Были предложены различные методы невирусного переноса генов для индукции хондрогенеза в МСК (Raisin et al., 2016). Системы каркасов, состоящие из природных компонентов, связанных с хрящевой тканью, тестируются на усиление хондрогенеза МСК с помощью агентов доставки генов. Факторы транскрипции, такие как SOX-5, 6 и 9, и факторы роста (GF), включая трансформирующие факторы роста (TGF) и морфогенетические белки костей (BMP), уже были исследованы в этом контексте. (Figure 2). В исследованиях МСК из жировой ткани in vivo с целью оценки эффективности воздействия TGF- β2 и BMP-7 на костно-хрящевые дефекты, эти факторы роста были закреплены на каркасах для преодоления ограничений, связанных с их структурной нестабильностью и коротким периодом полураспада (Im и Ли, 2010). Такие каркасы также можно использовать для доставки генов транскрипционных факторов, что было продемонстрировано усиленным хондрогенезом жировых стволовых клеток (ASC) на пористом каркасе полилактид-ко-гликолид (PGLA), содержащем плазмидную ДНК, кодирующую трио генов SOX (SOX5, SOX6 и SOX9) и медленно высвобождая их для трансфекции ASC, закрепленных в каркасе (Im et al., 2011). Следовательно, хондрогенные транскрипционные факторы и факторы роста также могут быть включены в стратегии невирусной генной терапии для будущих терапевтических разработок. Исследование, основанное на ранее упомянутой работе, с применением улучшенного и более продвинутого метода пропитки пористого полилактид-гликолидного каркаса (PGLA) генами SOX5, SOX6 и SOX9, привело к усилению хондрогенеза стволовых клеток жировой ткани. (Im et al., 2011). Осуществлено исследование каркаса PLGA, включающее ту же комбинацию факторов транскрипции SOX 5/6/9, но вместо жировых стволовых клеток человеческие клетки hMSC, полученные из костного мозга (Park et al., 2011). Комбинация генов SOX 5/6/9 была трансфицирована в hMSC, что привело к возникновению компактных и широко распространенных гранул hMSC, сильно окрашенным антителами против коллагена типа II и аггрекана, что позволяет предположить, что этот подход является подходящим методом для невирусных доставка генов. Другое исследование направленной доставки SOX5, 6 и 9 в клетки, но с использованием другой модели каркаса, каркаса на основе пористого коллагена в сочетании с гиалуроновой кислотой (CHyA), продемонстрировало хондрогенную дифференцировку МСК в фенотипически стабильные хондроциты, сохраняя все характеристики ECM, подобные суставному хрящу, после имплантации in vivo и вызывая подавление эндохондральной оссификации (Raftery et al., 2020). TGF- &бета; и SOX9 были предложены как наиболее мощные хондрогенные факторы для совместной доставки в МСК костного мозга. Хотя фактор транскрипции SOX9 сам по себе не индуцирует хондрогенез, метод, включающий комбинацию с гепаринизированным TGF- β3-модифицированным каркасом и каркасами PLGA, облегчил одновременную доставку обоих генов и предотвратил дедифференцировку трансфицированных hMSC.

Figure 2. Non-viral nucleic acid-conjugating systems for gene delivery into chondrocytes.

Системы на основе полимеров, включая поли-L-лизин (PLL), полиэтиленимин (PEI) или полиэтиленгликоль (PEG), также представляют большой интерес для доставки генов в клетки. Эти полимеры образуют сильные электростатические комплексы с нуклеиновыми кислотами, что облегчает их проникновение в клетки. (Raisin et al., 2016; Song and Park, 2020). Полимерные комплексы с гиалуроновой кислотой (HA) обеспечивают более эффективную доставку генов, поскольку HA связывается с рецептором MSC CD44, позволяя комплексам проникать в клетки. Такие методы были использованы для доставки генов SOX в МСК, сильно стимулируя их хондрогенную дифференцировку (Song and Park, 2020). Подобные носители генов с использованием наночастиц хитозан-трансплант-PEI (CP) / ДНК (Lu et al., 2014), а также системы, модифицированные HA-хитозаном (Lu et al., 2011), были предложены в качестве эффективного способа доставки генов в хондроциты и синовиоциты.

Различные материалы для доставки и их физико-химические свойства также играют важную роль в обеспечении эффективного целенаправленного воздействия на клетки и ткани, например, биоразлагаемые липидные и полимерные наночастицы обладают важным преимуществом перед неорганическими наночастицами. (Wells, 2010; Nayerossadat et al., 2012; Mashel et al., 2020). Как упоминалось ранее, методы невирусного переноса генов включают различные виды липосом или других конъюгатов нуклеиновых кислот и применяются как для локальной доставки, так и для доставки клеток, экстрагированных ex vivo, даже если эффективность их трансфекции намного ниже по сравнению с переносом генов вирусами (Robbins et al., 2003). Однако невирусная трансфекция генов также дает многообещающие результаты. Например, реагент для невирусной трансфекции генов на основе липидов "FuGene 6" использовался в хондроцитах C28/I2 и показал надежные результаты, но с эффективностью трансфекции только 30% и жизнеспособностью клеток более 95% (Greco et al. др., 2011). В этом исследовании клетки C28/I2 трансфицировали геном, кодирующим BMP-2, что привело к значительному увеличению экспрессии генов коллагена типа II и аггрекана.

Реагент для трансфекции FuGene 6 был частью ранней доклинической стратегии разработки для экспрессии трансгена человеческого IL-10 в клетках HEK-293 (Watkins et al., 2020), что привело к созданию плазмиды с голой ДНК в носителе, состоящем из PBS и D-маннозы, и к последующему тестированию на трансляционной модели ОА у гончих собак. Терапия хорошо переносилась в течение 6 месяцев со значительным уменьшением боли в зависимости от поведения животных. Этот подход был предложен в качестве научной основы для будущих клинических испытаний на людях.

Липосомы - одна из основных систем, несущих нуклеиновые кислоты, предлагаемых в качестве потенциальных инструментов для замены вирусных векторов. Эти катионные липиды состоят из положительно и отрицательно заряженных групп и обладают сродством к объединению с отрицательно заряженной ДНК. Они образуют двухслойные пузырьки и служат транспортными средствами для ДНК (Clanchy and Williams, 2008). Однако эффективность трансфекции этих систем ниже, чем у систем на основе липидов, например, коммерческий продукт Lipofectin оказался менее эффективным в переносе генов по сравнению с FuGene 6. (Stive et al., 2002; Graceffa et al., 2018). Помимо липидов, были изучены и другие наноносители, такие как наномицеллы, нано-микросферы (Chen et al., 2018). Смесь хитозана, HA и хондроитинсульфата (CS) была предложена в качестве эффективной нано-микросферы для переноса плазмиды GDF-5 в суставные полости кроликов с развитым OA и продемонстрировала низкую цитотоксичность в отношении хондроцитов in vitro, а также высокую эффективность трансфекции in vivo (более 60%), способствуя большей продукции ECM in vivo, по сравнению с контрольной группой (Chen et al., 2018).

Другой потенциальный вариант адресной доставки генов включает пептиды, несущие ДНК. Пептиды со сродством к хондроцитам (CAP), которые специфически взаимодействуют с хондроцитами, были ковалентно модифицированы для связывания с CAP, образуя невирусный вектор (Pi et al., 2011). Эти конструкции вводили в коленные суставы кроликов, и было показано, что они специфически поглощаются хондроцитами по сравнению с самостоятельными векторами PEI. (Pi et al., 2011). (Clanchy and Williams, 2008).

Другая потенциальная стратегия модификации заболевания, применяемая при ОА, заключается в использовании систем, конъюгированных с информационной РНК (мРНК), в качестве стратегии для модификации заболевания ОА. Было показано, что нано-мицеллы из ПЭГ, несущие мРНК фактора транскрипции-1, связанного с runx, анаболического фактора хряща (RUNX1), значительно подавляют прогрессирование ОА после внутрисуставной инъекции на модели ОА у мышей. (Aini et al., 2016).

Таким образом, был достигнут значительный прогресс в области невирусного переноса генов, что повысило эффективность инструментов и доступных методов, что может привести к новым перспективам и терапевтическим стратегиям для будущих клинических исследований.