мобилизация HSPC, качество клеток для манипуляций и эффективность редактирования генов. Тщательный отбор пациентов, только что начавших АРТ, может позволить избежать проблем, связанных с рецидивом вируса с тропностью CXCR4. Мобилизация HSPCs и качество мобилизованного продукта могут стать препятствием, но введение даже низких доз HSPCs, отредактированных по CCR5, все равно может принести пользу, поскольку эти клетки не будут удалены вирусом. Недавние сообщения показывают, что предсуществующая ВИЧ-1 инфекция не влияет на потенциал приживления гемопоэтических стволовых клеток у мышей [67] Редактирование гена CCR5 при трансплантации аллогенных стволовых клеток может стать еще одной стратегией, позволяющей обойти проблемы мобилизации и низкого качества HSPC у этих пациентов.
Недавний отчет о клинических испытаниях аутологичных HSPC, отредактированных по генами, при серповидно-клеточной болезни и β-талассемии продемонстрировал приживление и мультиклональный потенциал HSPC, с отредактированными генами. Эффективность в плане производства функционального гемоглобина в исследовании генного редактирования выше, чем в исследованиях лентивирусной генной терапии. Нежелательные явления были в основном связаны с режимом кондиционирования. Это указывает на то, что модификация CRISPR/Cas9 в аутологичных HSPC является осуществимым подходом, и это может быть сделано для пациентов с ВИЧ [68]. Основной проблемой при редактировании с помощью CRISPR/Cas9 является непреднамеренные разрезы вне мишени. Для обнаружения их в настоящее время существует несколько методов, таких как секвенирование всего генома, GUIDE-Seq и DISCOVER-Seq [69]. Обширный анализ внецелевых участков с помощью двух различных методов имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы выбранная sgRNA не имела никаких недозволенных сайтов связывания. Кроме того, еще предстоит определить приемлемую частоту редактирования вне мишени. С появлением протоколов экспансии HSPC пуповинной крови с использованием малых молекул, таких как SR-1 и UM-171, было бы полезно редактировать CCR5 в HSPC пуповинной крови и расширять их для трансплантации. Гемопоэтические клетки предшественники, полученные из iPSCs, еще не продемонстрировали свою стволовость и потенциал дифференцировки. Создание приживляемых HSPC из iPSCs было бы идеальной системой для генотерапии HSPC, поскольку iPSCs, с характерными гаплотипами, могут стать донорами для многих пациентов, и это может быть готовый продукт.
Последние достижения в области редактирования генов, такие как невирусная доставка рибонуклеопротеинов Cas9, включение сигнала 3X-ядерной локализации в spCas9 и использование HiFi Cas9 с химически модифицированными sgRNAs, могут быть объединены с последними достижениями в области трансплантаций, такими как направленное кондиционирование HSPCs с моноклональным антителом AMG-191, которое связывается с CD117 (c-Kit), полностью закрытые автоматизированные платформы для очистки и генного редактирования HSPCs и внутрикостное введение ген-модифицированных HSPCs [70]. Другой стратегией снижения стоимости генной терапии является введение низких доз ген-модифицированных примитивных фракций HSPC, маркированных CD34+ CD90 + CD45RA-, которые могут лучше приживаться, как показано в доклинических исследованиях на животных [71-73]. Это может стать потенциальным путем для разработки эффективной ген-редактирующей терапии ВИЧ.