Посещений:
ПЕРВИЧНЫЙ ИММУНОДЕФИЦИТ



Редактирование генов

Gene Editing for the Treatment of Primary Immunodeficiency Diseases
Rajeev Rai, Adrian J. Thrasher, and Alessia Cavazza
Human Gene Therapy Vol. 32, No. 1-2



Primary Immunodeficiency Diseases (PIDs) образуют гетерогенную группу редких генетических нарушений, влияющих на развитие, регуляцию и функцию иммунной системы. Повышенная чувствительность к инфекциям, аутоиммунная реакция и воспалительные осложнения, а также риск развития озлокачествления являются основными клиническими проявлениями, наблюдаемыми у индивидов с PIDs.1 Развитие технологий секвенирования ДНК и генетического тестирования в настоящее время привело к выявлению более 300 мутаций генов, вызывающих различные формы PID.2 Кроме того, различные мутации в одном и том же гене, связанном с PID, могут приводить к очень разным клиническим и иммунологическим фенотипическим проявлениям заболеваний, увеличивая сложность и гетерогенность этой группы расстройств. Хотя большинство PIDS являются наследственными, с частотой заболеваемости примерно от 1 до 5000 до 1 на 106 живорожденных, были также описаны благоприобретенные формы заболевания.3
Лечение многих PIDS основано на предотвращении инфекции с помощью профилактики и, при необходимости, противовоспалительных препаратов.4 В то время как вышеуказанные методы лечения могут обеспечить адекватную временную поддержку, трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток и клеток предшественников (HSPC) может обеспечить окончательное излечение многих PID с гемопоэтическими клетками в основе. К сожалению, ограниченная доступность доноров, с соответствующим человеческим лейкоцитарным антигеном (HLA), создает трудности для многих пациентов, и хотя трансплантация с использованием доноров, не соответствующих HLA, становится все более успешной, она сопряжена со значительными рисками, включая заболевание трансплантат против хозяина и отторжение трансплантата, приводящее к неполному восстановлению иммунных клеток и к более высоким рискам смертности и длительной болезненности. Аутологичная генотерапия предоставляет привлекательный вариант путем генетической коррекции собственных HSPCs пациента с помощью вирусных векторов.5 Улучшив характеристики безопасности вирусных векторов, текущие испытания генной терапии I / II фазы были осуществлены для лечения различных PIDS, включая аденозиндезаминазы-тяжелый комбинированный иммунодефицит (ADA-SCID), X-SCID (SCID-X1), хроническое гранулематозное заболевание (CGD) и синдром Вискотта-Олдрича (WAS) с в значительной степени успешными клиническими результатами.6-10 Несмотря на это, для утверждения большинства этих продуктов генной терапии в качестве лекарственных средств по-прежнему требуются долгосрочные последующие исследования безопасности/эффективности,11 поскольку они имеют некоторые ограничения, в том числе полуслучайную схему интеграции вирусных векторов и часто нерегулируемую экспрессию трансгенов в трансдуцированных клетках.12
Точное целенаправленное воздействие с помощью редактирования генов недавно появилось в качестве альтернативной технологии для преодоления ограничений традиционной генной терапии. Сконструированные эндонуклеазы, которые вызывают двухцепочечные разрывы (DSB) в определенных последовательностях генома, обеспечивают гораздо больший контроль над интеграцией вирусных векторов. Более того, специфичная для сайта коррекция мутции в ДНК, вызывающей заболевание, in situ гарантирует, что физиологически регулируемая экспрессия правильного гена с большей вероятностью сохранится в отредактированных клетках.

Gene Editing Tools


За последнее десятилетие произошел глобальный всплеск в выявлении и открытии новых инструментов редактирования генов. На сегодняшний день в контексте исследований PID широко используются три основные платформы: нуклеазы цинковых пальчиков (ZFNs), нуклеазы-эффекторы активатора транскрипции (TALENs) и кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы, связанные с нуклеазой Cas9 (CRISPR / cas9).(Fig. 1). Эти сконструированные нуклеазы состоят из специфичного для сайта домена связывания ДНК и неспецифического домена нуклеазы, который расщепляет ДНК-мишень. Платформы ZNFS и Talens содержат модули цинковых пальчиков или TALE, соответственно, в качестве ДНК-связывающих доменов, которые соединены с зависимым от димеризации доменом эндонуклеазы FokI.13 Платформа CRISPR/cas9 базируется на ДНК-связывающей направляющей гид РНК (gRNA), которая комплементарна последовательности ДНК-мишени, и эндонуклеазе Cas9.14 Поскольку для нацеливания на различные генетические локусы требуется простая модификация последовательности gRNA, без необходимости сложной нуклеазной инженерии, как в случае ZFNs и TALENs, CRISPR Cas9 стал экономически эффективным, простым в использовании и популярным выбором для редактирования генома.

Figure 1. HDR-mediated genome editing strategies to achieve physiological expression of the correct gene. Gene editing platforms, such as ZFNs, TALENs, and CRISPR/Cas9, are delivered to the target cell in either a plasmid, RNA, and/or protein format (blue box). Strategies to introduce these reagents into the cells include electroporation, viral vectors, and lipid nanoparticles (purple box). Once the endonucleases reach the cell nucleus, upon binding to the DNA, they induce double-strand breaks (blue scissors) at specific sites. Two major HDR-based strategies can be implemented to revert a disease phenotype caused by a genetic mutation (red spark), while preserving endogenous regulation and wild-type levels of expression of the correct protein. In the case of gene correction, the delivery of a mini-gene or a ssODN donor template can replace small fragments of the mutated region or correct a few base-pair mutation. In the case of gene insertion, a wild-type cDNA donor template can be knocked-in close to or in frame with the translation start codon (ATG) of the mutated gene. Both strategies will result in the functional restoration of regulated and physiological protein expression, driven by endogenous transcriptional and post-transcriptional regulatory regions. CRISPR/Cas9, clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated Cas9 nuclease; HDR, homology directed repair; ssODN, single-strand oligo DNA; TALEN, transcription activator effector nuclease; ZFN, zinc finger nuclease. Color images are available online.

Хотя они различаются с точки зрения распознавания цели, активности и специфичности, эти платформы были разработаны для индукции DSB при связывании с сайтом мишенью, вызывая активацию двух основных эндогенных путей восстановления: nonhomologous end joining (NHEJ) и homology-directed repair (HDR). Каждый из этих путей может быть использован в терапевтических целях. Эффективный, но подверженный ошибкам путь NHEJ устраняет DSBs путем прямого лигирования двух нитей ДНК без использования шаблона (матрицы), что приводит к случайной вставке и/или удалению (indels) нуклеотидов. Сгенерированные indels могут подавлять экспрессию белка или функцию регуляторной области, и, таким образом, этот путь восстановления может быть использован для лечения патологических доминантно активных генетических элементов. Напротив, HDR обеспечивает точное восстановление разреза за счет использования последовательности ДНК, гомологичной области, прилегающей к DSB, в качестве шаблона. Поскольку этот процесс приводит к вставке правильной последовательности ДНК, этот путь может быть использован при лечении тех заболеваний, для которых исправление или добавление генетического элемента может привести к терапевтической пользе.
В контексте PIDs, HDR-опосредованное редактирование является наиболее часто используемым путем восстановления для исправления мутаций с потерей функции, лежащих в основе заболевания, путем либо специфичной для сайта вставки гена, либо коррекции специфичных для пациента мутаций (рис. 1). Сайт-специфичная коррекция мутаций, вызывающих заболевание, является наиболее элегантным подходом к восстановлению дефектного гена, ответственного за моногенное расстройство, и особенно полезна при лечении состояний, в которых одна или преобладающая мутация лежит в основе заболевания. Однако, большинство PID вызваны мутациями, расположенными по всему гену, что требует подбора реагентов для редактирования генов для каждого отдельного пациента. По этой причине интеграция всей корректирующей генной кассеты в желаемый локус посредством HDR-опосредованной сайт-специфичной вставки гена позволила бы функционально исправить все вызывающие заболевание мутации с помощью всего лишь одного набора реагентов, что представляет собой более привлекательный подход, который может быть универсально применен ко всем пациентам. Эта стратегия может быть использована для интеграции гена либо в определенную "безопасную гавань"15, либо в его собственный геномный локус, позволяя сохранить его физиологическую экспрессию. Хотя последняя стратегия специфична для каждого отдельного гена, она может быть особенно привлекательна при заболеваниях, при которых необходима эндогенная регуляция генов.

Gene Editing Strategies to Treat PIDs


С самого первого клинического испытания генной терапии PID успешные результаты лечения были получены благодаря модификации HSPCs ex vivo. Поскольку выделение и аутологичная трансплантация HSPCs пациентам в настоящее время осуществляется относительно легко, клинические испытания PID, включающие редактирование генов HSPCs, вероятно, в обозримом будущем пойдут по пути ex vivo. В целом, применение редактирования генома к HSPCs показало существенные преимущества в отношении функциональной коррекции генов для различных типов PID. При применении редактирования генома с целью устранения функциональных и фенотипических дефектов заболевания исследователям необходимо не только выбрать, какой конкретный инструмент использовать, но и маршрут доставки, дозу и время внесения реагентов для редактирования. Это делается для обеспечения высокой эффективности HDR и незначительных цитотоксических и побочных эффектов в интересующем типе клеток. В зависимости от типа и местоположения мутации исследователи показали, что можно полностью воспроизвести физиологический паттерн экспрессии генов и восстановить функциональный иммунный ответ путем HDR-опосредованного редактирования желаемого геномного локуса в HSPCs. Данные также показали способность отредактированных клеток, полученных от пациента, проникать в костный мозг и дифференцироваться в различные иммунные клетки in vivo. В настоящее время проводятся крупномасштабные доклинические исследования для оценки долгосрочной безопасности и эффективности продуктов редактирования генов и определения минимального уровня целенаправленной коррекции, необходимой для достижения терапевтической пользы для каждого типа PID без существенного влияния на гематопоэз в течение последующей жизни. В этом исследовании мы рассмотрим текущие достижения в области редактирования генома, выделив наиболее перспективные стратегии, которые были внедрены для исправления PID.

Severe combined immunodeficiency, X-linked


В 2005 году Urnov et al. одними из первых продемонстрировали функциональную коррекцию мутировавшего гена IL2RG, который отвечает за SCID-X1, Х-сцепленный рецессивный моногенный PID, характеризующуюся полным блокированием развития Т- и NK-лимфоцитов и с дисфункциональными В-клетками.16,17. Для редактирования IL2RG Urnov et al. трансфицировали K562 и Т-клетки с помощью ZFNs вместе с донорской плазмидой, несущей фрагмент экзона 5 IL2RG, добившись частоты HDR-опосредованного восстановления в 5% в первичных Т-клетках.17 Эти эксперименты подчеркнули ограничения, связанные с доставкой редактирующих реагентов путем трансфекционной плазмиды в клинически значимые первичные клетки, где наблюдалась повышенная токсичность и ничтожная частота HDR. Для решения этих проблем Lombardo et al. использовали integrase-defective lentiviral vector (IDLV) для упаковки и доставки ZFN димеров и донорской матрицы для целенаправленного воздействия на IL2RG, что привело к получению 0,2% GFP-экспрессирующих клеток HSPC, полученных от здоровых доноров, с минимальной токсичностью.18 Для повышения общего уровня целенаправленного воздействия на IL2RG в HSPC, Genovese et al. оптимизировали условия культивирования ex vivo, а также время и способ доставки реагентов для редактирования.19 Благодаря электропортации мРНК ZFN через 2 дня после размораживания клеток с последующей трансдукцией IDLV донорской матрицы IL2RG-GFP было достигнуто увеличение до 20% GFP-положительных HSPC, при этом заметно увеличилась частота и выход GFP-положительных клеток-мишеней в примитивных, длительно заселяемых вновь гемопоэтических стволовых клетках (HSCs). Недавно два дополнительных исследования продемонстрировали огромный прогресс в коррекции SCID-X1 путем редактирования генов с использованием системы ZNF или CRISPR / Cas9, связанной с доставкой донорской матрицы в HSPC при использовании вектора AAV6.20,21 Оба исследования продемонстрировали, что более высокое HDR-опосредованное редактирование может быть достигнуто в популяции клеток HSPC и HSC как in vitro, так и in vivo, когда клетки подвергаются электропортации с комплексом gRNA-Cas9 рибонуклеопротеин (RNP) с последующей трансдукцией с помощью донорной матрицы AAV6. Действительно, эта стратегия вызывала до 40% целенаправленной интеграции в HSPCs SCID-X1, полностью восстанавливая физиологическую экспрессию генов и успешно восстанавливая все гематопоэтические клоны у иммунодефицитных мышей, трансплантированных клетками c исправленными генами.21 SCID-X1 представляет собой идеальную цель для исследований редактирования генов, подтверждающих принцип действия, поскольку избирательное преимущество, которое функционально скорректированные клетки имеют перед мутировавшими в воздействии на SCID, может компенсировать относительно низкую скорость опосредованной HDR коррекции в HSPC. Оптимизация протокола может потребоваться для увеличения скорости генной коррекции в HSPC и более примитивных HSC для устранения проявления заболевания при PID, где отсутствует такое сильное селективное преимущество.

Chronic granulomatous disease


CGD - это группа опасных для жизни PID , вызываемых мутациями в любой из пяти белковых субъединиц (gp91phox, p22phox, p40phox, p47phox и p67phox) ферментного комплекса nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NADPH). Помимо gp91phox, который кодируется геном CYBB, расположенным в X-хромосоме и ассоциированным с X-связанной формой заболевания, остальные субъединицы ответственны за аутосомно-рецессивный CGD. Поскольку НАДФН-оксидаза важна для производства активных форм кислорода и ядерной внеклеточной ловушки в фагоцитах, пациенты с CGD с нефункциональной НАДФН-оксидазой подвержены тяжелой инфекции и воспалению, включая пневмонию и сепсис крови (22)
Недавние попытки лечения X-CGD с помощью редактирования гена HSPC показали пригодность использования оптимизированных систем ZFN и CRISPR / Cas9, кодируемых либо с вектором AAV6, либо с одноцепочечной олиго ДНК (ssODN) в качестве донорской матрицы. Путем электропортации мРНК ZFN, нацеленной на локус AAVS1 "безопасная гавань", с последующей трансдукцией AAV6, содержащим матрицу кДНК CYBB, De Ravin et al. продемонстрировали восстановление экспрессии gp91phox в 15% HSPCs X-CGD in vitro, тогда как 4-11% клеток gp91phox + были обнаружены у иммуно-дефицитных мышей после трансплантации исправленных клеток. Несмотря на относительно низкие показатели HDR как in vitro, так и in vivo, более 95% скорректированных клеток восстанавливали оксидазную активность и демонстрировали аналогичный уровень экспрессии генов, сравнимый с контролем дикого типа.23 Позже та же группа сообщила об улучшении показателей целенаправленного воздействия in vitro до 31% в HSPC и HSC X-CGD при попытке сайт-специфической коррекции точечной мутации в экзоне 7 гена CYBB путем электропортации комплекса RNP с донорной матрицей ssODN. После трансплантации обработанных HSPC мышам с иммунодефицитом 15-20% исправленных клеток сохранялись у трансплантированных животных в течение до 5 месяцев с восстановленной физиологической экспрессией gp91phox в зрелых фагоцитах и с надлежащей функциональностью NADPH-оксидазы.24 Несмотря на эти обнадеживающие данные, непонятно достаточно ли такой генной коррекции для облегчения хода патогенеза CGD, это еще предстоит исследовать, поскольку исправленные клетки X-CGD не обладают селективным преимуществом in vivo. Было бы также интересно провести эксперименты по вторичной и третичной трансплантации с отредактированными генами HSPCs, чтобы проверить, сохраняется ли эндогенная физиологическая экспрессия во время длительного гемопоэза in vivo.
В отличие от X-CGD, где множественные мутации ответственны за начало заболевания, p47-CGD можно лечить с помощью исправления гена, а не с помощью метода вставки гена, поскольку> 80% пациентов с p47-CGD гомозиготны по двух- нуклеотидной делеции (? GT) экзона 2 гена NCF1, которая, что интересно, также обнаруживается в двух псевдогенах NCF1, NCF1A и NCF1C. Путем электропортации ZFN, нацеленной на экзон 2 NCF1, вместе с вектором AAV6, содержащим матрицу репарации экзона 2 для HDR-опосредованной коррекции, Merling et al. сообщили о замене мутировавшего экзона в локусе NCF1, а также в обоих псевдогенах, и о восстановлении оксидазной функции в 6% миелоидных клеток, дифференцированных из плюрипотентных стволовых клеток В отличие от X-CGD, где множественные мутации ответственны за начало заболевания, p47-CGD можно лечить с помощью генной коррекции, а не с помощью метода вставки гена, поскольку> 80% пациентов с p47-CGD гомозиготных по двух-нуклеотидной делеции (? GT) экзона 2 гена NCF1, который, что интересно, также обнаруживается в двух псевдогенах NCF1, NCF1A и NCF1C. Путем электропортации ZFN, нацеленных на экзон 2 NCF1, вместе с вектором AAV6, содержащим матрицу репарации экзона 2 для HDR-опосредованной коррекции, Merling et al. сообщили о замене мутировавшего экзона в локусе NCF1, а также в обоих псевдогенах, восстановлении оксидазной функции в 6% миелоидных клеток, дифференцированных от плюрипотентных стволовых клеток В отличие от X-CGD, где множественные мутации ответственны за начало заболевания, p47-CGD можно лечить с помощью генной коррекции, а не с помощью метода вставки гена, поскольку> 80% пациентов с p47-CGD гомозиготны по двух- нуклеотидная делеция (? GT) экзона 2 гена NCF1, который, что интересно, также обнаруживается в двух псевдогенах NCF1, NCF1A и NCF1C. Путем электропортации ZFN, нацеленных на экзон 2 NCF1, вместе с вектором AAV6, содержащим матрицу репарации экзона 2 для HDR-опосредованной коррекции, Merling et al. сообщили о замене мутировавшего экзона в локусе NCF1, а также в обоих псевдогенах, восстанавливалась оксидазня функция в 6% миелоидных клеток, дифференцированных из плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), индуцированных p47-CGD (25). Аналогичный подход был недавно применен Klatt et al., которые использовали систему CRISPR / Cas9 на основе плазмид для исправления мутации ?GT в локусе NCF1 p47-CGD iPSCs клеток, что привело к полному восстановлению функции фагоцитов без изменения каких-либо последовательностей в псевдогенах. 26 Оптимизация этого специфичного для мутаций подхода и его применение к клинически значимым HSPCs может предоставить действительную терапевтическую альтернативу для пациентов, страдающих p47-CGD.

Wiskott-Aldrich syndrome


По сравнению с другими PID, такими как SCID-X1 и CGD, где иммунный дефект ограничен лимфоцитами или гранулоцитами, пациенты с WAS страдают сложным функциональным дефектом во всех зрелых гематопоэтических клетках, за исключением красных кровяных телец. Это Х-сцепленное заболевание вызвано мутацией в гене WAS, кодирующем белок WAS (WASp), регулятор актинового цитоскелета. Клинические проявления WAS включают тромбоцитопению, рецидивирующую инфекцию, экзему, аутоиммунитет и рак.27 О первом испытании концепции использования редактирования генов для борьбы с WAS сообщили Laskowski et al. на iPSCs, полученных от пациента, с использованием платформы ZNF на основе плазмид. Несмотря на очень низкие скорости целевой интеграции, уровень экспрессии белка в отредактированных гематопоэтических клетках, полученных из iPSC, был сравним с контролем дикого типа, и была продемонстрирована функциональная коррекция NK-клеток28. в исследовании сравнивалась эффективность интеграции кассеты GFP в интрон 1 WAS в клетках K562, достигая частоты HDR 5%.29 Несмотря на обнадеживающие ранние результаты, такие сниженные уровни интеграции в мишень, достигнутые в клеточных линиях, вряд ли приведут к терапевтической коррекции дефектов, связанных с WAS, при использовании HSPCs, полученным от пациента. Наша группа недавно преодолела это ограничение, разработав высокоспецифичную и эффективную систему CRISPR / Cas9, связанную с системой редактирования AAV6 для вставки оптимизированной по кодонам кДНК WAS в рамку считывания с ее эндогенным стартовым кодоном трансляции в HSPCs дикого типа и WAS30, это привело только к 60% целевой интеграции в HSPCs WAS, полученных от различных пациентов, но также значительно восстановлены функциональные и фенотипические дефекты в макрофагах, тромбоцитах, Т- и B-клетках, полученных из скорректированных HSPCs, связанных с относительно физиологической экспрессией WASp30. Первичная и вторичная трансплантация отредактированных HSPCs мышам с иммунодефицитом выявила сохранение их способности к дифференцировке in vivo, с доказательствами сохранения скорректированной экспрессии WASp в долгосрочно воспроизводимых клетках и с отсутствием какой-либо заметной токсичности. Это экспериментальное исследование демонстрирует эффективность и безопасность основанного на CRISPR / Cas9 подхода к редактированию генов для лечения WAS, закладывая основу для альтернативного, но очень эффективного, безопасного и точного лечения этого заболевания.

X-linked hyper-IgM syndrome


Для некоторых PID, особенно тех, которые вызваны мутациями в генах, которые требуют жестко регулируемой экспрессии, введение правильного гена в его собственный локус путем целевого редактирования генов может представлять стратегию выбора. Синдром Х-сцепленного гипер-IgM (XHIM) вызывается мутациями в гене лиганда CD40 (CD40L). Экспрессия CD40L точно настроена так, что его белок активируется только на поверхности активированных Т-клеток, где он вызывает переключение класса иммуноглобулинов при связывании с CD40 на В-клетках. Без эффективного производства антител младенцы мужского пола с XHIM предрасположены к рецидивам инфекции и аутоиммунитету с пониженными шансами на выживание.31 Хотя предыдущие попытки генотерапии на мышиной модели XHIM воссоздали адаптивный иммунитет,32 конститутивная эктопическая экспрессия CD40L с вирусного промотора привела к аномальной пролиферации трансдуцированных Т-клеток, что привело к развитию лимфом у экспериментальных мышей (при очевидном отсутствии инсерционного мутагенеза). Hubbard и др. попытались преодолеть это узкое место путем целенаправленного воздействия на правильный ген CD40L под контролем его эндогенного промотора в первичных Т-клетках от трех разных доноров XHIM, используя TALEN в сочетании с AAV6 в качестве донорской матрицы, достигнув 30% целевой интеграции, опосредованной с помощью HDR33. Важно отметить, что клетки, с отредактированными генами, воспроизводят кинетику покоя Т-клеток дикого типа как in vitro, так и in vivo, что свидетельствует о нормальном физиологическом восстановлении CD40L, и восстановлении переключения классов IgG. Хотя аутологичная трансплантация CD40L-отредактированных Т-клеток возможна для лечения XHIM и может использоваться в качестве промежуточной терапии перед лечебной трансплантацией HSC, устойчивый клинический эффект на протяжении всей жизни, вероятно, требует коррекции мутированного гена на уровне HSPCs. Группа Kohn's разработала платформы на основе TALEN и CRISPR / Cas9 для коррекции функциональных дефектов XHIM в HSPCs здоровых доноров, сообщив об относительно высокой скорости интеграции генов в CRISPR / Cas9-отредактированных клетках и об отсутствии аберрантной многолинейной дифференцировки как in vitro, так и in vivo. В среднем 4% отредактированных клеток сохранялись более 5 месяцев после трансплантации иммуно-дефицитным мышам, демонстрируя коррекцию долгосрочно восполняющихся HSC, и более 60% мышей демонстрировали восстановление тимуса. Результаты, полученные на первичных Т-клетках и HSPCs, предполагают, что небольшого количества Т-клеток с генной коррекцией может быть достаточно для восстановления переключения класса IgG и улучшения фенотипа заболевания. Эти многообещающие данные могут стать основой для дальнейшей работы по выяснению того, могут ли отредактированные XHIM-HSPCs, полученные от пациентов, дифференцироваться в скорректированные Т-клетки без возникновения каких-либо побочных эффектов.

Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked (IPEX)


Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked (IPEX) - еще один пример Х-сцепленного моногенного PID, где применение редактирования гена желательно для сохранения специфической для клеточного типа экспрессии гена при целевой интеграции. Заболевание вызывается мутациями в гене FOXP3, который конституитивно экспрессируется в регуляторных Т-клетках (Treg) и временно повышается в активированных эффекторных Т-клетках (Teff). Нарушение функций Treg и Teff лежит в основе начала IPEX, и пациенты имеют множество различных аутоиммунных проявлений, таких как диабет 1 типа, опасная для жизни энтеропатия, экзема и цитопения (35). Для разработки пожизненной генотерапии FOXP3 с использованием HSPCs необходимо достичь конститутивной экспрессии FOXP3 в компартменте Treg без того, чтобы чрезмерная экспрессия FOXP3 нарушала пролиферацию и функцию HSPCs или клеток Teff. Для достижения такой специфической для клеточного типа экспрессии недавнее исследование описало универсальную стратегию редактирования генов на основе CRISPR / Cas9 и AAV6 для доставки FOXP3 в его эндогенный геномный локус.36 Первоначальная оптимизация протокола показала 15% и 25% целевую интеграцию у здоровых доноров Treg и Teff соответственно. Помимо имитации кинетики активации / покоя дикого типа, отредактированные IPEX Treg были способны подавлять пролиферацию 40% Teff отвечающих клеток дикого типа по сравнению с неотредактированным контролем. Такие многообещающие результаты были дополнены экспериментами in vivo на гуманизированных мышах FOXP3, где с откорректированным геном IPEX клетки HSPCs сохранялись в костном мозге до 3 месяцев и были способны дифференцироваться в Treg в селезенке. Дальнейшие исследования относительно того, может ли этот подход спасти фенотип мышей scurfy, который является эквивалентной моделью для человеческого IPEX, одновременно стабилизируя жесткую регуляцию FOXP3 во время развития Т-клеток в тимусе, еще предстоит осуществить.

Challenges of HSPC Gene Editing


Обнадеживающие данные, подтверждающие концепцию точного лечения PID по-прежнему исходят из области исследований редактирования генома и его инновационной терапевтической силы. Чтобы перевести эту платформу со стенда на место у постели больного безопасным и эффективным способом, необходимо решить основные проблемы в ходе базовых и доклинических экспериментов. Некоторые из этих препятствий включают:
Delivery of the editing machinery


Одним из важнейших процессов во время клеточной инженерии ex vivo является доставка нуклеазных реагентов к клеткам-мишеням. Помимо нуклеазы Cas9, которая коммерчески производится в виде очищенного белка, ZFN и TALEN должны доставляться либо в виде плазмидной ДНК, либо в виде мРНК. Электропортация плазмидной ДНК - наименее используемый метод из-за высокой токсичности первичных клеток человека и вставки вне мишени.37 Необходимо также тщательно анализировать при доставке формы мРНК ZFN, TALEN и Cas9, чтобы гарантировать, что не происходит преждевременная деградация из-за примесей и неправильного обращения, а также противовирусного ответа в HSPCs 19,34,38. Эти нежелательные эффекты минимальны при доставке Cas9, связанной с gRNA в комплексе RNP, что приводит к высокой скорости редактирования.39 Из-за их неспособности к интеграции и высокого тропизма к HSPCs, вирусные векторы, такие как AAV и IDLV, получили широкое распространение, но не только для доставки нуклеазы, но также для передачи донорских матриц для HDR-опосредованного редактирования. Одним из недостатков AAV является их грузоподъемность в 4,5 т.п.н., что ограничивает доставку крупных трансгенов. Напротив, IDLV могут содержать кассеты трансгенов размером более 10 т.п.н., но страдают от низкого титра, это имеет дорогостоящие последствия для крупномасштабного производства векторов, и заметных скоростей интеграции в геном полу-случайным образом40. Аналогичным образом, липидные и наночастицы на основе золота считаются наиболее безопасными с точки зрения общей токсичности и профиля иммуногенности, но скорость целевой интеграции, достигнутая до сих пор в HSPCs, недостаточно высока для полной коррекции большинства PID.41 В настоящее время AAV6 считается генетическим инструментом, пригодным для доставки донорской матрицы для эффективного редактирования гена HSPCs, учитывая его общую низкую токсичность, минимальные скорости случайной интеграции и высокую частоту рекомбинации даже при наличии небольших областей гомологии.

Frequency of HDR-mediated targeted integration


Достижение устойчивого и более высокого уровня целенаправленной интеграции - одна из конечных целей полного излечения PID путем редактирования генов. Однако после доставки ex vivo компонентов редактирования NHEJ является предпочтительным путем репарации, используемым для коррекции DSB в неделящихся клетках, таких как стволовые клетки. Чтобы преодолеть эту проблему, различные группы внедрили стратегии либо ингибирования NHEJ, 42 или увеличения частоты HDR, 43 и оптимизировали время и дозировку редактирующих реагентов19,44 для повышения эффективности knockin, что привело к целенаправленной интеграции более 60% in vitro. Отбор HSCs и / или HSPCs, нацеленный на ген, после редактирования и до трансплантации - еще один потенциальный путь компенсации низкой частоты HDR в стволовых клетках, поскольку он гарантирует введение практически чистой популяции исправленных клеток. Однако перед применением этой стратегии в клинических условиях требуются дальнейшие улучшения в протоколе отбора и методах культивирования клеток, поскольку, несмотря на увеличение скорости HDR, выход и способность приживления отредактированных HSCs после сортировки клеток резко снижаются.

Restoration of therapeutically relevant levels of protein expression


Чтобы обеспечить терапевтический успех подхода редактирования генов, необходимо обеспечить экспрессию откорректированного гена до терапевтических уровней и в желательном типе клеток после целенаправленной интеграции. Сайт-специфическое исправление и вставка донорской кассеты в соотв. локус под контролем эндогенных регуляторных регионов, обеспечат экспрессию регулируемого белка, которая будет соответствовать кинетике, наблюдаемой в клетках дикого типа и у здоровых индивидов (Fig. 1).Однако, в случае сайт-специфической инсерции гена, критические регуляторные регионы, находящиеся в интронах, могут быть потеряны при доставке откорректированного гена в форме кДНК, подчеркивая тем самым необходимость в тщательном анализе того, какая часть мутантного локуса должна подвергнуться воздействию (напр., exon 1 vs. exon 2) и какие генетические элементы д. быть включены в донорскую матрицу. В этой связи, выбор транскрипционной (5' TR, Kozak последовательности, сайта связывания транскрипционного фактора) и пост-транскрипционной [3' UTR, poly(A), WPRE] регуляторной последовательности в донорской кассете может существенно влиять на экспрессию откорректированного белка.30,33

Preservation of the stemness and of the engraftment ability of edited HSPCs in vivo


Одним из критических аспектов редактирования генов в HSPC, который нуждается в постоянной оценке, является способность откорректированных стволовых клеток приживляться в костном мозге in vivo, сохраняя тем самым потенциал их долговременного заселения вновь и вновь. Хорошее приживление HSPCs свыше 60% наблюдалось после электропортации HSPCs с помощью Cas9:gRNA RNP иммуно-дефицитных мышей, но сохранение отредактированных клеток в гематопоэтичекой ткани снижалось значительно в течение 8-16 недель после трансплантации в серии экспериментов по трансплантации.19,21,30,44
Снижение числа откорректированных клеток in vivo может быть обусловлено неэффективностью HDR-обеспечиваемое редактирование генов в покоящихся длительное время восполняемых HSCs, или обусловлено их неспособностью к самообновлению после манипуляций с ними in vitro, включая воздействие реагентов редактирования и условия культивирования. Разные стратегии были введены в действие в последние годы, чтобы поддерживать и расширять простой (primitive) пул само-обновляющихся HSCs, такие как использование малых молекул (UM171, PGE2 и StemRegenin1),19-21,38,39,44, а также оптимизация условий культивирования и времени доставки элементов редактирования генов в HSPCs, чтобы сохранять их потенциал приживления. Некоторые исследования показали, что p53-обусловленные повреждения могут менять стволовость HSC, а также приводить к аресту клеточного цикла, что снижает частоту репарации DSB с помощью HDR.38,45 Хотя временное подавление p53, как полагают, устраняет его вредные эффекты на стволовые клетки и усиливает HDR,45 использование таких ингибторов в преклинических и клинических подходах д. быть тщательно изучено с учётом важной функции в супрессии опухолей пути p53. Кроме того, др. группы выявили клеточные факторы, такие как interferon-индуцируемый антивирусный фактор, который может быть ответственным за врожденную иммунную реакцию на вирусы в клетках, когда элементы редактирования генов доставляются лентивирусными векторами; недавнее исследование показало, что этому феномену может противодействовать использование Cyclosporin H.46

Nuclease specificity


Несмотря на свою способность индуцировать целенаправленно действующие модификации, все используемые платформы редактирования генов не обладают безукоризненной специфичностью и могут вносить непреднамеренные DSBs в случайных локусах генома. Модификации вне мишени вносят неизменяемые генные мутации, которые могут в конечном итоге привести к раку. Чтобы предупредить подобные риски жизненно необходимы исчерпывающая детекция и анализ широко распространенной активности редакторов генома. Описано несколько типов методов идентификации indels и хромосомных аберраций вне мишени, каждый имеет определенные преимущества и недостатки. Хотя золотой стандарт ещё не установлен, первоначальный скрининг для отбора идеальной ZFN и TALEN пары или gRNA последовательности для данной мишени и их потенциал вызывать эффекты вне мишени обеспечивается многочисленными компьютерными алгоритмами.47 Такие in silico подходы быстры и легки в использовании, но часто неспособны давть исчерпывающую картину геномной активности ждя аппарата редактирования генов, поэтому они д. быть дополнены беспристрастной техникой детекции генома, включая IDLV capture, CIRCLE-seq, GUIDE-seq, DIGEOME-seq и TaS™.47 Однако, эти методы не всегда выявляют все потенциальные мишени и часто обнаруживают низкую чувствительность, пригодную для использования только соотв. клеточных линиях, обнаруживают изменчивость во времени активности нуклеазы вне мишени по сравнению с терапевтическим воздействием на мишень. Недавние находки, чтобы количественно оценивать последовательности вне мишени in vivo, обнадеживают,48 однако, усилия всё ещё находятся на стадии разработки протокола и реагентов, пригодных для оценки флюктуаций вне мишени в HSPCs до, во время и после трансплантации. Более того, предсказание воздействия, вызывающего нежелательные генетические модификации, сказывающиеся на клеточной приспособленности, не являются тривиальными и требуют разработки функциональных индикаторов безопасности, которые д. действовать в интересующем типе клеток и используемой платформе редактирования. Параллельно усилия исследователей направлены на улучшение специфичности инструментов редактирования, чтобы ограничить их активность вне мишени. Напр., ключевой модификацией для ZFNs и TALENs является замена аминокислотных остатков в ДНК-связывающем и расщепляющем доменах, что приводит к увеличению соотношения между эффектами на мишень и вне мишени.49 С др. стороны, разработка химически модифицированных и более коротких gRNAs в комбинации с использованием мутантных и точно воспроизводимых Cas9 вариантов демонстрирует достоверное увеличение специфичности CRISPR/Cas9 платформы редактирования генов.50 С помощью таких модификаций, терапевтическое редактирования генов при PID достигает решающих вех, оно обнаруживает улучшенную эффективность и мощные профили безопасности; исследования по разработке и улучшению платформ редактирования генов продолжаются и использование их при болезнях при строгой идентификации частоты, расположения и последствий любого потенциального эффекта вне мишени.

Conclusion


During the last few years, tremendous advances have been made in the field of gene editing applied to monogenic disorders. Many proof-of-principle studies applying editing platforms to modify HSPCs, including CRISPR/Cas9 and TALENs, have demonstrated the feasibility of such technologies in correcting the genetic defects underlying the onset of PID. Despite the exciting prospects, no PID clinical trials are currently underway that deploy gene editing technologies. Many research groups are now conducting large-scale preclinical work to assess the long-term safety and efficacy of gene-edited products and to define thresholds of genetic and functional correction needed to reverse the phenotype of each set of PIDs. Fundamental biological concerns remain to be addressed to ensure that significant and unexpected adverse events do not occur. The design of preclinical studies that unequivocally mimics the human clinical trials for a particular PID is therefore desirable, to minimize the translational distance between preclinical and clinical results and ensure that the potential risks for trial participants are negligible. Additionally, direct comparison between gene editing and existing gene therapy platforms or any other treatment option available for a specific PID should be carefully evaluated. This is of paramount importance to assess the applicability and feasibility of gene editing as a curative treatment for such ultra-rare patient populations, especially when taking in account the costs incurred from Good Manufacturing Practice-compliant editing reagents, viral vector production, and the setup of the manufacturing facilities and logistics. Correction of patient HSPCs by means of gene editing remains cumbersome and there are still many challenges facing the field, including the specificity and efficiency of the editing system. Continuous efforts are required to overcome such hurdles, with the final aim of translating gene editing into the next generation of therapeutic tools for severe PID and other blood disorders.