Primary immunodeficiencies (PIDs) представляют собой гетерогенный спектр заболеваний, характеризующихся отсутствием или нарушением развития и/или функции одного или нескольких элементов иммунной системы, возникающих в результате мутаций в отдельных генах. В настоящее время выявлено более 430 причинных генов, которые приводят к целому ряду клинических проявлений, включая восприимчивость к инфекциям, аутоиммунитет, воспаление и злокачественные опухоли.¹ Варианты лечения различны, но основным методом лечения тяжелых форм PIDs является поддерживающая терапия перед окончательным лечением в виде трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (HSCT).² При определенных состояниях генотерапия может предложить альтернативное лечение, а аутологичная генотерапия HSC ex vivo испытывается для лечения все большего числа заболеваний после успешного лечения нескольких PID за последние 20 лет.³ Эта область развилась до такой степени, что лицензированные продукты аутологичной генотерапии доступны для пациентов с тяжелым комбинированным иммунодефицитом с дефицитом аденозиндеаминазы (ADA) (ADA-SCID) и β-талассемией. Генотерапия Т-клеток может предложить потенциальный терапевтический подход для лечения заболеваний, в первую очередь затрагивающих лимфоидный компартмент, и была исследована в контексте иммунных нарушений и инфекционных заболеваний с использованием ряда различных методов модификации генов (рис. 1).



Fig 1 Schematics representing the different targets and platforms for T cell gene therapy approaches. (Top) T cell scheme demonstrating current T cell-dependent targets of immunodeficiency and corresponding treatment platforms with either vector-based gene therapy, chimaeric antigen receptor (CAR)-T cell therapy or gene editing. (Bottom) Key modes of gene-editing technology including Transcription activator-like effector nuclease (TALENS) with enhanced modularity and DNA-binding domains (DBD) and the CRISPR/Cas9 system.

a href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/bjh.17070#bjh17070-tbl-0001">

Table I. List of immunodeficiency diseases and associated T cell directed treatment platforms with zinc finger nucleases (ZFN), transcription activator-like effector nucleases (TALEN), gamma and alpha retroviral (GRV/ARV) and lentiviral (LV)-mediated therapies - previous clinical trials and current preclinical studies.

Ген-модифицированная Т-клеточная терапия приобрела огромный интерес в последние несколько лет после успешного лечения пациентов со злокачественными В-клеточными опухолями с помощью терапии c химерными антигенными рецепторами (CAR) Т-клетками. Однако концепция Т-клеточной иммунотерапии зародилась несколько десятилетий назад и с тех пор постепенно совершенствовалась и применялась для лечения целого ряда заболеваний, включая инфекционные заболевания, злокачественные опухоли и иммунные нарушения. Эволюция началась в 1980-х годах с введения донорских лимфоцитов, затем появились генно-модифицированные периферические лимфоциты, опухоль-инфильтрирующие лимфоциты, вирус-специфические цитотоксические Т-клетки^{4, 5} и CAR-T-клетки; однако это не исчерпывающий список стратегий, которые продвинулись до клинического применения.⁷ Каждый вариант модифицированной Т-клеточной терапии был критически важным для нашего обучения и позволил улучшить протоколы, адаптированные к отдельным условиям на основе необходимости сохранения или повышения эффективности, обеспечивая при этом повышенные характеристики безопасности как модифицированных клеток, так и клинических протоколов. Примеры включают "переключатели безопасности" или гены самоубийства, искусственно преобразованных специфических популяций Т-клеток, добавление подготовительной лимфодеплеции, а также управление и предотвращение побочных эффектов.^{8, 9}.

До сих пор было доказано, что только генотерапия HSC ex vivo обеспечивает устойчивый терапевтический эффект при конкретных первичных иммунодефицитах; в настоящее время нет достаточных клинических данных, чтобы продемонстрировать эффективность Т-клеточного подхода при любом наследственном заболевании. Трансдукция HSC обеспечивает коррекцию всех гемопоэтических линий, включая миелоидный компартмент, который необходим при многих PIDs, таких как синдром Вискотта-Олдрича и хроническая гранулематозная болезнь, а коррекция CD34+ клеток обеспечивает долговечность лечения за счет модификации самообновляющихся предшественников. Однако при ряде PIDs дисфункция наблюдается только в Т-клеточном компартменте, поэтому коррекция этого компартмента может дать терапевтическую возможность с преимуществами перед более классическим подходом с использованием HSC. Действительно, некоторые состояния оказались непригодными для генотерапии HSC, поскольку устойчивая экспрессия во всех гемопоэтических линиях привела к лимфопролиферации.¹⁰ Передача ген-модифицированных Т-клеток была доказана как безопасная в предыдущих клинических испытаниях при тяжелом комбинированном иммунодефиците (SCID) и иммунотерапии, и до сих пор не было зарегистрировано никаких инсерционных мутагенных событий. Способ действия аутологичных Т-клеток также требует значительно меньше подготовительной химиотерапии, чем процедура HSC, что ассоциирует с меньшей токсичностью. Тем не менее, персистенция Т-клеток in vivo остается вопросом без ответа в контексте иммунодефицита, который, надеемся, будет решен в ближайшие годы.

Тяжелый комбинированный иммунодефицит с недостаточностью аденозиндезаминазы (ADA-SCID) был одним из первых заболеваний-мишеней после открытия в 1990-х годах технологии создания Т-клеток с помощью вирусных векторов.¹¹ При ADA-SCID у пациентов отсутствуют Т-, В- и NK-клетки, что приводит к нарушению гуморального и адаптивного иммунитета, делая пациента восприимчивым к опасным для жизни инфекциям с раннего возраста.

ADA - это фермент спасения пуринового пути¹² , который повсеместно экспрессируется во многих типах тканей, и поэтому могут наблюдаться такие системные проявления, как потеря слуха, заболевания легких и задержка развития.^13,14 Отсутствие фермента приводит к накоплению токсичных метаболитов, что крайне негативно сказывается на развитии лимфоцитов, и именно иммунодефицит, связанный с этим состоянием, является фатальным, если его не лечить. За три десятилетия было разработано множество вариантов лечения, позволяющих как справиться с ADA-SCID, так и вылечить его. Варианты лечения включают заместительную ферментную терапию (ERT) с использованием PEGylated ADA, вводимого раз в две недели путем внутримышечных инъекций, что обеспечивает метаболическую детоксикацию и часто некоторое восстановление иммунитета. ERT используется для стабилизации состояния пациентов перед окончательным лечением, но считается непригодным для долгосрочного использования из-за ослабления иммунного восстановления со временем и высокой стоимости лечения.^{15, 16}

Как и для большинства первичных иммунодефицитов, аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HSCT) может предложить лечебную терапию с очень хорошими показателями выживаемости в контексте HLA-совместимых семейных доноров; однако исторически сложилось так, что результаты были хуже при использовании неродственных или несовместимых доноров.¹⁸ Плохие результаты после HSCT с использованием не-HLA-идентичных трансплантатов привели к развитию аутологичной генной терапии ex vivo в качестве альтернативного варианта лечения пациентов, у которых нет подходящего донора для трансплантации. Использование аутологичных клеток устраняет риск аллореактивности и позволяет использовать менее токсичные режимы кондиционирования, что дает ряд преимуществ перед HSCT от несовпадающих доноров.

Первый подход к генотерапии ADA-SCID был фактически стратегией аутологичных ген-модифицированных Т-клеток. В 1990-х годах группы из Бетесды, Милана и Японии использовали аутологичные лимфоциты периферической крови пациентов (PBLs ) для модификации генов ADA ex vivo с помощью гамма-ретровирусных векторов первого поколения. Миланская группа включала добавление предшественников костного мозга в попытке улучшить приживление ген-модифицированных донорских клеток, а также один пациент из группы Бетесда обнаруживал ген-откорректированные гемопоэтические стволовые клетки примерно через два года после PBL генотерапии для повышения эффективности. Данные этих испытаний, в которых не использовалось кондиционирование, продемонстрировали сохранение циркулирующих ген-модифицированных Т-клеток даже через 10 лет после генотерапии^{19, 20} со скромными улучшениями в антиген-зависимых реакций и в уровнях активности ADA.^{24, 26, 28} Анализ Т-клеток пациентов с течением времени выявил интересную информацию о терапевтическом потенциале этого подхода. У большинства пациентов восстановление функции Т-клеток проявлялось в сопоставимой продукции цитокинов при стимуляции или пролиферативном ответе через несколько лет после генотерапии. Более того, у некоторых пациентов был продемонстрирован поликлональный репертуар Т-клеточного рецептора (TCR) Vβ. Ретроспективный анализ клеток периферической крови четырех пациентов, получавших генотерапию с помощью PBL через 10-12 лет после последнего введения, показал наличие значительного количества центральных CD8⁺ Т-клеток памяти (CD8⁺CD45RA⁺CD62L⁺) и относительное обогащение популяции стволовых клеток памяти (CD45RA⁺CD62L^-CD95⁺), предположительно ответственных за постоянное образование и сохранение ген-маркированных Т-клеток. Эти результаты подтверждают идею о том, что подход генотерапии с помощью Т-клеток может обеспечить клинически значимую долгосрочную пользу для пациентов с определенными заболеваниями.^{27, 30, 31}.

Последующие клинические испытания генной терапии ADA-SCID были направлены на коррекцию гемопоэтических предшественников (CD34⁺ HSCs) с использованием гамма-ретровирусных и лентивирусных векторов для переноса корректирующих копий кДНК ADA.^{32, 33} Успех генотерапии при этом заболевании был настолько высок, что уже имеется лицензированный терапевтический препарат на основе гаммаретровируса (Strimvelis®), а продолжающиеся клинические испытания лентивирусной генной терапии показывают многообещающие результаты.^{19, 34-36}.

Ряд первичных иммунодефицитов возникает преимущественно из-за дефектов в Т-клеточном компартменте, поэтому коррекция популяции Т-клеток может облегчить клинические проявления ряда таких состояний, как дефицит CD40L, синдром IPEX (иммунная дисрегуляция, полиэндокринопатия, энтеропатия, Х-сцепленная), Х-сцепленная лимфопролиферативная болезнь, дефицит CTLA4 и мутации потери и усиления функции STAT1.

Лиганд CD40 (CD154) экспрессируется на Т-клетках после активации TCR и связывается с CD40 антигеном на антиген-презентирующих клетках, включая макрофаги, что приводит к активации макрофагов. Его основное взаимодействие происходит с В-клетками, где после распознавания антигена связывание приводит к пролиферации В-клеток, рекомбинации переключателей классов, созреванию антител и генерации ответов долговременной памяти. Дефицит CD40L является основной причиной Х-сцепленного синдрома гипер-IgM, при котором пациенты страдают от рецидивирующих и условно-патогенных инфекций (в частности, Pneumocystis jiroveci и Cryptosporidia spp.), нейтропении, аутоиммунитета, заболеваний печени и повышенного риска развития злокачественных опухолей.³⁷ При нормальном или повышенном уровне IgM обнаруживается низкий уровень IgG, A и E. Лечение включает профилактику ко-тримоксазолом, заместительную терапию иммуноглобулинами и granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) для лечения нейтропении, но HSCT обычно считается лечебной. По последним данным, общая выживаемость после HSCT составляет 78% через пять лет после трансплантации, а выживаемость без событий - 58%.³⁸ Опять же, результат улучшается при использовании подходящего донора из числа братьев и сестер и отсутствии повреждения органов до HSCT.

Дефицит CD40L был ранней мишенью для генотерапии Т-клеток, поскольку попытки коррекции гематопоэтических предшественников с помощью конститутивных промоторов привели к лимфопролиферации Т-клеток в мышиных моделях.³⁹ Вскоре после этого было сообщено о восстановлении экспрессии в Т-клетках с помощью ретровируса и лентивируса, использующего long-terminal repeats (LTRs) для стимулирования экспрессии CD40L, но улучшение экспрессии не привело к улучшению функции Т-клеток.¹⁰. Спустя десятилетие Romero et al. описали успешную трансдукцию CD4+ Т-клеток с помощью само-инактивирующегося лентивирусного вектора с кДНК CD40L под транскрипционным контролем участка в 1,3 Кб эндогенного промотора CD40L. Трансдуцированные CD4-клетки пациентов продемонстрировали почти физиологический паттерн экспрессии CD40L с повышенной экспрессией при активации и последующим снижением.⁴⁰

Учитывая необходимость точной экспрессии CD40L, новые методы редактирования генов обеспечивают такую точность; возможность целенаправленной коррекции нативного локуса CD40L должна позволить контролировать исправленный ген эндогенным промотором и другими регуляторными элементами. Hubbard et al. использовали платформу TALEN (Transcription Activator-like effector nuclease) для целенаправленного на место начала трансляции в экзоне 1 гена, создавая разрыв двойной цепочки, который может быть восстановлен путем гомологичной рекомбинации с корректирующей копией кДНК CD40L, представленной в адено-ассоциированном вирусе (AAV). ⁴¹ Сообщалось о частоте редактирования до 35% в CD4+ Т-клетках пациентов, которые правильно экспрессировали CD40L при активации Т-клеток и индуцировали рекомбинацию переключения классов в В-клетках и образование IgG в анализе in vitro. Исправленные Т-клетки стабильно приживлялись в организме мышей с диабетом и тяжелым комбинированным иммунодефицитом (NOD-SCID) гамма (NSG), демонстрируя восстановление селезеночных CD4+ Т-клеток с физиологическим профилем экспрессии CD40L. Репертуар TCRV не показал различий между отредактированными и не отредактированными Т-клетками пациентов. По результатам предварительного анализа, не было выявлено никакого редактирования вне мишени. Область редактирования генов продолжала расширяться. Вскоре после того, как лаборатория Kohn подтвердила правильность подхода TALEN, они применили систему CRISPR/Cas9 для лечения этого заболевания как в Т-клетках, так и в HSCs. Группа сравнила доставку рибонуклеопротеина (РНП), когда направляющая гид РНК предварительно соединяется с белком Cas9, с доставкой мРНК в присутствии как направляющей гид РНК, так и нуклеазы Cas9. Для доставки корректирующей матрицы снова использовался донор AAV6. Отредактированные Т-клетки пациента продемонстрировали нормальную экспрессию CD40L и восстановление функции, измеряемую связыванием CD40-muIg при проточном цитометрическом анализе.⁴² Геномное профилирование и анализ Guide-seq не выявили никакой активности вне мишени в клетках K562. Хотя ни одна из этих стратегий не нашла применения в клинике, они обеспечивают доказательство концепции редактирования генов как возможного варианта лечения этой группы пациентов.

Регуляторные Т-клетки (T_reg) представляют собой подмножество CD4+ Т-клеток, которые играют важную роль в иммунной модуляции и поддержании толерантности. У пациентов с синдромом IPEX нарушен ген, кодирующий T_reg-специфический фактор транскрипции forkhead box P3 (FOXP3), что приводит к системным угрожающим жизни поли-аутоиммунным проявлениям из-за дисфункции выведенных из тимуса CD4⁺FOXP3⁺ регуляторных Т-клеток (tT_reg). ^{43, 44} Хотя это подмножество может присутствовать на периферии у пациентов с IPEX в нормальном количестве, дефект функционирования FOXP3 приводит к нарушению периферической толерантности к клеткам собственного организма и считается основной и прямой причиной аутоиммунитета у пациентов с IPEX.^{43, 45} Характерными признаками заболевания являются энтеропатия с тяжелой диареей, хронический дерматит и аутоиммунные эндокринопатии, обычно включающие раннее начало инсулинозависимого сахарного диабета, тиреоидит и аутоиммунные цитопении.⁴⁶ Пациенты часто поступают в неонатальный период, и ведение заболевания является сложной задачей. Иммуносупрессия является основным методом лечения, часто требующим нескольких линий терапии, включая стероиды, ингибиторы кальциневрина, микофенолат мофетил и ингибиторы mTOR.⁴⁶ HSCT может быть целебной, а показатели поражения органов (ПОО) от HSCT предсказывают исход⁴⁷; более высокие показатели ПОО связаны с худшим исходом. В серии из 58 пациентов, получивших HSCT, общая выживаемость составила 73% к 15 годам, а осложнения, связанные с токсичностью трансплантации, множественные инфекции и болезнь трансплантат против хозяина (GVHD), были обычными. Восьми пациентам потребовалось более одной процедуры (в 53% случаев трансплантации использовалось кондиционирование сниженной интенсивности). Смешанный химеризм был зарегистрирован у 31 из 53 оцениваемых пациентов с рецидивом симптомов, связанным с низким уровнем химеризма. Однако у некоторых пациентов со смешанным химеризмом T_reg-клетки были ра 100% донорского происхождения, что свидетельствует о преимуществах выживания этой популяции, а коррекция T_reg компартмента оказалась достаточной для контроля над заболеванием.^{47, 48} Выживаемость пациентов, получавших только иммуносупрессию, оценивалась в 65% в 24 года, но такой подход к лечению не предотвращал прогрессирования заболевания или развития повреждения органов.⁴⁷

Благодаря природе и функции гена, участвующего в патогенезе IPEX, его можно рассматривать как идеальную мишень для иммунотерапии на основе Т-клеток. Моногенная природа IPEX, приводящая к аутоиммунитету с единственной популяцией дефектных клеток, открывает возможности для более прямого и целенаправленного терапевтического подхода. Поэтому были проведены исследования по адоптивному переносу T_reg с использованием мышиной модели IPEX FoxP3mut (scurfy). Одно из первых исследований, направленных на изучение патофизиологии синдрома IPEX, включало коррекцию фенотипа мыши scurfy - мышиной модели IPEX. Адоптивный перенос T_reg-клеток дикого типа (CD4⁺CD25⁺) контролировал симптомы, тогда как перенос CD4⁺CD25^- клеток этого не делал, это подчеркивает важность и иммунорегулирующую способность популяции T_reg в этой модели заболевания. На основании этих результатов различные группы избыточно экспрессировали FOXP3 в CD4⁺ T-клетках от здоровых доноров для генерации T_regs de novo с помощью лентивирусных методов добавления генов.^{49, 50} У женщин-носительниц одного мутантного аллеля FOXP3 обычно имеются две различные популяции T_reg (функциональная и дисфункциональная по FOXP3); однако они сохраняют полностью функцию T_reg, что приводит к предположению, что введение аутологичных исправленных клеток не должна конкурировать с нефункциональными клетками.^{51, 52} Чтобы изучить потенциал ex vivo генерируемых CD4⁺FOXP3⁺ T_reg-подобных клеток, Стэнфордская группа (Passerini et al.) исследовала эту популяцию в воспалительной среде.⁵³

Что касается пластичности, то генерируемые in vitro T_reg-клетки рискуют потерять супрессивную способность in vivo, поскольку они превращаются в эффекторные T-клетки. В частности, это вызывает серьезную озабоченность при IPEX. Однако продукция цитокинов (Th1 и Th2) оставалась низкой, а экспрессия FOXP3 стабильной при активации in vitro в условиях воспаления, что свидетельствует о том, что CD4⁺FOXP3⁺ T_reg клетки сохраняют характеристики T_reg. Авторы предполагают стабильный регуляторный эффект в текущих реакциях и предполагают, что генерируемые нативные CD4⁺FOXP3⁺ T_reg клетки более стабильны и обладают более глубокой супрессивной функцией по сравнению с CD4⁺FOXP3⁺ T_reg клетками памяти, что указывает на регуляторную функцию в антиген-независимой манере.^{54, 55}

Авторы также продемонстрировали мощную супрессивную активность как in vitro, так и in vivo, используя ксенотрансплантационную модель GVHD. Они вызвали летальную GVHD у NSG или у предварительно кондиционированных мышей NOD-SCID путем инъекции аллогенных CD4⁺ Т-клеток. Совместное введение CD4⁺FOXP3⁺ T_reg клеток предотвратило развитие GVHD и привело к выживанию 75% всех животных. Интересно, что CD4⁺FOXP3⁺ T_reg-клетки, полученные путем трансдукции нативных Т-клеток, показали более высокую стабильность экспрессии трансгенов по сравнению с полученными из CD4⁺FOXP3⁺ T_reg-клеток памяти. Пролиферативная способность Т-эффекторных клеток и продукция цитокинов, часто ассоциируемая с отторжением после трансплантации, были значительно снижены. Кроме того, T_reg-подобные клетки были способны экспрессировать FOXP3 в устойчивом состоянии во время активного воспаления, при котором они сохраняли супрессивную способность и типичный профиль секреции цитокинов.⁵³ Более того, было показано, что FOXP3-мутированные CD4+ T-клетки могут быть эффективно трансдуцированы двунаправленным лентивирусным вектором, управляемым конститутивным промотором (LV-EFIa-FOXP3), а успешно трансдуцированные CD4⁺FOXP3⁺ T_reg-клетки приобретают фенотип, сравнимый с T_reg-клетками здорового контроля. Остается серьезной проблемой, будут ли ген-модифицированные CD4+FOXP3+ T_reg поддерживаться in vivo и не приведут ли эти клетки к нежелательной генерализованной иммуносупрессии.^{52, 54} Парижская группа исследовала слегка модифицированную модель мышей scurfy, где иммуносупрессия использовалась для обеспечения выживания мышей с целью спасения с помощью пересаженных T_reg. Они также использовали двунаправленный лентивирусный вектор с FOXP3, управляемый промотором EF1, с CD4+ Т-клетками. Предварительные исследования in vivo показали схожие результаты выживаемости мышей, получавших ген-модифицированные CD4+ T-клетки, по сравнению с мышами, получавшими T_regs дикого типа. Клиническая оценка также показала улучшения со временем у тестируемых животных после начала заболевания. Что особенно важно, устойчивая и стабильная экспрессия FOXP3 была продемонстрирована в способствующему воспалительном контексте.⁵⁵

Х-сцепленное лимфопролиферативное заболевание (XLP) возникает в результате мутаций в гене SH2D1A, кодирующем signalling lymphocytic activation molecule (SLAM)-associated protein (SAP), внутриклеточный адаптерный белок, экспрессируемый в Т-, NK- и NKT-клетках и критически важный для нормальной иммунной функции. SAP служит молекулярным переключателем, позволяющим членам семейства SLAM действовать как активирующие или ингибирующие рецепторы (в присутствии и отсутствии SAP соответственно)^{56, 57}, тем самым функционируя как ключевой регулятор зависимых от Т-клеток реакций. Дефицит приводит к нарушениям цитотоксичности NK-клеток, развитию NKT-клеток и гуморальному иммунитету через дисфункцию T follicular helper (T_FH). Клинически пациенты могут иметь целый ряд проявлений, связанных с иммунной дисрегуляцией и цитотоксическими дефектами. До 50% пациентов также демонстрируют ряд гуморальных иммунных аномалий - от ухудшения реакции на вакцины до генерализованной гипогаммаглобулинемии. Почти у трети пациентов развивается лимфома, причем наиболее распространенной формой является абдоминальная В-клеточная неходжкинская лимфома как у EBV+, так и у EBV^- пациентов.^{57, 58} Однако haemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH) является наиболее распространенным и летальным проявлением, как правило, возникающим в раннем детстве и связанным со значительной смертностью.^{57, 59, 60} Общая смертность значительно снизилась со времени первых сообщений, с 75% до 29%,57 в основном благодаря усовершенствованным протоколам химиотерапии и HSCT, а также улучшенному мониторингу и поддерживающей терапии. Однако пациенты, которым диагноз был поставлен при рождении на основании семейного анамнеза, по-прежнему подвержены риску значительной смертности, несмотря на тщательное наблюдение. HSCT является лечебным методом, но результат зависит от хорошо подобранного донора и контроля заболевания на момент трансплантации, при этом выживаемость снижается примерно до 50% в случае несоответствующего донора и активного HLH.⁵⁷

Доказательство концепции генотерапии было впервые установлено Rivat et al. ⁶¹ с использованием лентивирусного вектора второго поколения, содержащего эндогенный человеческий промотор фактора элонгации 1 альфа (EFS) для запуска кодон-оптимизированной экспрессии гена SAP. Мышиная модель SAP-/- была спасена путем пересадки гемопоэтических предшественников с исправленным геном, что привело к восстановлению NK и зависимой от CD8+ T-клеток цитотоксичности, развитию NKT клеток наряду с формированием зародышевого центра и гуморальной функции при иммунологическом вызове.

Хотя в этих исследованиях не наблюдалось никаких негативных последствий конститутивной экспрессии SAP, SAP - это жестко регулируемый сигнальный белок, который экспрессируется не во всех гематопоэтических клонах, включая стволовые клетки. Поэтому может быть предпочтительнее избегать избыточной экспрессии SAP в клонах, где экспрессия ограничена. Была проведена дальнейшая работа по оценке функциональности использования промоторов, специфичных для конкретной линии, включая эндогенный промотор SAP, для стимулирования экспрессии в нужных лимфоидных компартментах (неопубликовано). Хотя предварительные данные продемонстрировали клональное ограничение экспрессии SAP периферическими компартментами, общее функциональное восстановление гуморального иммунитета и цитотоксичности было слабым.

Поэтому были предприняты усилия по устранению непосредственно зависимых от клинических проявлений в Т-клетках XLP1 с помощью адоптивной трансплантации Т-клеток с коррекцией генов у SAP-дефицитных мышей и восстановлением функции Т-клеток пациентов in vitro.⁶² Здесь Panchal et al. продемонстрировали in vivo и in vitro, что коррекция гуморальных и цитотоксических дефектов в SAP-дефицитной мышиной модели достигается путем трансплантации SAP-откорректированных Т-лимфоцитов. Мы наблюдали полное восстановление функционального гуморального иммунитета после Т-клеточно-зависимой провокации антигенами посредством формирования зародышевых центров и специфических ответов антител, которые отсутствовали у SAP-дефицитных животных. Функциональная коррекция клеток T_FH пациентов in vitro также продемонстрировала значительно улучшенные профили секреции IL-21 и иммуноглобулинов при сохранении профиля ген-откорректированных клеток T_FH пациентов XLP1 при культивировании с IL-6, IL-7 и IL-21; цитокины были выбраны на основе их роли в дифференцировке и поддержании популяции клеток T_FH.^{62, 63} Мы наблюдали восстановление цитотоксичности после лентивирусного переноса гена SAP в CD8+ CTLs пациентов, что может быть важным для профилактики и лечения HLH и лимфопролиферативных осложнений. Мы наблюдали функциональное улучшение в анализах цитотоксичности in vitro и в модели опухоли лимфомы NSG мышей, инфицированных лимфобластоидной клеточной линией вируса Эпштейна-Барр (EBV-LCL). CTLs, у откорректированных по генами пациентов, были способны убивать EBV+ клетки-мишени и вызывать регрессию опухоли на том же уровне, что и CTL здоровых доноров. В совокупности эти результаты позволяют предположить, что генотерапия Т-клетками может принести значительную клиническую пользу пациентам с XLP1, имеющим как клеточные, так и гуморальные нарушения.

Долгосрочная персистенция аутологичных ген-модифицированных Т-клеток и, следовательно, длительность клинического эффекта также еще предстоит определить. Наряду с данными о сохранении ген-модифицированных Т-клеток, полученными в ходе предыдущих клинических испытаний,²¹ в настоящее время установлено, что определенные подмножества Т-клеток способны поддерживать Т-клеточный компартмент, а именно stem cell-like memory T cells (T_SCM) и central memory (T_CM) клетки.⁶⁴ Panchal et al. сообщили о сохранении ген-откорректированных нативных клеток наряду с фенотипами T_SCM и T_CM после лентивирусной трансдукции и экспансии, что поддерживает идею о том, что SAP \-откорректированные клетки пациентов могут сохраняться. В настоящее время этот подход переводится на клинические испытания.

HLH - это опасное для жизни заболевание, характеризующееся гипервоспалением в результате иммунной дисфункции и дисрегуляции. HLH может быть классифицирован как первичный или вторичный, но обе формы приводят к тяжелым, системным воспалительным симптомам и повреждению тканей из-за неконтролируемой активации и пролиферации лимфоцитов и антиген-презентирующих клеток с массивной гиперпродукцией цитокинов. Было описано пять форм семейного HLH (генетические заболевания, при которых преобладающим проявлением является HLH), которые называются семейный HLH (FHL) 1-5, и все выявленные мутации (в FHL 2-5 соответственно) включают белки на пути грануло-опосредованной цитотоксичности. Некоторые другие генетические заболевания имеют общие проявления с HLH. В настоящее время лечение сосредоточено на контроле процесса заболевания с помощью тяжелой иммуносупрессии до перехода к HSCT, при этом результат может быть различным.⁶⁵ Недавно были испытаны или даже лицензированы биологические агенты для лечения HLH ещё до HSCT, предлагая потенциально менее токсичную и более целенаправленную терапию. Аутологичная генотерапия Т-клеток исследуется для двух форм FHL, где она может стать мостом к окончательному излечению или обеспечить более долгосрочную терапию, если будет достигнуто сохранние ген-откорректированного компартмента Т-клеток.

PRF1 кодирует перфорин, белок, содержащийся в гранулах экзоцитоза , который при контакте с клеткой-мишенью высвобождаются в иммунологические синапсы. Там перфорин образует поры на поверхности этих клеток-мишеней и позволяет гранулам проникать в цитоплазму, что приводит к гибели клетки путем запуска апоптотических путей. Мутации в PRF1 составляют до 58% случаев FHL в зависимости от этнической принадлежности.^{66, 67} Предыдущие работы показали, что защита от FHL и гиперцитокинемии может быть скорректирована путем адоптивного переноса CD8+ Т-клеток дикого типа.⁶⁸

Параллельно с использованием стволовых клеток, Ghosh et al. также продемонстрировали, что трансплантация ген-откорректированных CD8+ T клеток приводит к коррекции цитотоксичности in vitro и in vivo.^{69, 70} Они использовали разработанный бицистронный гамма-ретровирусный вектор для трансдукции мышиных CD8+ T клеток в мышиной модели prf^-/- Предварительная стимуляция цитокинами мышиных Т-клеток prf^-/-, необходимая для эффективной трансдукции, привела к появлению более дифференцированного фенотипа CD8+ Т-клеток, состоящего из клеток T_CM и T_EM. Однако эффективное приживление и функциональное восстановление цитотоксичности in vitro наблюдалось после внутривенного введения ген-откорректированных prf^-/- CD8+ Т-клеток мышам prf^-/- Высвобождение IFN-γ на CD8+ Т-клетках мишенях привело к снижению уровня IFN-Y у обработанных мышей по сравнению с отрицательным контролем. Функциональная коррекция in vivo была дополнительно проверена на двух моделях. В мышиной модели опухоли карциномы легких, экспрессирующей эпитоп GP33 вируса хориоменингита лимфоцитов (LCMV), генно-корректированные CD8+ Т-клетки были способны эффективно устранять опухоль после инъекции prf^-/- мышам и вызывать реакции опухоли, в то время, когда у животных, получавших трансдуцированные клетки, наблюдалась летальная опухолевая прогрессия. Наконец, в данном исследовании трансдукция CD8+ Т-клеток была реализована на модели prf^-/- LCMV, которая, как известно, демонстрирует клинический фенотип HLH у мышей при заражении вирусом. Мыши Prf^-/-, трансплантированные скорректированными по гену CD8+ Т-клетками от мышей prf^-/-, продемонстрировали полную защиту от фенотипа HLH после заражения LCMV. В то время как в отрицательном контроле наблюдалась гиперцитокинемия с повышенным уровнем IFN-γ, экспансия CD8+, анемия, прогрессирующая потеря веса с последующим ухудшением выживаемости, мыши, получавшие ген-модифицированные CD8 Т-клетки, демонстрировали аналогичный значительно улучшенный клинический фенотип с меньшей иммунной дисрегуляцией, подтвержденной гистопатологическим анализом, как и мыши, получавшие CD8 Т-клетки дикого типа. Эти данные были также дополнены коррекцией in vitro дефектов цитотоксичности в образцах мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) пациента с дефицитом перфорина с помощью клинически применимого лентивирусного вектора, содержащего корректирующую кДНК PRF.⁷⁰

FHL3, на долю которой приходится 30-40% случаев FHL, вызывается мутациями в гене UNC13D (кодирующем белок Munc13-4).⁶⁶ В цитотоксических CD8+ Т- и NK-клетках Munc13-4 способствует запуску (праймингу) перфорин-содержащих секреторных гранул в эффекторной клетке до слияния с клеточной мембраной в иммунологическом синапсе. Мутации в этом гене нарушают секрецию цитолитических белков, таких как гранзимы, в клетку-мишень, что в конечном итоге приводит к дефекту цитотоксичности с клинической картиной HLH.^{67, 71}.

Исследования, проведенные лабораторией Cavazzana в Париже, изучали эффективность переноса корректирующего гена в Т-клетки пациентов с FHL3.⁷² Используя подход генотерапии Т-клетками, аналогичный описанному для дефицита перфорина, было получено доказательство концепции с использованием моделей in vitro и in vivo по восстановлению цитотоксичности Т-клеток. Была исследована платформа лентивирусного вектора, псевдотипированного гликопротеинами H и F вируса кори (H/F-LV), и проведено сравнение с более широко используемой оболочкой вируса везикулярного стоматита-G (VSV-G-LV), содержащей корректирующую копию кДНК Munc13-4 человека, для определения эффективности трансдукции в предварительно стимулированных клетках пациентов перед адоптивной передачей в мышиную модель лимфомы, вызванной EBV, на иммунодефицитном фоне NSG.

Более высокие уровни трансдукции были зарегистрированы в Т-клеточных компартментах, включая популяцию клеток T_SCM, при использовании H/F-LV по сравнению с VSV-G-LV, с общим повышением уровня мРНК Munc13-4 в основной массе трансдуцированных PBMCs. Способность к дегрануляции была восстановлена в CD8+ Т-клетках, трансдуцированных Munc13-4-H/F-LV, о чем свидетельствует экспрессия CD107a после TCR стимуляции. После введения Т-клеток, скорректированных по гену, наблюдалась значительная регрессия опухоли на модели опухоли NSG, трансплантированной EBV-BLCL-ксенотрансплантатом, что продемонстрировало цитотоксичность in vivo со средней эффективностью трансдукции 55%.⁷²

Dettmer et al. исследовали использование альтернативных, клинически значимых векторных платформ для коррекции этого заболевания. Они сравнили использование альфа-ретровирусного вектора (полученного из sarcoma leucosis птиц ) с гамма-ретровирусным вектором (полученным из вируса лейкемии мышей). Оба вектора имеют самоинактивирующуюся (SIN) конфигурацию и содержат широко используемый промотор EFS, обеспечивающий кодон-оптимизированную экспрессию трансгена UNC13D. Они демонстрируют сопоставимые титры продукции для обеих конструкций; однако, поскольку альфа- и гамма-вирусы заражают только делящиеся клетки, клетки были предварительно активированы с помощью стандартных протоколов активации Т-клеток до трансдукции, где они сообщают о высокой эффективности трансдукции (74% против 93% соответственно) в объемных PBMC от пациентов через три дня после трансдукции. В целом, это привело к восстановлению экспрессии белка Munc13-4 и последующей способности Т-клеток к дегрануляции, а также к восстановлению in vitro способности EBV-специфических CTL к цитотоксичности и нормализации высвобождения гранзима при стимуляции CTL. В целом, поскольку альфа- и гамма-ретровирусные векторы являются клинически применимыми и использовались в X-SCID и CAR-T клеточной терапии^{73, 74}, эти данные доказазывают концепцию Т-клеточной генотерапии для fHLH3 в качестве подготовки к трансплантации⁷⁵.

Принимая во внимание потенциальные ограничения, связанные с использованием ретровирусных векторов, которые способны эффективно трансдуцировать только делящиеся клетки, недавнее исследование, опубликованное Takushi et al.⁷⁶, продемонстрировало восстановление с помощью лентивируса экспрессии и функциональности белка Munc13-4 в Т-клетках, полученных от пациентов (наряду с HSCs, полученными из аналогичной мышиной модели Jinx). После тестирования различных промоторных элементов, включая промотор мышиного вируса MND, SIN-LV, содержащий промотор EFS и кодон-оптимизированный трансген UNC13D, показал наиболее благоприятные результаты в активированных Т-клетках пациентов и восстановил дегрануляцию in vitro. Цитотоксическая функция FHL3-трансдуцированных клеток оценивалась с помощью протокола двойной трансдукции, который включал трансдукцию одной популяции клеток-мишеней как EFS-UNC13D, так и конструкцией CAR человеческого тромбопоэтина (TPO). Эта стратегия была реализована, поскольку образцы пациентов FLH3 были EBV-негативными и трансдукция терапевтической конструкцией EFS-UNC13D приводила к восстановлению цитотоксичности, а конструкция TPO CAR позволяла распознавать клетки, экспрессирующие рецептор тромбопоэтина (MPL). С помощью конкурентных анализов репопуляции группа установила, что дегрануляция достигает уровня дикого типа с 15% периферических клеток дикого типа в модели Jinx; это реальная цель для генотерапии Т-клетками, и хотя эта работа была сосредоточена на HSC подходе, было высказано предположение, что Т-клетки с генной коррекцией могут предложить терапевтический вариант для уменьшения воспаления перед HSCT.⁷⁶

Сбор аутологичных гиперактивированных Т-клеток для генной модификации и повторного введения с целью достижения ремиссии при HLH, вероятно, останется серьезной проблемой. Очень важно понять, сохранятся ли вводимые Т-клетки и не истощатся ли они, чтобы противостоять вирусам в долгосрочной перспективе. Современные целевые антицитокиновые стратегии, такие как эмапалумаб и руксолитиниб, сохраняя фракцию Т-клеток, могут быть использованы в качестве дополнения к успешному набору, уменьшая состояние избыточного воспаления и активированных Т-клеток. При большинстве генетических заболеваний необходимый уровень приживления и коррекции еще не установлен и ответ на этот вопрос может быть получен только в ходе клинических испытаний. Однако в исследованиях на мышиной модели перфорина приживление 10-20% функционально скорректированного перфорина или донорских клеток обеспечивало защиту от HLH.⁶⁸ Данные, полученные из когорт HSCT, позволяют предположить, что уровень менее 20% может обеспечить защиту и людей.