Посещений:
генотерапия гематопоэтических болезней



Использование гематопоэтических стволовых клеток и клеток предшественников (HSPC)

Gene therapy using haematopoietic stem and progenitor cells
• Giuliana Ferrari, • Adrian J. Thrasher & • Alessandro Aiuti
Nature Reviews Genetics volume 22, pages216–234 (2021)



Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HSC) (HSCT) была рутинной процедурой для лечения врожденных нарушений метаболизма и системы крови более 50 лет1,2. Первые успешные трансплантации для лечения иммунных расстройств были проведены в 1968 году с использованием аллогенных стволовых клеток для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита, связанного с Х-хромосомой (SCID-X1), наследственного заболевания, вызванного инактивирующими мутациями в гене, кодирующем субъединицу рецептора интерлейкина-2 -γ (IL2RG) и синдром Вискотта-Олдрича, редкий Х-сцепленный рецессивный иммунодефицит, характеризующийся тромбоцитопенией, экземой и рецидивирующими инфекциями3,4. Существенный прогресс был достигнут при аллогенной HSCT, и теперь она используется при многих генетических заболеваниях у все большего числа пациентов. Были сделаны улучшения в отношении подбора доноров, стратегий для более эффективного контроля болезни "трансплантат против хозяина", более эффективных режимов кондиционирования и лучшего управления токсичностью и инфекциями. Однако доступность иммуносовместимых доноров с оптимальным соответствием генотипа лейкоцитарного антигена человека (HLA) может ограничить его применение5, как и болезнь трансплантат против хозяина остаются результом использования неподходящих доноров. В результате были изучены методы генной терапии, основанные на генетической модификации аутологичных гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSPC).
Генотерапия аутологичными HSPC используется для предупреждения или лечения моногенных нарушений, ассоциированных с нарушениями созревания и функции измененных клеток крови, таких как болезни врожденного и благоприобретенного иммунитета, нарушения эритроцитов, нарушения тромбоцитов и синдромы с нарушениями костного мозга6-8. Генотерапия с помощью HSPC, кстати, была использована для переноса генов ex vivo, с последующей трансдукцией пациенту его собственных HSPCs с помощью вектора, несущего одну или более копий трансгена7. Будучи возвращенными генетически модифицированные HSPCs подвергались само-обновлению и формировали популяцию модифицированных клеток, которые предавали трансген дочерним кровяным клеткам (Fig. 1). Первая генотерапия с помощью HSPC была проведена в 1990s, чтобы воздействовать на adenosine deaminase (ADA) deficiency SCID (ADA-SCID); хотя исправление было успешным, но эффективность коррекции в этих исследованиях была низкой 9-12. Улучшения техники ex vivo культивирования и созданные новые подходы с использованием long terminal repeat (LTR)-управляемых gamma-retroviral векторов дали свои результаты для клиники при многих primary immunodeficiencies (PIDs)13,14; однако, возникновение T клеточной острой лимфобластной лейкемии сопровождало генотерапию у большой части пациентов - вызванной инсерционным мутагенезом в локусе LMO2 - это привело к существенному торможению всяких ex vivo генотерпий15,16. Разработка само-инактивирующих лентивирусных векторов в качестве платформы для доставки7 сделало возможной наджную и более эффективную инсерцию терапевтических генов в HSPCs.



Fig. 1: The haematopoietic hierarchy and genetic disorders. Bone marrow-resident haematopoietic stem cells and haematopoietic progenitor cells replenish blood and tissues with new mature cells. Both haematopoietic stem cells and haematopoietic progenitor cells express the cell surface marker CD34, which is used to enrich a mixture of haematopoietic stem and progenitor cells for transplantation and gene therapy. Haematopoietic stem cells can be classed as long-term haematopoietic stem cells (LT-HSCs) or short-term haematopoietic stem cells (ST-HSCs). ST-HSCs progressively acquire lineage specifications in order to differentiate into lineage-committed progenitors and eventually terminally differentiated cells, which are released into the peripheral blood. A simplified scheme of human haematopoiesis is presented here. Alternative models have been postulated on the basis of cell surface marker analyses, in vitro and in vivo functional assays, clonal tracking by insertion analyses in haematopoietic stem and progenitor cell gene therapy studies and single-cell RNA analyses (reviewed previously22). Mendelian genetic disorders can affect self-renewal, differentiation and/or the function of different blood and immune cells. Examples of genetic diseases for which gene therapy is under investigation or approved are represented in white boxes below affected cell types. Wiskott-Aldrich syndrome affects platelets and other lineages. CDP, common dendritic progenitor; CID, combined immunodeficiency; CLP, common lymphoid progenitor; CMP, common myeloid progenitor; GMP, granulomonocytic progenitor; LMMP, lymphoid-myeloid primed progenitor; MEP, megakaryocytic-erythroid progenitor; MPP, multipotent progenitor; NK cell, natural killer cell; preB, pre-B cell; preT, pre-T cell; SCID; severe combined immunodeficiency.

За последние два десятилетия успехи в нашем понимании биологии болезней и технологии переноса генов привели к замечательным клиническим успехам (рис. 2). В результате эта область вызвала значительный коммерческий интерес, и два продукта получили одобрение регулирующих органов Европейского агентства по лекарственным средствам (EMA) в Европе, а именно Strimvelis для использования при ADA-SCID и Zynteglo для использования у пациентов старше 12 лет при зависимой от переливания крови β -талассемия - будут и другие, которые, как ожидается, последуют как в Европе, так и в Соединенных Штатах в ближайшие 5 лет. В настоящее время более 300 пациентов прошли курс генотерапией HSPC при клинических испытаниях, и получены убедительные доказательства долговечности корректирующих методов лечения HSPC и их долгосрочной безопасности и клинической эффективности для PIDs, включая SCID-X1, ADA-SCID, Синдром Вискотта-Олдрича, хроническая гранулематозная болезнь (CGD), β-талассемия, метахроматическая лейкодистрофия (MLD) и X-связанная адренолейкодистрофия (X-ALD) (Таблица 1).



Рис. 2: Хронология генной терапии HSPC.

Progress of haematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) gene therapy for use in monogenic disorders and associated enabling technological developments. ADA-SCID, adenosine deaminase deficiency severe combined immunodeficiency; SCID-X1, X-linked severe combined immunodeficiency.

Table 1 Ongoing clinical trials for monogenic disorders using ex vivo HSPC gene therapy

Здесь мы рассмотрим самые последние достижения в генной терапии HSPC. Мы начнем с обзора процесса переноса генов ex vivo, от сбора HSPC и генетической модификации до приживления и долгосрочного клонального отслеживания. Мы обсуждаем последние технологические разработки в области редактирования генов, которые помогут продвинуть эту область вперед к следующему поколению лекарственных препаратов, расширяя область применения до расстройств, не поддающихся текущим подходам к добавлению генов. Наконец, мы обсуждаем применение генной терапии HSPC для различных заболеваний, включая использование HSPC в качестве средств доставки терапевтических белков, и в заключение рассмотрим остающиеся проблемы в этой области и перспективы на будущее.

Ex vivo gene transfer


HSPC collection


Аутологичные HSPC собираются либо путем множественной аспирации из гребней подвздошной кости, либо путем лейкафереза (leukapheresis ) после введения мобилизующих агентов (рис. 3), и собранный материал обогащается клетками CD34 +. Обе процедуры дают смесь из не прижившихся клеток и гетерогенной популяции из примитивных и клон-детерминированных HSPC, которая включает короткоживущие повторно вносимые гематопоэтические клетки-предшественники (HPC), способствующие раннему восстановлению, и очень небольшую фракцию долгоживущих повторно вносимых HSC, которые в течение более длительного времени участвуют в восстановлении кроветворения (рис. 1). Относительный состав HSC и HPC в собранном материале зависит от фона заболевания, возраста, а также от используемого метода сбора и процедуры мобилизации17-20. Получение CD34 + клеток после аспирации из костного мозга отрицательно коррелирует с массой и возрастом донора21. Предварительные результаты клинических испытаний иммунодефицитов, таких как синдром Вискотта-Олдрича, показывают, что как источники из мобилизованной периферической крови, так и источники из костного мозга приживаются и приводят к клинически положительному результату22, хотя тщательные сравнительные исследования между этими двумя источниками отсутствуют. Однако, поскольку лейкаферез дает больше HSPC, чем забор костного мозга на одного донора, и позволяет быстрее восстановить кроветворение23, то в настоящее время это предпочтительная процедура. Колонии стимулирующий фактор гранулоцитов был первым мобилизующим агентом, использованным для аллогенной трансплантации; однако, поскольку у некоторых пациентов обнаруживается ограниченная мобилизационная реакция на гранулоцитарный колонии стимулирующий фактор23, его обычно назначают в сочетании с антагонистом CXCR4 plerixafor в контексте генной терапии22,24-27. Было показано, что введение одного плериксафора обогащает HSPC исходными примитивными свойствами и способностью к репопуляции , хотя и с меньшим выходом, чем при использовании в сочетании с гранулоцитарным колонии-стимулирующим фактором19. Некоторые исследования показали возможность очистки примитивных HSPCs28,29 для использования в качестве исходной популяции для геннотерапии ex vivo; однако вполне вероятно, что примитивные HSPC потребуют больше времени, чем более дифференцированные HPC для восстановления, и поэтому должны быть объединены с HPC для своевременного приживления.



Fig. 3: Manufacturing of engineered HSPCs by gene addition and gene editing.

Autologous haematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) are collected from the patient through multiple aspirations from the iliac crests or by leukapheresis following the administration of growth factor and a chemokine antagonist. The collected material is enriched for CD34+ cells cultured in the presence of cytokines and genetically modified either by gene addition using gammaretroviral or lentiviral vectors or gene editing using zinc-finger, CRISPR-Cas9 or transcription activator-like effector nuclease programmable endonucleases. Before gene therapy, a conditioning preparatory regimen is usually administered to patients to deplete endogenous HSPCs. The intensity of conditioning ranges from reduced intensity to myeloablative, depending on the disease and the engraftment level required to reach the therapeutic threshold. The medicinal product is represented by the gene-corrected cells, ready for infusion at the end of the manipulation or after a cryopreservation and thawing step. Quality control tests performed on the drug product may include those on viability, sterility, endotoxin level, mycoplasma, immune phenotype, number of vector copies per genome, transduction efficiency, transgene expression, vector production impurities and whether the vector is replication competent. In the case of fresh product or rapidly progressive diseases, a two-step strategy is used to allow urgent treatment without completion of all tests. NGS, next-generation sequencing. Adapted from ref.184, Springer Nature Limited.



Vector-based modification of HSPCs


После сбора и обогащения HSPC клетки CD34 + подлежат переносу генов. В большинстве подходов по переносу генов до настоящего времени использовались вирусные векторы, такие как гамма-ретровирусы и лентивирусы, для интеграции терапевтического гена в геном клетки-реципиента (рис. 4a). В начале 1990-х годов гамма-ретровирусные векторы, полученные из вируса мышиного лейкоза Молони, были первыми векторами, использованными для геннотерапии HSPC при иммунодефицитах, включая ADA-SCID30,31, а в 2006 году за ними последовали ВИЧ (HIV)-само-инактивирующиеся лентивирусные векторы32 для X- ALD33 и в 2010 г. путем само-инактивации гамма-ретровирусных векторов для SCID-X1 (ссылка 34). Лентивирусные векторы стали наиболее часто используемыми векторами для генотерапии ex vivo HSPC из-за их надежного профиля безопасности; лентивирусные векторы предпочтительно интегрируются в тело гена, а не в промоторы, снижая возможность аберрантной активации транскрипции (рис. 4b). Кроме того, в само-инактивирующихся векторах вирусный промотор, расположенный в лентивирусном векторе LTR, инактивируется при интеграции в геном, ограничивая трансактивацию транскрипции клеточных генов. Модификации в структуре вектора, включая делецию промоторных вирусных последовательностей в LTR и расщепление генов вирусных белков на отдельные плазмиды, представленные в транс положении, во время производства векторных частиц, с тех пор способствовали снижению генотоксичного риска, связанного с трансактивацией транскрипции и способствовали производству векторных частиц с дефектом репликации35. Хотя генная терапия, опосредованная лентивирусным вектором, имеет отличные показатели клинической безопасности, теоретически остается долгосрочный риск генотоксичности. Кроме того, риски, связанные с химиотерапией в высоких дозах (например, острая токсичность, инфекции, вторичные опухоли), которая требуется в некоторых случаях для генотерапии HSPC, что затрудняют применение этого подхода для менее тяжелых состояний. Существуют также ограничения, которые препятствуют более широкому использованию подходов к генотерапии для генов, которые требуют физиологического контроля экспрессии генов или для мутаций с избыточностью функции.



Fig. 4: HSPC gene therapy vector design and integration preferences.

a | Structure of the murine leukaemia virus (MLV) gammaretrovirus and HIV lentivirus genomes and derived vectors. Gammaretroviral (gRV) vectors harbour a viral promoter in the U3 region of the 5? long terminal repeat (LTR). In self-inactivating gRV (SIN-gRV) and self-inactivating lentiviral (SIN-LV) vectors, deletions in the U3 region abolish the viral promoter, and the expression of the therapeutic transgene is instead driven by a promoter - generally of cellular origin - placed between the two LTRs. Diseases for which each vector is being investigated and the corresponding therapeutic genes are shown. Genes for viral proteins are provided in trans during vector particle production (not shown); the Rev response element (RRE) is included in the lentiviral vector backbone to increase viral titre. b | The differential distribution of MLV and HIV integration sites in the human genome is dictated by factors assembled in the pre-integration complex (PIC) tethering the vector DNA to specific chromatin regions. MLV-derived vectors preferentially integrate into promoters and enhancers, whereas lentiviral vectors integrate into active gene bodies. The bromodomain/extraterminal domain proteins are key proteins interacting with MLV PIC and influencing integration pattern of gRV and SIN-RV vectors. Lens epithelium-derived growth factor (LEDGF; also known as p75) mediates tethering of the lentiviral PIC to transcribed gene regions. Arrows indicate vector integration sites. ?Thal, β-thalassaemia; ADA-SCID, adenosine deaminase deficiency severe combined immunodeficiency; ALD, adrenoleukodystrophy; CGD, chronic granulomatous disease; H3K4me1/2, methylated/dimethylated histone H3 lysine 4; H3K27ac, acetylated histone H3 lysine 27; IBD, integrase-binding domain; IN, integrase; MLD, metachromatic leukodystrophy; MPSI, mucopolysaccharidosis type I; Pol II, polymerase II; SCD, sickle cell disease; SCID-X1, X-linked severe combined immunodeficiency; WAS, Wiskott-Aldrich syndrome. Part b adapted with permission from ref.185, Elsevier.



Gene editing approaches


Сайт-специфическое редактирование генома с использованием программируемых эндонуклеазных платформ, таких как CRISPR-Cas9, эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции, или нуклеаз типа "цинковые пальцы" 36, могут инактивировать вредные аллели, отключить экспрессию репрессора транскрипции или их сайты связывания, точно исправить мутации или вставить здоровые копии генов в "безопасная гавань" генома. Точная генная коррекция может решить потенциальные проблемы, связанные с полу-случайной интеграцией вирусных векторов, хотя следует отметить, что до сих пор не сообщалось об инсерционном мутагенезе при генотерапии, опосредованной лентивирусными векторами. Кроме того, целенаправленное редактирование генов дает преимущество в том, что терапевтический ген находится под контролем эндогенных регуляторных элементов, обеспечивая физиологический уровень экспрессии вместе с возможностью коррекции заболеваний независимо от типа мутации37,38. Недавние исследования продемонстрировали результаты, подтверждающие эту концепцию для гемоглобинопатий39, иммунодефицита SCID-X1 (ссылки 40-42) и синдрома Вискотта-Олдрича43.
Разрывы двойной нити ДНК, индуцированные нуклеазами, редактирующими ген, могут быть восстановлены посредством направленной на гомологи репарации (HDR), если предоставлена донорская гомологичная матрица, или путем подверженного ошибкам негомологичного соединения концов (NHEJ). HDR можно использовать для коррекции мутаций, вызывающих заболевание, тогда как NHEJ приводит к инактивации гена, потенциально корректируя избыточную функцию и доминантно-негативные мутации или вызывая терапевтический нокаут. Было показано, что редактирование генов HSC ex vivo приводит к эффективному NHEJ44; тогда как HDR ведет к долгосрочной репопуляции HSCs на низких уровнях40. HDR может быть не таким эффективным в долгоживущих HSC, как в HPC, потому что она в основном происходит в ходе фазы клеточного цикла (S / G2), несовместимой с состоянием покоя HSC, и также из-за неэффективного использования донорской матрицы HSC, что может ограничивать перенос в клинику редактирования генов при болезнях, требующих высоких количеств генно-модифицированных HSPCs, таких как лизосомные болезни накопления. Химическая модификация однонитевой направляющей гид РНК и инновации в системах доставки нуклеаз, таких как предварительно собранные рибонуклеопротеины CRISPR-Cas9, и использование донорских матриц на основе аденоассоциированного вируса типа 6 (AAV6) увеличили частоту редактируемых HSC с многообещающими результатами для будущего успешного развития и клинического применения39,44,45-47. Совсем недавно стратегии по форсированию прогрессирования клеточного цикла и усилению экспрессии клеточных компонентов аппарата HDR привели к успешному увеличению генной коррекции до 50% in vivo вновь заселяемых HSCs46.
Доказательство принципа редактирования генов HSPC было получено в доклинических исследованиях39,45,48,49, что привело к двум продолжающимся спонсируемым отраслью клиническим испытаниям с использованием нуклеазы цинковые пальчики и технологий CRISPR-Cas9, вызывающих нокаут BCL11A для решения проблемы зависимой от переливания крови β-талассемия и серповидно-клеточной анемии (SCD) соответственно (Таблица 1). BCL11A кодирует белок, подавляющий экспрессию гемоглобина плода (HbF). Первоначальные результаты у пациента с трансфузионно-зависимой β-талассемией и пациента с SCD показали хорошую эффективность редактирования HSPC с использованием CRISPR-Cas9 для разрушения BCL11A, повышение уровней HbF и общего гемоглобина с течением времени у обоих пациентов, что указывает на успешное приживление отредактированных клеток50. SCD - идеальная модель для подходов к редактированию генов с помощью HDR, поскольку это вызвано мутацией одного нуклеотида в одном гене. Исследования с использованием CRISPR-Cas9 для коррекции мутации SCD, которая присутствует в HBB, гене, кодирующем β-глобин, показали, что HDR-опосредованная коррекция в изолированных CD34 + клетках была эффективной in vivo, но частота исправленных клеток снизилась после ксенотрансплантации до менее чем 10%, что указывает на дифференциальное целенаправленное воздействие на HPCs по сравнению с заселением вновь HSCs, что может ограничить клиническое применение этого подхода45,51. В дальнейших стратегиях лечения SCD использовали NHEJ для подавления экспрессии BCL-11A. Нарушение либо эритроид-специфического энхансера в гене BCL11A52, либо сайтов связывания BCL-11A в промоторах γ-глобиновых генов HGB1 и HBG2 (ссылки 53,54) приводило к повышению уровней HbF in vitro. Мыши с иммунодефицитом, которым вводили CD34 + клетки, скорректированные с помощью CRISPR-Cas9, показали высокую частоту отредактированных HSC и подавление экспрессии BCL11A, а эритроидные клетки, полученные из отредактированных прижившихся клеток, показали коррекцию фенотипа SCD in vitro44. Также был исследован альтернативный подход целенаправленного воздействия на SCD, который имитирует состояние наследственной персистенции HbF за счет использования эффекторных нуклеаз, подобных активатору транскрипции, и CRISPR-Cas9 для введения делеций в локус гена β-глобина, которые мешают регуляции активности гена55-58. Показательное исследование с использованием этой стратегии продемонстрировало повышенную экспрессию HbF и коррекцию серповидности в эритроидных клетках, дифференцированных из клеток CD34 + пациента, а также сохранение исправленных клеток после трансплантации иммуно-дефицитным мышам58. Сводка подходов к редактированию генов для коррекции гемоглобинопатий приведена на рисунке 5.



Fig. 5: Gene editing techniques for HSPC gene therapy.

Molecular tools for gene editing include zinc-finger nucleases, transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and CRISPR-Cas9, which introduce targeted DNA double-strand breaks (DSBs) into the genome. The cell repairs the DNA breaks by non-homologous end joining (NHEJ), potentially introducing small insertions and deletions, or by homology-directed repair (HDR) if a suitable donor template is provided. Examples of gene editing approaches for the treatment of haemoglobinopathies are shown. HDR-driven strategies include correction of SNPs in the HBB gene locus to reverse red blood cell (RBC) sickling in sickle cell disease (SCD) and the targeted addition of HBB to treat either SCD or ?-thalassaemia. NHEJ-driving strategies include the generation of mutations in the ?-globin locus that mimic hereditary persistence of fetal haemoglobin (HPFH) and inhibition of the expression of BCL11A, the main repressor of fetal HBG1 and HBG2 genes, both resulting in the expression of fetal haemoglobin (HbF) and amelioration of the disease phenotype. chr, chromosome; HSPC, haematopoietic stem and progenitor cell; LCR, long coding region; Prom, promoter; WT, wild type. Elements of this figure are adapted with permission from ref.186, Elsevier.

Технологии редактирования генов действительно несут потенциальные риски, связанные с эффектами действия вне мишеней и с перестройками ДНК, такими как хромосомные транслокации и большие делеции59, которые трудно предсказать на доклинических моделях. В случае реактивации HbF отсутствие маркера может затруднить определение происхождения повышения уровня HbF, поскольку повышенный уровень HbF обычно наблюдается как следствие процедуры трансплантации в целом, особенно у пациентов с SCD или β- талассемия 60,61. Дальнейшие достижения в области редактирования генов, такие как редактирование оснований и prime редактирование62-64, при которых используется каталитически нарушенный CRISPR-Cas9, обладающий активностью никазы, но не вызывающий двухцепочечных разрывов в сочетании с дезаминазой и обратной транскриптазой, соответственно, - обещают эффективное и, возможно, более безопасное преобразование генома, хотя большинство результатов было получено на клеточных линиях, а не на первичных клетках человека.

Cell culture and transduction


Как в подходах по переносу генов, опосредованному векторами, так и по редактированию генов, культивирование in vitro и манипуляции с HSPC могут вызывать транскрипционные ответы и сигнальные события, которые могут влиять как на примитивные, так и постепенно на более детерминированные популяции клеток65,66 и снижать частоту ген-скорректированных длительно живущих и восполняемых вновь HSPC. По этой причине высокие дозы трансплантируемых HSPCs желательны, как для быстрого восстановления кроветворения после кондиционирования, так и для стабильного клинического исхода. Вирусом обусловленная трансдукция примитивных HSC требует предварительной стимуляции клеток активирующими цитокинами, такими как фактор стволовых клеток (SCF), FMS-подобный лиганд тирозинкиназа 3 (FLT3L) и тромбопоэтин (THPO), а также использование высоких концентраций вектора, способного к высокой инфекционной активности при культивировании ex vivo. Оптимизация условий культивирования клеток, таких как продолжительность культивирования и выбор или концентрация цитокинов и усилителей трансдукции, может обеспечить наивысшую эффективность трансдукции или редактирование гена с минимальной потерей исходной примитивной функции HSC. В самом деле, время культивирования (обычно от 24 до 48 часов) отрицательно коррелирует с поддержанием способности к репопуляции (повторному заселению), поскольку стимуляция цитокинов способствует увеличению количества детерминированных HPC за счет репопуляции HSC28,67. Надежных тестов для определения эффективности трансдукции для долгоживущих вновь заселяемых HSC - одного из ключевых факторов для прогнозирования благоприятного исхода - все еще нет.
Спецификации эффективности лекарственного препарата для генной терапии в настоящее время основываются на суррогатных параметрах для измерения эффективности. Эти параметры включают среднее количество копий вектора на геном, обнаруженное в HSPC через несколько дней после воздействия вектора, долю успешно трансдуцированных клоногенных предшественников, уровни экспрессии трансгена и откорректированную функцию. В настоящее время нет доступных маркеров для оценки восполнения популяции HSC после культивирования in vitro; поэтому многочисленные клинические испытания показали более низкий уровень генетической модификации в привитых клетках, чем в клетках, испытанных in vitro24-26,68. Однако это не относится к клиническим испытаниям, изучающим иммунодефицит13,14,22 и анемию Фанкони27, в которых исправленные клетки обладают пролиферативным преимуществом. Эффективность трансдукции может быть ограниченной и варьировать среди людей, вероятно, из-за различий в состоянии покоя изолированной популяции HSPC и экспрессии антивирусных ограничивающих факторов с помощью HSPCs69, которые действуют на разных стадиях пути трансдукции7,70. Недавние достижения в использовании усилителей трансдукции ex vivo могут повысить эффективность трансдукции; например, такие соединения, как полоксамеры71,72, рапамицин73, циклоспорин A, циклоспорин H70 и простагландин E2 (ссылки 28,74), могут усиливать целенаправленное воздействие векторов на HSPC, усиливая прикрепление или проникновение векторных частиц или воздействуя на фазы после внедрения, позволяя осуществлять более высокий уровень интеграции. Однако, необходимы долгосрочные клинические испытания, чтобы оценить эффективность этих препаратов для повышения эффективности приживления HSPC.

Patient conditioning


Режимы кондиционирования с использованием химиотерапевтических или иммунодепрессантов направлены на истощение эндогенной популяции HSPC пациента, чтобы очистить нишу для приживления откорректированных клеток при одновременном снижении токсичности. Кондиционирование может варьировать от пониженной интенсивности до миелоаблативного кондиционирования в зависимости от заболевания, необходимого уровня экспрессии трансгена и уровня приживления, необходимого для достижения терапевтического порога75.
При аутологичной генной терапии HSPC кондиционирование с пониженной интенсивностью позволяет создать устойчивый смешанный химеризм неоткорректированных и откорректированных клеток, что возможно благодаря отсутствию отторжения и эффектов "трансплантат против хозяина". Этот химеризм является предпочтительным, когда исправленные клетки наделены преимуществом в пролиферации in vivo; например, в случае лимфоидных клеток при иммунодефицитах13,14,22 и откорректированных HSPC при анемии Фанкони76. Однако стратегии кондиционирования с пониженной интенсивностью обычно недостаточны при таких заболеваниях, как лизосомные нарушения накопления или гемоглобинопатии24,25,68,77, которые требуют высокой степени приживления. Например, миелоаблативное кондиционирование (устранение миелоидного клона) может потребоваться для генотерапии HSC при β-талассемии, чтобы обеспечить достаточное пространство в костном мозге и обеспечить приживление адекватного количества ген-преобразованных HSC для дифференцировки в откорректированные эритроциты. При нейро-метаболических расстройствах предпочтительны схемы кондиционирования на основе алкилирующих агентов из-за их способности преодолевать гематоэнцефалический барьер, истощать резидентную микроглию и способствовать локальной миграции откорректированных клеток78. Токсичность, связанную с кондиционированием, можно уменьшить с помощью фармакокинетических методов; например, токсичность алкилирующего агента бусульфана в настоящее время снижается путем серийных оценок концентраций, чтобы определить площади под кривой75 с последующей корректировкой дозы.
Бесплодие является основным осложнением миелоаблативной химиотерапии, который можно устранить путем криоконсервации гонад у детей79. Направленные и не генотоксические методы миелоабляции в качестве альтернативы традиционной химиотерапии недавно были разработаны на основе антител, распознающих поверхностные маркеры HSC. Исследования на мышах и приматах, кроме человека, продемонстрировали эффективность анти-CD117 (CD117 также известен как KIT) и анти-CD45 в отношении истощения резидентных HSC80,81. Недавно проведенное клиническое исследование фазы I по оценке безопасности и переносимости аллогенной трансплантации у пациентов с SCID, получавших анти-CD117, показало многообещающие первоначальные результаты с успешным приживлением донорских клеток82. Если будет доказано, что эти терапевтические антитела безопасны и эффективны, их можно будет использовать при состояниях, при которых риск химиотерапии считается слишком высоким или когда ранее существовавший воспалительный статус костного мозга дополнительно усугубляется действием обычных режимов кондиционирования.
Микроокружение костного мозга играет ключевую роль в облегчении приживления и размножения генетически исправленных клеток. Недавние исследования показали, что дефектная среда костного мозга при β-талассемии была связана с нарушением функции HSC, что могло негативно повлиять на приживление трансплантата83,84. Возраст пациента также может влиять на состояние костного мозга и качество HSPC; недавнее исследование показало, что более молодой возраст связан с лучшими результатами после генотерапии с помощью HSPC для зависимой от переливания крови β-талассемии25.

Приживление модифицированных HSPC


Трансдуцированные вектором гемопоэтические клетки могут быть обнаружены в крови с помощью количественной ПЦР уже через 1 неделю после введения. Сначала выявляются откорректированные гранулоциты и моноциты, за ними следуют В-клетки, естественные клетки-киллеры и, наконец, Т-клетки, которые сначала должны достичь созревания в тимусе13,85. У большинства пациентов, получавших лентивирусную генотерапию с помощью HSPC, наблюдается стабильное долгосрочное приживление трансдуцированных клеток и восстановление поликлонального гематопоэза в течение 8 лет после лечения8,22, а у пациентов с ADA-SCID, получавших гамма-ретровирусные векторы, приживление сохраняется в течение 15 лет после лечения86. В обоих случаях приживление приводит к устойчивой экспрессии трансгена, управляемой интегрированным вектором, по оценке иммунологического и/или биохимического мониторинга. Сообщалось о коррекции фенотипа заболевания у большинства пролеченных пациентов, степень которой обычно коррелирует с уровнями приживления трансплантата, и экспрессией трансгена in vivo. Степень коррекции постоянно замещающих HSPC варьировала в разных испытаниях и составляла от 0,1% до 80% ген-модифицированных HSPC7. Самые высокие и наиболее последовательные уровни приживления для различных клонов наблюдались в исследованиях с использованием HSPC, откорректированных с помощью лентивирусных векторов и стратегии миелоаблативного кондиционирования пациента77. Неудачи приживлении были связаны с недостаточными дозами HSPC или недостаточной эффективностью трансдукции, отсутствием кондиционирования пациента или наличием сопутствующих заболеваний, таких как основные инфекции75,87-90.
Ниша костного мозга человека включает несколько типов не гематопоэтических клеток, включая мезенхимные стромальные клетки (MSCs), остеобласты, адипоциты, эндотелиальные клетки и нервные клетки, которые обеспечивают физическую поддержку и секрецию растворимых факторов для HSPC и регулируют их гомеостаз91. MSCs локализованы в эндоосте (внутренней оболочке костного мозга) и вокруг синусоидальных сосудов92 и могут быть классифицированы на функционально отдельные субпопуляции, идентифицированные на основе экспрессии CD146 (также известного как MCAM), CD271 (также известного как NGFR), STRO-1 и стадио-специфического эмбрионального антигена 4 (ссылки 93,94). Гуманизированные модели ниш являются мощным инструментом для анализа поддерживающей гематопоэтической функции отдельных субпопуляций MSCs in vivo в микросреде, которая имитирует человеческий костный мозг95,96. MSCs использовались в клинических условиях для увеличения ex vivo HSPCs97, а недавнее пилотное исследование описало введение MSCs для облегчения приживления HSPC97,98. Эти исследования предполагают, что MSCs могут использоваться в контексте геннотерапии HSPC.

Vector integration and clonal tracking


Вирусные векторы сохраняют способность к полу-случайной интеграции в геном клетки, причем некоторые области предпочтительнее других в зависимости от класса используемого ретровирусного вектора. Лентивирусные векторы предпочтительно встраиваются в тела активно транскрибируемых генов, тогда как гамма-ретровирусные векторы предпочтительно интегрируются близко к сайтам начала транскрипции и активным регуляторным элементам, в частности 99-104. Полу-случайная интеграция вектора может потенциально вызывать изменения в структуре или экспрессии гена, которые могут обеспечивать преимущество для избирательного клонального роста или приводить к неконтролируемой пролиферации105. Первые исследования интеграции векторов у пациентов с ADA-SCID, получавших гамма-ретровирусные векторы, показали наличие сайтов инсерции, общих для нескольких гематопоэтических клонов, что указывает на bona fide прижившиеся, трансдуцированные HSPC102,106,107, хотя в то время, когда эти исследования проводились, эффективность детекции сайтов инсерции была низкой, и большинство клонов происходило из лимфоидных линий с селективным преимуществом106,107. Исследования на пациентах с иммунодефицитом показали, что гены, участвующие в развитии рака, часто являются сайтами встраивания гамма-ретровирусных векторов; это может быть результатом предпочтительного целенаправленного воздействия на эти сайты интеграции во время трансдукции102 и/или потому, что клетки с этими интеграциями наблюдаются с более высокой частотой из-за клональной экспансии этих клеток после введения108,109. Опосредованная линейной амплификацией ПЦР и другие методы, позволяющие избежать рестрикционных ферментов105, в сочетании с секвенированием следующего поколения последовательностей соединения ДНК вируса и хозяина с тех пор регулярно используются в клинических испытаниях для мониторинга профилей сайтов инсерции и клональных колебаний в приживляемой популяции110,111 .
Олигоклональность и обогащение вставками рядом с прото-онкогенами наблюдались у пациентов, получавших гамма-ретровирусные векторы. Анализ сайтов вставки выявил присутствие сайтов интеграции рядом с прото-онкогенами, такими как LMO2, в лейкемических клонах, которые обнаруживались в исследованиях SCID-X1, синдрома Вискотта-Олдрича и CGD15,108,112. Однако непрерывное профилирование вставок не позволило выявить начало лейкемии у пациентов, у которых развилось заболевание после генотерапии HSPC, до тех пор, пока клинические симптомы не стали очевидными111. Таким образом, клиническое применение анализа места введения в настоящее время ограничивается исследованиями и анализом патологических клинических данных, а не мониторингом в реальном времени.
Поликлональный паттерн интеграции вектора наблюдался у большинства пациентов в течение длительного периода наблюдения со сбалансированным соотношением различных клонов. До сих пор в испытаниях лентивирусных векторов не было обнаружено доминантных клонов, готовых для вставки вектора в онкогены, за исключением одного пациента при исследовании β-талассемии113. У пациента был обнаружен доминантный клон, несущий интеграцию в гене HMGA2, это привело к нарушению регуляции экспрессии HMGA2, что не было связано с побочными эффектами. Таким образом, прогнозируется низкий риск генотоксичности для лентивирусных вставок с использованием безопасного каркаса вектора и адекватной дозы HSC (68,99,114). Риск дополнительно будет снижен за счет мониторинга безопасности у пациентов, получающих HSPC, модифицированные лентивирусами, в течение как минимум 15 лет115.
Данные секвенирования, полученные как часть анализа сайтов интеграции, могут быть использованы для установления взаимосвязей между гематопоэтическими клонами человека во время различных фаз восстановления гематопоэза, а также для оценки количества долгоживущих HSCs, которые участвуют в продукции гематопоэтических клеток после приживления116,117. Было подсчитано, что у пациентов, получавших генотерапию с помощью HSPC, примерно от 1/105 до 1/106 массива введенных клеток HSPC вносит вклад в долговременный гематопоэз68,114. Недавние исследования по мониторингу кинетики продукции клеток крови из отдельных HSPC подтвердили, что разные подтипы по-разному влияют на раннюю и позднюю фазы приживления после трансплантации . В частности, эти исследования показали, что мультипотентные предшественники активируются вскоре после трансплантации и доминируют в первоначальной возникающей гематопоэтической популяции, тогда как долгосрочная репопуляция HSPCs становится преобладающей через 1-2 года после трансплантации, как только гематопоэз достигает устойчивого состояния116,118. Однако следует отметить, что эти исследования основаны на данных, полученных в результате испытаний генотерапии для PIDs, и могут характеризоваться смещением в сторону восстановления лимфоидного компартмента. В случаях, когда редактирование генов использует для генотерапии HSPC, то изучение безопасности и динамики исправленной популяции клеток может оказаться сложной задачей из-за отсутствия отличительного элемента, идентифицирующего каждый клон, особенно при выполнении HDR с высокой точностью. Исследования образования клонов могут быть полезны в случае редактирования NHEJ, поскольку разрывы ДНК вызывают вставки и делеции (indels) разной длины, которые можно анализировать с помощью методов секвенирования следующего поколения.

Applications for HSPC gene therapy


Primary immunodeficiencies


PIDs - это гетерогенная группа редких наследственных заболеваний, которые приводят к недоразвитой и/или функционально ослабленной иммунной системе119. Пациенты с тяжелыми PIDs, такими как формы SCID, комбинированный иммунодефицит или тяжелые миелоидно-клеточные расстройства, испытывают повышенную заболеваемость и смертность и демонстрируют различные клинические проявления120. HSCT с использованием HSPC от HLA-совместимого донора может обеспечить "излечение" на всю жизнь с вероятностью успеха более 90%121-123; однако ограниченная доступность HLA-подходящих доноров, особенно в определенных группах населения и в не Западных регионах, приводит к необходимости использовать не подходящих доноров, что увеличивает связанный с лечением риск из-за болезни трансплантат против хозяина, токсичности и инфекций, эти риски зависят от возраста, сопутствующих заболеваний и генотипа123. PIDs, менее тяжелые, чем SCID и комбинированный иммунодефицит, все же могут оказывать большое влияние на качество жизни, а HSCT может быть особенно полезной при состояниях, требующих пожизненного лечения лекарствами и поддерживающей терапии, которые при многих иммунодефицитах эффективны лишь частично. Такие методы лечения также могут быть ограничены их доступностью и стоимостью, особенно в случае замещения иммуноглобулинов при синдромах дефицита антител или заместительной терапии рекомбинантных ферментов.

X-linked severe combined immunodeficiency


SCIDs характеризуются истощением или функциональной недостаточностью Т-лимфоцитов и часто связаны с дефицитом В-лимфоцитов и/или натуральных клеток-киллеров120. В результате эти состояния связаны с высокой смертностью в раннем возрасте из-за тяжелой инфекции. Успех HSCT генотерапии в лечении многих из этих состояний, вероятно, связан как с преимуществом роста и выживаемости для ген-откорректированных клеток, так и с неспособностью пациентов с SCID отторгать аллогенные трансплантаты. Благодаря этим факторам успешное приживление трансплантата лимфоцитов может происходить без необходимости кондиционирования, снижающего деления клеток124. Способность пациентов с PID приспосабливаться к донорским лимфоцитам, преимущественно Т-клеткам, неудивительна, учитывая, что пациенты с PID могут приобретать соматический мозаицизм и более мягкий или "атипичный" фенотип в результате спонтанных генетических реверсий и мутаций в др. сайте125.
SCID-X1 вызывается дефицитом общей субъединицы-γ цитокинового рецептора (также известной как IL-2RG) - критического компонента рецепторов множества цитокинов, включая рецепторы IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 и IL-21, что приводит к отсутствию Т-клеток и клеток натуральных киллеров и к сохранению функционально дефицитных В-клеток126. Ранние испытания, проведенные с использованием обычных гамма-ретровирусных векторов с интактными LTR, продемонстрировали быстрое восстановление Т-клеточного иммунитета в результате ген-откорректированного HSPC-опосредованного инициирования тимопоэза у 17 из 20 пролеченных пациентов34,87 (рис. 2). Гуморальный иммунитет был восстановлен лишь частично, так как отсутствие циторедуктивного кондиционирования и устойчивое приживление HSC в этих исследованиях означало, что линии резидентных B-лимфоцитов остались неисправленными. Несколько удивительно, что активный тимопоэз, по-видимому, сохранялся в течение многих лет после лечения126,127, что свидетельствует о прочном приживлении в тимусе очень долгоживущего лимфоидного или Т-клеточного предшественника даже в отсутствие скорректированных долгоживущих постоянно заселяемых HSPC. Однако эти многообещающие клинические данные были омрачены развитием Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза у более чем 25% пациентов в результате инсерционного мутагенеза15,112. Комбинация полу-случайных интеграций векторных геномов и мощных энхансерных последовательностей в провирусном LTR вызывала дисрегулируемую экспрессию известных прото-онкогенов, включая LMO2, который с тех пор был признан основным фактором лейкемогенеза128. Это в сочетании с дополнительными клональными генетическими изменениями - вероятно, происходящими стохастически или связанными с пролиферативным стрессом - спровоцировало клинически проявляющуюся лейкемию15. Возникновение подобных заболеваний в других испытаниях, не связанных с SCID-X1 (ссылка 108) с использованием гамма-ретровирусных векторов, указывало на то, что технология переноса генов специфически вызывала лейкемию. Для решения этих проблем в ряде клинических испытаний SCID-X1 использовались альтернативные векторные платформы, основанные на гамма-ретровирусах с удаленным энхансером LTR34, а в последнее время - основанные на лентивирусах129, с устойчивым восстановлением иммунитета и клиническим улучшением и отсутствием доказательств нарушений предопределения клонов или возникновения лейкемий в течение более 6 лет наблюдения.
В последнее время использование низкоинтенсивного циторедуктивного кондиционирования способствовало успешному долгосрочному приживлению ген-скорректированных HSC и функциональному восстановлению лимфопоэза B-клеток, а также тимопоэза у пациентов с SCID-X1 (ссылка 130). Пожилые пациенты (подростки и молодые люди) также получили пользу от генотерапии с, по крайней мере, частичным восстановлением Т-клеток после неудачных аллогенных процедур, даже несмотря на то, что тимопоэз находился в состоянии покоя в течение многих лет129. Это наблюдение предполагает, что даже на поздних стадиях тимопоэз сохраняет программу своего развития до тех пор, пока имеется запас ген-откорректированных предшественников Т-клеток.

ADA deficiency SCID


ADA-SCID - это аутосомно-рецессивное метаболическое заболевание, вызванное мутациями в гене, кодирующем ADA, которые приводят к накоплению токсичных метаболитов, таких как дезоксиаденозин, которые препятствуют развитию лимфоидного клона. Заместительная ферментная терапия посредством еженедельного введения pegylated телячего или рекомбинантного ADA может улучшить накопление этих метаболитов в крови и позволяет переменное восстановление лимфопоэза, хотя и с высокими финансовыми затратами8. Ранние попытки генотерапии, нацеленной на остаточные зрелые Т-лимфоциты, принесли минимальную клиническую пользу, поскольку пациенты поддерживались за счет заместительной ферментной терапии9,10. Однако, использование HSC и введение режима низкоинтенсивного кондиционирования для облегчения их приживления и восстановления многих клонов привело к замечательным клиническим результатам14,88,131,132 (рис. 2). Strimvelis, генотерапия, основанная на введении генов ADA в HSC с использованием гамма-ретровирусного вектора, была первой генной терапией ex vivo, получившей лицензию в 2016 году (ссылка 133). Несмотря на присутствие интактной последовательности энхансера LTR гамма-ретровируса и свидетельства о том, что нарушения клонального предопределения не происходят на молекулярном уровне после лечения134, до сих пор не сообщалось о клинических проявлениях мутагенеза86, 131, 135. [Примечание: после принятия этой рукописи у одного пациента было зарегистрировано событие лимфоидного Т-клеточного лейкоза, и его связь с генотерапией в настоящее время исследуется (см. Ссылки по теме)]. Потенциально лейкемический клон может быть отобран из-за высокой потребности продуктов пуринового метаболизма, которые могут присутствовать на низких уровнях у пациентов с дефицитом ADA136. Вследствие метаболической природы трансгена и ADA, который экспрессируются повсеместно, микроокружение ADA-дефектного костного мозга-тимуса может ограничивать гематопоэтические или тимопоэтические клетки, защищая их от пролиферативного стресса за счет частичного нарушения деления и дифференцировки клеток; однако этот процесс до конца не изучен. Следует отметить, что у пациентов, получающих только заместительную ферментную терапию, также может развиться пролиферация лимфатического клона137.

FOther PIDs


Многие другие PIDs, которые в настоящее время поддаются лечению с использованием аллогенных HSCT, являются жизнеспособными мишенями для подхода аутологичной генотерапии. Синдром Вискотта-Олдрича представляет собой сложную, многоклональную PID, вызванную мутациями в гене WAS, которые приводят к дисфункции цитоскелета гемопоэтических клеток и дополнительно осложняются тромбоцитопенией138. Использование обычного гамма-ретровирусного вектора для лечения этого состояния дало клинический положительный результат, но с неприемлемой степенью лейкемической токсичности108,136; однако лентивирусная платформа, включающая проксимальный сегмент промотора гена WAS, недавно продемонстрировала устойчивую иммунологическую коррекцию и отсутствие тенденции к кровотечениям у более чем 30 детей и взрослых, серьезно страдающих синдромом Вискотта-Олдрича без нарушений детерминации клонов22,89,114,139. Попытки гамма-ретровирусной коррекции CGD - группы состояний, характеризующихся дефицитом системы NADPH-оксидазы - были ограничены недостаточной эффективностью из-за низкого приживления, мутагенеза и подавления трансгена в результате метилирования промотора LTR109. Гематопоэтический пролиферативный стресс и снижение активности по репопуляции HSCs наблюдались на мышах, моделирующих CGD, подтверждая, что хроническое воспаление, наблюдаемое у пациентов с CGD, может отрицательно влиять на исход генотерапии, если воспаление не контролируется надлежащим образом140.
Недавние разработки в лечении CGD успешно восстановили биохимические и иммунологические функции в долгосрочной перспективе у пациентов с тяжелой CGD, что позволило отказаться от обычных лекарств90. Эти разработки включают уточнение режима миелоаблативного кондиционирования - что необходимо, поскольку миелоидные клетки, которые являются преобладающим типом клеток, пораженных CGD, требуют непрерывного возобновления к жизни из HSCs - а использование лентивирусного вектора, включающего регуляторный элемент, предназначенный для предотвращения мутагенеза в HSPCs, и опосредует более физиологические паттерны экспрессии трансгена. Этот регуляторный элемент также используется в клинических исследованиях недостаточности адгезии лейкоцитов I типа, основной целью которых является коррекция миелоидной линии. Совсем недавно платформы лентивирусных векторов были разработаны для лечения других форм SCID, в том числе вызванных дефицитом DCLRE1C141 (таблица 1) и RAG1 и RAG2 (ссылки 8,142).

Erythrocyte disorders


Генетические заболевания, которые влияют на эритроциты и поддаются генотерапии с помощью HSPC, включают β-талассемию, SCD и дефицит пируваткиназы. При SCD и β-талассемии, которые вызваны мутациями в HBB, генотерапия является особенно сложной задачей, поскольку включение крупномасштабных геномных последовательностей HBB и элементов области контроля локуса является ограничивающим фактором при разработке и производстве векторов с высоким титром143. С точки зрения безопасности использование регуляторных последовательностей, специфичных для эритроидов, снижает генотоксический риск трансактивации генов предшественников эритроидных клонов, детерминированных к энуклеации и имеющих ограниченный период полураспада.

β-Thalassaemia


При β-талассемии мутации в HBB - гене, кодирующем β-глобиновую цепь гемоглобина - приводят к дисбалансу между α-глобиновыми и β-глобиновыми цепочками, который токсичен для предшественников эритроидов. Большая β-талассемия представляет собой особенно тяжелую форму β-талассемии, связанную с хронической и тяжелой анемией, вызванной гомозиготными инактивирующими мутациями HBB (обозначенными как βo /β o), и в настоящее время требует пожизненных ежемесячных переливаний крови и терапии хелатированием железа. Аллогенная HSCT использовалась для лечения β-талассемии, но доступна только небольшой части пациентов, у которых есть совместимый донор144.
HSPC генотерапия с использованием эритроид-специфичных глобин-экспрессирующих лентивирусных векторов была первой стратегией, направленной на β-талассемию, которая была успешно применена при клинических испытаних в 2006 г. (Таблица 1). О безопасности и эффективности лентивирусного вектора BB305, который кодирует трансген β-глобина (β-T87Q-глобин) с действием против серповидно-клеточности, сообщалось в исследованиях фазы I и фазы II у пациентов с различной степенью тяжести β-талассемии24. Клинический результат зависел от генотипа: 80% пациентов с генотипами, отличными от β0/β0, и 38% пациентов с генотипами β0/β0 достигали трансфузионной независимости в течение 2-летнего периода наблюдения. У остальных пациентов наблюдались различные уровни снижения использования переливания крови. На основе этих результатов в 2019 году EMA выдало Zynteglo условное маркетинговое разрешение на использование у пациентов с трансфузионно-зависимой β-талассемией с генотипами, отличными от β0 / β 0145. Оптимизация протокола трансдукции привела к началу двух клинических испытаний фазы III, которые в настоящее время продолжаются (таблица 1, NCT02906202 и NCT03207009). В клиническом испытании TIGET-BTHAL (таблица 1, NCT02453477) девять пациентов с генотипами β0/β 0, включая шесть несовершеннолетних, лечились внутрикостным введением HSPC, трансдуцированных лентивирусным вектором GLOBE. В течение 1 года наблюдения основные конечные точки по сокращению количества переливаний и безопасности были достигнуты у всех пациентов, при этом у четырех пациентов была достигнута независимость от гемотрансфузий. Пациенты, у которых наблюдалась клиническая польза, показали устойчивое и стабильное приживление генетически модифицированных клеток всех линий, включая эритроидные клетки костного мозга25. Обновленные результаты показали лучший результат у несовершеннолетних, чем у взрослых пациентов146. Исследования микросреды костного мозга при β-талассемии и ее потенциального влияния на функцию HSPC83,84 предполагают, что микросреда костного мозга может влиять на клинический результат; например, нарушение стромальных клеток в нише, вызванное связанными с заболеванием вторичными эффектами, такими как неэффективный эритропоэз, перегрузка железом или дефекты костей, было зарегистрировано у пациентов83 и у талассемических мышей с нарушенной функцией HSPC, вызванной измененными перекрестными помехами между нишами и HSPC84.

Sickle cell disease


Микросреда костного мозга является ключевым фактором качества HSC при SCD, что связано с хронической воспалительной средой, аномальной сосудистой сетью костного мозга и стрессовым эритропоэзом147,148. SCD вызывается мутацией одного нуклеотида в HBB, приводящей к образованию токсичного варианта гемоглобина HbS, полимеризующиеся в длинные волокна, которые деформируют эритроциты в серповидную форму. Стратегии генной терапии для SCD используют трансгены, кодирующие фетальный γ -Глобин или β -Глобины с активностью, против серповидно-клеточности, такие как βT87Q или βAS3, реактивируют продукцию HbF путем воспроизведения мутаций, вызывающих наследственное сохранение фетального гемоглобина (HPFH), или подавляют биологическое действие BCL. -11A, главного репрессора γ -глобиновых генов149,150.
В первой стратегии генотерапии HSPC для лечения пациента с SCD, использовался лентивирусный вектор BB305 и HSPC, полученные из костного мозга, для доставки трансгена, кодирующего противодействующий серповидно-клеточности β-глобин. Этот подход позволил достичь терапевтического уровня белка в эритроцитах, соответствующего 50% β-подобных цепей глобина, с успешной коррекцией клинических симптомов151. Аналогичные результаты были получены у одного из двух других пролеченных пациентов. Однако неудовлетворительные результаты были получены у семи первоначальных пациентов, пролеченных в другом исследовании151. Использование HSPC, мобилизованных с Plerixafor, вместо HSPC, происходящих из костного мозга, и повышение уровня трансдукции с помощью протокола, оптимизированного для культивирования152, с тех пор улучшило клинический результат, причем недавние результаты показали устойчивую экспрессию трансгенного β-глобина и снижение проявлений SCD153. В настоящее время продолжаются еще два клинических испытания на основе лентивирусных векторов фазы I и фазы II при SCD; в одном испытании пациентов подвергали кондиционированию с пониженной интенсивностью и трансплантации с HSC, экспрессирующими ген -глобина154, тогда как в другом использовали лентивирусный вектор, содержащий трансген β-глобина, несущий три мутации против кожного покрова (βAS3). Ранние результаты показали, что лечение безопасно и показывает некоторую пользу, хотя для оценки эффективности потребуется долгосрочное наблюдение. Наконец, другой подход использовал опосредованную лентивирусным вектором ограниченную эритроидом экспрессию небольшой шпилечной РНК, нацеленной на BCL11A, чтобы уменьшить репрессивное действие BCL-11A на гены HBG и, следовательно, повысить уровень HbF155. В 2018 году началось клиническое испытание фазы I с использованием этой технологии для пациентов с SCD (таблица 1), с многообещающими первоначальными результатами, показывающими реактивацию HbF156. Для подтверждения происхождения повышенного уровня HbF и улучшения клинических симптомов потребуется долгосрочное наблюдение.

Pyruvate kinase deficiency


Дефицит пируваткиназы вызван мутацией PKLR и связан с гемолитической анемией. Пациентам с тяжелой недостаточностью пируваткиназы часто требуется переливание крови и лечение хелаторами железа. Опосредованная лентивирусами генная терапия HSPC, переносящая кДНК PKLR, предоставила доказательство эффективности и безопасности на модели заболевания мышей157, и недавно было одобрено клиническое испытание фазы I / II.

Bone marrow failure syndromes


Анемия Фанкони - это врожденное аутосомно-рецессивное нарушение восстановления ДНК, связанное с аномалиями развития, недостаточностью костного мозга и предрасположенностью к раку. Ряд генов, участвующих в репликации и репарации ДНК, вовлечен в анемию Фанкони, включая FANCA и FANCB. В недавнем клиническом исследовании пациенты с анемией Фанкони, вызванной мутациями FANCA, получали опосредованную лентивирусами генотерапию HSPC с целью переноса интактной копии гена FANCA27. Пациенты не подвергались кондиционированию, чтобы избежать токсичности лекарств. Исследование показало постепенное увеличение количества скорректированных CD34 + клеток костного мозга с долей исправленных клеток в диапазоне от 7% до 43% через 18-30 месяцев наблюдения. Генотерапия, опосредованная лентивирусным вектором, придает селективное пролиферативное преимущество трансдуцированным HSC и откорректированным клеткам крови за счет индукции устойчивости к агентам, сшивающим ДНК, по оценке in vitro. Как и ожидалось, пациенты с самыми низкими уровнями маркировки в анализе сайтов интеграции имели наиболее ограниченное количество возобновляемых клонов, колеблющееся во времени, и ни один из леченных пациентов пока не проявлял признаков генотоксичности. Этот подход смог остановить прогрессирование недостаточности костного мозга у пациентов с самым высоким уровнем клеток с исправленным геном. Недавно доклинические исследования с использованием NHEJ, управляемого CRISPR-Cas9, для создания компенсаторных мутаций, восстанавливающих рамку считывания в HSPC у пациентов с анемией Фанкони, показали заметное пролиферативное преимущество отредактированных HPSC in vitro и у мышей, которым была проведена ксенотрансплантация, с эффективной коррекцией проявлений анемии Фанкони158.

HSPCs as delivery vehicles


Inherited neurometabolic disorders


Мутации в генах, кодирующих лизосомные или пероксисомные ферменты, могут вызывать накопление токсичных субстратов во многих органах, включая ЦНС; накопление токсичных субстратов в ЦНС, в частности, может привести к серьезным неврологическим повреждениям159. Системное введение заместительной ферментной терапии разрешено при некоторых метаболических нарушениях, но ее применение при неврологических расстройствах затруднено из-за неспособности белков преодолевать гематоэнцефалический барьер. Более того, деформации скелета, связанные с лизосомными болезнями накопления, по-прежнему трудно лечить с помощью заместительной ферментной терапии из-за недостаточного биораспределения ферментов при заместительной терапии в хрящах и костях159. Эти проблемы могут быть решены с помощью генотерапии HSPC, поскольку HSPC и клетки крови миелоидного клона способны проникать в ЦНС и заменять резидентные популяции тканевых макрофагов и микроглия-подобных клеток160,161. Действительно, мышиные модели с использованием трансплантации с химиотерапевтическим удалением резидентных миелоидных клеток в головном мозге, показали эффективную замену этих клеточных популяций HSPC, происходящими от донора78, а повреждение микроглии было вовлечено в патогенез как пероксисомных, так и лизосомных болезней накопления162. В последнем случае лизосомные ферменты, секретируемые откорректированными миелоидными клетками, происходящими из HSPC, которые мигрировали в ЦНС, могут способствовать коррекции соседних типов клеток - например, олигодендроцитов, нейронов и астроцитов - благодаря способности этих клеток поглощать ферменты. через рецептор манноза 6-фосфата, присутствующий на их клеточной поверхности. Такие ферменты включают arylsulfatase A (ARSA) and α-L-iduronidase (IDUA), которых недостаточно рот MLD и мукополисахаридоза типа I (MPSI), соответственно. Генотерапия HSPC также может способствовать замене функционально дефектных миелоидных клеток, включая макрофаги и микроглию, восстанавливая функции очистки и способствуя уменьшению воспаления и окислительного стресса в головном мозге162,163 (рис. 6).



Fig. 6: HSPC-driven localized delivery of therapeutics in lysosomal storage diseases.

Lysosomal storage diseases are characterized by the accumulation of intracellular substrates caused by deficiencies in lysosomal enzymes. Substrate accumulation can disrupt normal cell function and can affect the function of organs such as the kidney, eye, liver, heart and bones, and the peripheral nervous system77,165,170,171. Gene-corrected cells may release functional enzyme into the circulation and at a local level following migration into the tissue to treat these diseases, as therapeutic enzymes can be taken up by non-corrected cells expressing mannose 6-phosphate receptor and break down accumulated intracellular substrates. Some lysosomal storage diseases affect cells of the central nervous system (CNS), leading to demyelination and cognitive and motor degeneration. To reach the CNS, cells need to cross the blood-brain barrier, which can be facilitated by chemotherapy (lightning bolt) and, in some cases, the underlying disorder. Haematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) may directly engraft in the CNS, expand locally and differentiate into corrected myeloid and microglia-like cells, which then release the therapeutic enzyme78. In addition, corrected myeloid progenitors or monocytes released from the bone marrow may migrate into the CNS, differentiate into macrophages and produce enzymes locally. The relative contribution of HSPCs and mature cells to correction is still unclear165, although mouse models suggest a predominant role of progenitors78. HSPC gene therapy may be advantageous over enzyme replacement therapies for targeting the CNS due to the ability of HSPCs to cross the blood-brain barrier. MLD, metachromatic leukodystrophy; MPSI, mucopolysaccharidosis type I; MPSIII, mucopolysaccharidosis type III.

Аллогенные HSCT в настоящее время используется в качестве терапевтического средства при ранних формах пероксисомного заболевания X-ALD164 и при некоторых лизосомных нарушениях накопления, таких как MPSI. Однако некоторые пациенты по-прежнему испытывают значительное неврологическое бремя заболевания даже после успешной трансплантации165,166. Аллогенная HSCT в настоящее время неэффективна при таких заболеваниях, как мукополисахаридоз типа IIIA (MPSIIIA) и MLD, особенно в их формах с ранним началом159. Это может быть связано с недостаточной перекрестной коррекцией метаболического дефекта не гематопоэтических клеток за короткое время, доступное для контроля быстрого прогрессирования заболевания. Генетическая модификация HSPC, разработанная для избыточной экспрессии терапевтических белков, может, таким образом, увеличивать терапевтические уровни белка в крови и многих тканях, включая ЦНС и кости, и обеспечивать повышенную способность к перекрестной коррекции, компенсируя присутствие остаточных, неоткорректированных клеток-хозяина. Отдельные нейро-метаболические расстройства обсуждаются в следующих подразделах.

X-linked adrenoleukodystrophy


X-ALD - это тяжелое демиелинизирующее заболевание, связанное с дефицитом белка ALD (кодируемого ABCD1), который вызывает дефекты деградации жирных кислот с очень длинной цепью. Церебральная форма X-ALD характеризуется проблемами с обучением и поведением, начиная со среднего возраста 7 лет, с последующим быстрым неврологическим ухудшением. Воспаление головного мозга с инфильтрацией моноцитов и потерей микроглии - признаки заболевания. Считается, что положительные эффекты трансплантации опосредуются донорской заменой дефектных миелоидных клеток26,162.
Первое исследование генотерапии человека с использованием HSPC, трансдуцированных лентивирусным вектором, было проведено у двух пациентов с церебральной X-ALD33 (рис. 2). Генотерапия привела к экспрессии трансгена ABCD1 в 19% миелоидных клеток CD14 +, к метаболической коррекции и клинической стабилизации через 12-16 месяцев после лечения. В последующем испытании были получены аналогичные результаты у 15 из 17 пациентов с X-ALD, которые наблюдались в среднем через 29,4 месяца после генной терапии, у которых не было серьезных функциональных нарушений и наблюдалось замедленное прогрессирование поражений головного мозга26. Пероксисомные ферменты не секретируются, и механизм улучшения состояния при пероксисомных болезнях накопления до сих пор не совсем понятен, хотя была выдвинута гипотеза, что откорректированные клетки могут восстанавливать метаболизм нефункциональных нейрональных клеток посредством прямого межклеточного контакта167.

Metachromatic leukodystrophy


MLD - это тяжелое лизосомное нарушение накопления, вызванное мутациями в ARSA, гене, кодирующем ARSA. Дефицит ARSA приводит к накоплению сульфатидов в ЦНС и периферической нервной системе, что приводит к прогрессирующей демиелинизации и нейродегенерации. Первое клиническое испытание, основанное на HSPC, трансдуцированных лентивирусным вектором, кодирующим ARSA, показало безопасность и эффективность у восьми из девяти пациентов с MLD, леченных на пре-симптоматической или очень ранней симптоматической стадии68. Лечение восстановило активность ARSA в циркулирующих гемопоэтических клетках пациента и в спинномозговой жидкости до нормального или выше нормального уровня, что указывает на местную его продукцию откорректированными клетками, производными HSPC, и предотвратило начало или прогрессирование заболевания. В отличие от нелеченных пациентов и их братьев и сестер, у большинства пролеченных пациентов наблюдалось непрерывное моторное и когнитивное развитие77 при среднем сроке наблюдения 3 года; с тех пор эти результаты были подтверждены в более широкой когорте пациентов с периодом наблюдения до 7,5 лет168. Этот лекарственный препарат на основе генной терапии (Libmeldy) получил положительное заключение Комитета EMA по лекарственным средствам для человека (см. Ссылки по теме). Это исследование представляет собой ключевое доказательство принципа, указывающего на то, что генотерапия HSPC может быть использована в качестве терапевтической стратегии при лизосомных нарушениях накопления.

Mucopolysaccharidosis


Мукополисахаридоз - это группа редких гетерогенных заболеваний, вызванных дефицитом ферментов, участвующих в расщеплении гликозаминогликанов. Эти заболевания проявляются соматическими и неврологическими симптомами в зависимости от типа накапливающегося гликозаминогликана169. У людей с тяжелой формой MPSI (синдром Гурлера), вызванной дефицитом фермента IDUA, обычно развиваются скелетные аномалии, гепатоспленомегалия, специфические черты лица, проблемы со зрением, сердцем и дыханием, а также задержка развития, что приводит к серьезным интеллектуальным нарушениям. Физические особенности пациентов с MPSIII (синдром Санфилиппо) менее выражены, чем у пациентов с MPSI, а у детей с MPSIII развивается нейродегенерация с нарушением когнитивных функций и проблемами поведения и сна. Исследования на мышиных моделях MPSI и MPSIIIA, вызванных мутациями в гене, кодирующем N-сульфоглюкозаминсульфогидролазу, при лечении генотерапией HSPC, модифицированной лентивирусным вектором, показали повышенную эффективность этого подхода по сравнению с аллогенным HSCT170,171. Клинические испытания, направленные на коррекцию неврологического фенотипа и системных особенностей MPSI и MPSIIIA, начались недавно (таблица 1). Предварительное сообщение об исследовании генной терапии MPSI показывает супрафизиологическую активность IDUA в крови, быстрое снижение уровней гликозаминогликанов и ранние признаки клинического улучшения172.

Other gene therapy strategies


Клинические испытания, основанные на трансдуцированных лентивирусами HSPC, продолжаются для лизосомных заболеваний цистиноза и болезни Фабри (таблица 1) и находятся в доклинической фазе для MPSII, MPSIIIB и болезни Pompe. Следует отметить, что преимущества HSPC генотерапии ex vivo могут быть ограничены у пациентов с симптомами и у пациентов с быстро прогрессирующими вариантами заболевания из-за присущей им задержки ферментативного восстановления тканей ЦНС миелоидными клетками, происходящими от HSPC. Подходы, основанные на прямой доставке в мозг AAV или лентивирусных векторов, кодирующих ген, дефектного фермента173, внутривенной инъекции векторов AAV, способных воздействовать на мозг, таких как AAV9 (ссылка 174), или прямой инъекции генно-модифицированных HPCs175 могут обеспечить более своевременное восстановление ферментов. Универсальный скрининг новорожденных для раннего выявления этих заболеваний находится в стадии разработки или уже внедряется в рамках установленных программ метаболического скрининга и может позволить быстрое лечение до появления симптомов176.

Acquired diseases


HSPC могут использоваться для системной доставки терапевтических молекул или к пораженным тканям для лечения приобретенных заболеваний, таких как рак, приобретенное иммунное заболевание, хронические инфекции или нейродегенеративные нарушения, такие как рассеянный склероз. HSPC могут быть сконструированы для производства цитокинов, которые вызывают устойчивость к специфическим микроорганизмам или экспрессируют поверхностные рецепторы, которые модулируют иммунный ответ; например, при экспрессии на HSPCs, checkpoint иммунная молекула PDL1, как было показано, ингибирует аутоиммунные ответы и обращает вспять диабет 1 типа в экспериментальной модели177. Кроме того, HSPC могут производить молекулы, блокирующие рост опухолевых клеток или способствующие иммунному распознаванию рака. Местное высвобождение терапевтических молекул, доставляемых HSPC, может обеспечить устойчивую экспрессию в ткани-мишени при одновременном снижении системной токсичности и риска нежелательных явлений. Это было недавно показано на доклинических моделях, в которых инфильтрирующие макрофаги опухоли происходили от трансдуцированных HSPC, избирательно экспрессирующих интерферон-α , индуцированной иммуностимулирующей программой в микроокружении опухоли, как показали анализы транскриптома. Это благоприятствовало priming и эффекторным функциям Т-клеток по отношению к множественным опухолевым антигенам, что приводило к ингибированию лейкемического роста 178.

Conclusions and future perspectives


Генная терапия HSPC предлагает перспективу значительного клинического улучшения и даже лечения большого числа наследственных иммуно-гематологических и метаболических заболеваний. Однако по мере того, как аутологичная генная терапия HSPC поступает в клинику, возникают значительные финансовые и логистические проблемы, которые необходимо решить, прежде чем использовать ее в глобальном масштабе. Текущие стратегии основаны на централизованных производственных мощностях и ограниченном количестве лечебных центров, специализирующихся на заболеваниях и генной терапии, тогда как полностью автоматизированная трансдукция могла бы изменить эту модель, позволив местное производство и широкое распространение лекарственных препаратов.
Разработка стабильных клеточных линий-продуцентов и реагентов, способных усиливать прикрепление вирусов (таких как LentiBOOST), подавлять естественные внутриклеточные пути ограничения вируса (например, циклоспорин H) и способствовать трансдукции при сокращении культуры ex vivo (таких как простагландин E2), находится на стадии интенсивных исследований, некоторые из которых уже используются в клинической практике152,172. Исследования клонального отслеживания будут важны для оценки того, сохраняют ли обновленные протоколы как примитивные, так и фиксированные гематопоэтические предшественники в лекарственном препарате и способствуют ли быстрому восстановлению гематопоэза, одновременно предотвращая быстрое истощение примитивных HSC и обеспечивая долгосрочное поддержание трансплантата. Кроме того, криоконсервация лекарственного препарата или тесная автоматизация обработки и трансдукции клеток может обеспечить большую стандартизацию с точки зрения качества и дозирования.
Для большинства случаев применения HSCT использование алкилирующих агентов для кондиционирования пациента связано с краткосрочными и долгосрочными токсическими эффектами. Разработка схем кондиционирования на основе антител, нацеленных на молекулы, экспрессируемые на гемопоэтических клетках хозяина, такие как CD117 или CD45, может привести к замене алкилирующих агентов или их использованию в сочетании с алкилирующими агентами, чтобы снизить дозу алкилирующих агентов. Генотерапия предлагает перспективу значительного клинического улучшения и даже лечения большого количества наследственных иммуно-гематологических и метаболических заболеваний. Однако по мере того, как аутологичная генная терапия HSPC поступает в клинику, возникают значительные финансовые и логистические проблемы, которые необходимо решить, прежде чем использовать ее в глобальном масштабе. Текущие стратегии основаны на централизованных производственных мощностях и ограниченном количестве лечебных центров, специализирующихся на заболеваниях и генной терапии, тогда как полностью автоматизированная трансдукция может изменить эту модель, позволив местное производство и широкое распространение лекарственных препаратов.
Недавние доклинические исследования показали потенциальную альтернативу переносу генов ex vivo посредством трансдукции HSPC после прямого внутривенного введения вирусных векторов in vivo, хотя и с низкой эффективностью179.
В некоторых случаях физиологическая регуляция экспрессии трансгена желательна для достижения клинического эффекта и во избежание нежелательной токсичности, связанной с трансгеном. Хотя включение сложных регуляторных элементов в векторы добавления генов может реализовывать эти критерии, локус-специфичное редактирование генов может использовать естественные механизмы регуляции генов. Однако использование синтетических минигенов в качестве "универсальных" матриц репарации для гомологичной рекомбинации не обязательно повторяет физиологическую экспрессию генов и может потребовать сложной конструкции. Повышение эффективности редактирования генов, особенно точности восстановления, вероятно, приведет к увеличению числа клинических применений с использованием HSPC, с редактируемыми генами. Хотя, в принципе, подход редактирования генов должен быть более безопасным, чем подходы с добавлением генов на основе векторов, так как оно должно избегать проблем с изменениями ДНК вне мишени, вызванными полу-случайной интеграцией вектора, клиническая безопасность редактирования генов при генотерапии HSPC еще не доказана180. Разработка высокоточных нуклеаз Cas9 может преодолевать любые остаточные нецелевые изменения, хотя разрывы двойной нити ДНК также могут вызывать перестройки генома, такие как делеции, инверсии и транслокации59. Базовое редактирование134 и prime редактирование62,63 обещают более безопасную и эффективную геномную инженерию. Тем не менее, до внедрения редактирования генов при генотерапии необходимы значительные улучшения в производстве в клиническом масштабе и лучшее понимание нецелевых и неожиданных воздействий на цель. В области редактирования генома доклинические исследования и нормативные рекомендации должны основываться на предыдущем опыте векторной генной терапии, которая проложила путь для клинической трансляции передовых клеточных методов лечения. Анализы и протоколы должны быть адаптированы для лучшей оценки потенциальной генотоксичности, вызванной редактированием генов.
Большинство методов генотерапии HSPC на сегодняшний день нацелены на определенные наследственные заболевания. По мере совершенствования технологий и увеличения нашего понимания долговечности и безопасности генной терапии HSPC могут появиться возможности для воздействия на другие болезни. Например, приобретенные нейродегенеративные состояния могут выиграть от устойчивой доставки терапевтических молекул в мозг через микроглию, происходящую от HSPC. Хронические инфекционные заболевания и рак также могут быть уменьшены за счет системной доставки терапевтических средств или за счет устранения резервуаров гемопоэтических заболеваний, как в случае ВИЧ инфекции181. Например, генетическая модификация Т-лимфоцитов с помощью рецептора химерного антигена представляет собой инновационный подход к лечению различных форм гематологического рака182. Использование генной терапии HSPC, вероятно, будет продолжать быстро расти и направлено на все более широкий спектр иммуно-гематологических и нейро-метаболических заболеваний.