RNAi - это естественный, пост-транскрипционный, специфический для последовательности механизм замалчивания активности, вызываемого в ответ на двухнитевую РНК (dsRNA).²⁵ Общий механизм RNAi включает расщепление длинных dsRNA эндонуклеазой Dicer с последующим образованием отдельных фрагментов РНК. Направляющие нити этих фрагментов РНК, считаются RNAi молекулами, они включаются в RNA-induced silencing complex (RISC) для содействия эндонуклеолитическому расщеплению гомологичной мРНК РНКазой Argonaute 2 (рис. 1).



FIG 1 General mechanism of RNA interference (RNAi). DICER endonuclease cleaves double-stranded RNA (dsRNAs) and generates single RNA strand (siRNA or miRNA). The RNAi strand is loaded into the RNA-induced silencing complex (RISC) and represses translation through cleavage of the target mRNA by the RNase Argonaute 2 (AGO2). Once cleaved, the mRNA cannot be translated, and the levels of the target proteins are reduced (the figure is contextualized to the expanded proteins in polyglutamine [PolyQ] ataxias). TRBP, transactivation response element RNA-binding protein. [Color figure can be viewed at wileyonlinelibrary.com]

Процесс RNAi опосредуется тремя функционально различными dsRN не кодирующими молекулами: (1) микроРНК (miRNAs), (2) small interfering RNAs (siRNAs) и (3) short hairpin RNAs (shRNAs).^{5, 26, 27} Хотя эти молекулы различаются по своему клеточному биогенезу, они сходятся в один и тот же путь RNAi.²⁸

MiRNAs могут быть естественного или синтетического происхождения. Их биогенез начинается с ядерной транскрипции первичного предшественника miRNAs с последующим расщеплением до шпилевидных пре-miRNAs под действием РНКазы III Drosha. Позже эти пре-miRNAs экспортируются в цитоплазму, где они подвергаются окончательному расщеплению до miRNAs под действием Dicer и включаются в RISC.²⁹ Химически синтезированные miRNAs усиливают регуляцию природных miRNAs, имитируя высокий уровень экспрессии этих эндогенных молекул.³⁰

В отличие от природных miRNAs, siRNA имеют синтетическое происхождение и после доставки в клетки с помощью вирусных или невирусных систем,²³ попадают непосредственно в RISC.³¹ В отличие от них, shRNA производятся в ядре, но считаются экзогенными. Их синтез направляется синтетическими ДНК-векторами, трансфицированными в клетки путем доставки плазмид, вирусных векторов (лентивирус или c аденовирусом-ассоциированный вирус [AAV]) или бактериальных векторов.^{32, 33} Поскольку трансген интегрируется в геном хозяина, то shRNAs производятся в течение длительного периода времени, чтобы иметь устойчивый эффект.^{31, 34}

Степень комплементарности оснований с мРНК мишени определяет результат подавления каждой молекулы RNA. Поскольку siRNAs и shRNAs полностью комплементарны последовательности мРНК, они подавляют экспрессию одной конкретной мРНК путем эндонуклеолитического расщепления. В отличие от них, поскольку miRNAs частично комплементарны 3'-нетранслируемой области (3'-UTR) мРНК мишени, то они в первую очередь вызывают репрессию трансляции нескольких транскриптов одновременно.^{30, 35-38}.

Кроме того, молекулы RNAi различаются по степени генетического замалчивания, который они вызывают. Например, siRNA являются преходящими и уничтожают от 30% до 50% мРНК мишеней, в то время как miRNA могут подавлять гены в большем количестве, чем shRNA.³⁹ Поэтому подавление генов с помощью siRNA может потребовать повторного введения, в то время как shRNA и искусственные miRNA являются более долговременными и могут навсегда подавлять ген мишень после однократного введения.²⁷

В дополнение к каноническим miRNAs был описан новый класс атипичных miRNAs, называемых миртронами (mirtrons). Их клеточный биогенез включает сплайсинг коротких интронов с потенциалом образования шпилек, в результате чего образуются зрелые виды, которые функционируют как типичные регуляторные miRNAs независимым от Drosha способом.⁴⁰

RNAi -терапия может применяться с использованием аллель-неспецифических и аллель-специфических стратегий. При аллель-RNAi неспецифической стратегии одинаково осуществалется целенаправленное воздействие на дикого типа и мутантные аллели, в то время как при аллель-специфическом подходе подавляются только мутантные аллели. Последняя стратегия полезна, когда экспрессия белка дикого типа необходима для функционирования клетки, и, следовательно, ее подавление может быть губительным для клеток.²⁷ Однако аллель-специфическое подавление является более сложной технической задачей, поскольку требует различий в нуклеотидной последовательности между патологическими и непатологическими аллелями, таких как однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs), и различий в длине повторов CAG при нарушениях PolyQ.^41-43 Другими преимуществами технологии RNAi являются простота разработки, синтеза и производства молекулярных медиаторов.²⁴

Однако клиническое применение RNAi терапии сталкивается с серьезными проблемами, такими как низкая стабильность in vivo, низкая эффективность систем доставки и существование эффектов вне мишени.^{24, 36} Кроме того, при нейродегенеративных заболеваниях, таких как заболевания PolyQ, плохое проникновение молекул RNAi через гематоэнцефалический барьер ограничивает их применение. Еще одним ограничением является потенциальное насыщение эндогенного механизма обработки RNAi из-за чрезмерной доставки siRNAs в клетки млекопитающих.⁴⁴ Однако в настоящее время разрабатывается несколько стратегий для минимизации этих ограничений и ускорения внедрения подходов на основе RNAi в клинических условиях.³⁶

Исследования терапии на основе RNAi при полициклической атаксии показали многообещающие результаты в клеточных и животных моделях,²⁴ но ни одна из этих моделей не перешла к клиническим испытаниям (Таблица 1). При SCAs первое in vivo доказательство эффективного генетического подавления с помощью RNAi было получено на трансгенных мышах SCA1. В этом исследовании подавление транскриптов ATXN1 производилось путем введения AAV-вектора, экспрессирующего shRNA, в медиальную долю мозжечка мышей. В результате уровень белка атаксина-1 был снижен, а невропатологические и двигательные отклонения восстановлены.⁴⁵



TABLE 1. RNAi therapies for polyglutamine spinocerebellar ataxias

Ген ATXN1 имеет несколько сайтов связывания miRNA, что было подтверждено в различных трансфицированных клеточных линиях человека (HEK293T, HeLa, MCF7), где экспрессия гена снизилась на ~60%. Тем не менее, использование miRNA увеличивало цитотоксичность из-за их пагубного влияния на функцию генов дикого типа.⁴⁶

Прямая инъекция AAV-экспрессирующей shRNA в глубокие ядра мозжечка мышей с нокаутом SCA способствовала подавлению атаксина-1 в коре мозжечка и стволе мозга и сохраняла двигательную активность и морфологию клеток.⁴⁷ Кроме того, miRNA (рекомбинантная AAV-miS1) вызвала частичное подавление увеличенного транскрипта ATXN1 человека и обращала вспять проявления атаксии у трансгенных мышей B05.⁴⁸

Первое доказательство принципа аллель-специфического замалчивания при PolyQ атаксии было получено на модели крыс SCA3.⁴⁹ В этом исследовании лентивирусный вектор, кодирующий shRNA, направленную на SNP, связанный с экспансией CAG-повторов, вводился в striatum животных и вызывал эффективное подавление увеличенного человеческого аллеля ATXN3, при сохранении белка дикого типа. В результате наблюдалось заметное уменьшение агрегатов атаксина-3 и восстановление экспрессии маркера нейронов DARPP-32.⁴⁹ Аналогичным образом, мутантный ген ATXN3 был подавлен с помощью той же shRNAi у трансгенной мыши SCA3 с последующим уменьшением внутриядерных включений, сохранением коры мозжечка и восстановлением двигательного дефицита и тревожности у животных.⁵⁰.

Краткосрочное введение siRNA, действующей как челнок искусственной миРНК, трансгенным мышам с SCA3 способствовало значительному снижению ядерного накопления мутантного атаксина-3 в мозжечке.⁵¹ Тем не менее, долгосрочное введение не привело к обратному развитию двигательного дефицита, несмотря на пожизненное подавление гена ATXN3.⁵²

Другое исследование показало, что специфические эндогенные miRNAs, нацеленные на последовательности в 3'-UTR, способны понижать уровень мутантного гена ATXN3 в клетках HEK293T и нейронах человека, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSCs), полученных из фибробластов пациентов со SCA3/MJD. Кроме того, введение кодируемых лентивирусами miRNAs в стриатум трансгенной мышиной модели SCA3 привело к уменьшению ядерных агрегатов атаксина-3 и восстановлению дисфункции нейронов⁵³.

Более того, невирусная векторная система для RNAi была доказана доклинически при SCA3. В этом случае Conceicao et al⁵⁴ использовали стабильные липидные частицы нуклеиновых кислот, инкапсулирующие siRNA, против транскрипта ATXN3. Внутривенное введение этих липосомных наночастиц подавляло мутантные аллели, уменьшало невропатологические признаки и улучшало двигательный дефицит у трансгенных мышей SCA3.

При SCA6 аллель-специфическое подавление увеличенного гена CACNA1A было зарегистрировано с помощью альтернативного метода, при котором как нормальной длины, так и увеличенный аллели подавлялись с помощью siRNA, а нормальный белок восстанавливался с помощью siRNA-устойчивой мРНК дикого типа.⁵⁵ Кроме того, AAV-ассоциированная miRNA предотвращала дегенерацию клеток Пуркинье и уменьшала двигательный дефицит в мышиной модели благодаря модуляции внутреннего сайта входа рибосомы, расположенного в кодирующей области CACNA1A.⁵⁶

Что касается SCA7, то shRNA, связывающая SNP, сцепленный с увеличенными аллелями, вызывала аллель-специфическое подавление мутировавшего гена в клетках эмбриональной почки человека. Следовательно, уровни мутантного атаксина-7 снижались, и клеточный фенотип восстанавливался.⁵⁷ Аналогичные результаты были получены в фибробластах, взятых от пациентов с SCA7, с использованием двух различных siRNA против 3'-UTR транскриптов ATXN7.⁵⁸ Более того, введение AAV-ассоциированной miRNA в мышиной модели SCA7 снижало уровень мутированного и дикого типа атаксина-7 и улучшало проявления атаксии⁵⁹ с сохранением функции сетчатки.⁶⁰

Интересен другой альтернативный метод аллель-специфического подавления мутировавших генов, который был использован для SCA7. Эта стратегия сочетает в себе подавление гена с помощью искусственного миртрона и доставку функциональной копии гена. В этом исследовании было обнаружено эффективное подавление мутантного ATXN7, в то время как функция белка дикого типа была сохранена⁶¹.

Недавно для транскриптов HTT, ATN1, ATXN3 и ATXN7 была создана универсальная shRNA, нацеленная на экспансию CAG-повторов, что, в свою очередь, снизило уровни мутантных белков huntingtin, atrophin-1, ataxin-3 и ataxin-7 в фибробластах, полученных от соотв. пациентов⁶².

ASO представляют собой химически модифицированные одноцепочечные олигонуклеотиды небольшого размера, длина которых обычно составляет от 12 до 30 нуклеотидов. ASOs разработаны таким образом, чтобы нацеливать их на ядерные и цитоплазматические РНК на основе гомологии их последовательностей и таким образом способствовать подавлению генов. Это перспективная терапевтическая платформа с потенциалом для лечения нейродегенеративных заболеваний^{26, 63, 64} После связывания с мРНК мишенью ASO модулируют ее экспрессию посредством различных механизмов^{26, 65}: (1) расщепление и разрушение транскрипта РНКазой Н (рис. 2A), (2) вмешательство в трансляцию путем стерического блокирования (рис. 2B), (3) модификация сплайсинга РНК (пропуск экзонов или включение экзонов) (рис. 2C),^{66, 67} и (4) модуляция созревания мРНК путем вмешательства в сайт полиаденилирования и формирования cap (рис. 2D). Дополнительный механизм заключается в ингибировании эндогенных miRNAs⁶⁸.



FIG 2 Mechanisms of action of antisense oligonucleotides (ASOs). (A) Transcript cleavage by RNase H. (B) Steric blockage. (C) Modification of RNA splicing by exon skipping. (D) Modulation of protein synthesis by interference with polyadenylation. PolyQ, polyglutamine; 5'-UTR, 5'-untranslated region. [Color figure can be viewed at wileyonlinelibrary.com]

После связывания с мРНК-мишенью АСО образуют дуплекс ДНК-РНК, который распознается РНКазой Н. Затем этот вездесущий клеточный фермент расщепляет мРНК в гибриде, но не АСО.²³ Таким образом, образующиеся фрагменты мРНК деградируют под действием экзосомного комплекса и других нуклеаз.⁶⁶ Затем АСО высвобождаются, вступают в очередной раунд гибридизации и расщепления мишени. В целом, механизм анти-смыслового действия зависит как от последовательности мишени, так и от химических модификаций ASO.⁶⁹

Природные не модифицированные ASO подвержены деградации нуклеазами, что влияет на их проникновение в ткани.⁷⁰ Следовательно, химические модификации ASO могут оптимизировать свойств лекарств, такие как фармакокинетика, фармакодинамика или проникновение с помощью эндоцитоза.^{71 Поскольку каждая модификация придает ASO уникальное свойство, природа химической модификации определяет его классификацию. ASO первого поколения содержат замену не связанных мостиками атомов кислорода на атом серы в фосфодиэфирной связи, что приводит к фосфоротиоат (phosphorothioate) основе. Это изменение повышает устойчивость к нуклеазам и биодоступность, улучшая фармакодинамику и фармакокинетические характеристики.72, 73}

ASO второго поколения имеют структурные изменения в рибозе, такие как модификации 2'-O-метил (2'-OMe) и 2'-O-метоксиэтил (2'-MOE). Эти изменения увеличивают биологический период полураспада ASO в центральной нервной системе^{26, 74}, но не активируют РНКазу Н; вместо этого они ингибируют экспрессию мРНК путем стерического вмешательства в трансляцию⁷⁵.

Др. модификация ASO, называемая "chimeric gapmers," включает вставку 2'-алкильных модификаций, фланкирующих центральную щель, к которой прикреплена РНКаза Н. Эта модификация обеспечивает большую стабильность, облегчает проникновение в клетку и привлекает ферменты, которые быстро разрушают мРНК.⁷⁶

Третье поколение ASOs характеризуются химическими модификациями нуклеотида в его фуранозном кольце.⁷⁷ Наиболее часто используются пептидная нуклеиновая кислота (PNA), phosphoramidate морфолино олигомер и заблокированная нуклеиновая кислота, которые были разработаны для повышения устойчивости к нуклеазе, увеличения сродства связывания, а также для улучшения фармакокинетики и биостабильности.⁷⁸

Подобно подавлению на основе RNAi, ASO-терапия может быть обеспечена с помощью аллель-специфических или неаллель-специфических стратегий. Аллель-специфическая подавляющая регуляция основана на использовании ASO, направленных на SNPs, которые появляются только в мутантных аллелях, или ASO, которые специфически связываются с более длинными CAG-повторами при заболеваниях PolyQ.⁵

Хотя ASO эффективно поглощаются нейронами, непроницаемость гематоэнцефалического барьера препятствует внедрению терапии на основе ASO в клиническую практику. Фактически, большинство анионных ASO не преодолевают этот барьер или преодолевают его плохо.⁷³ Поэтому ASO вводятся инвазивными методами: интрапаренхимальная инъекция (в головной или спинной мозг) или инъекция в спинномозговую жидкость (интрацеребровентрикулярная или интратекальная).⁷⁹ В связи с этим было рекомендовано разработать подкожные катетеры с интратекальным доступом.⁸⁰. Интратекальное введение повышает биодоступность ASO в головном и спинном мозге, но инвазивный характер ограничивает его применение.⁸¹ Однако в настоящее время изучаются другие альтернативы для повышения клеточного поглощения ASO. Среди них наиболее перспективными альтернативами являются сочетание ASO со специфическими молекулами,⁸¹ использование проникающих в клетки пептидов и доставка с помощью липосом.^{68, 82}

В отличие от терапевтических молекул RNAi, которые обеспечивают постоянную экспрессию трансгенов, лечение с помощью ASO обычно менее продолжительно и, следовательно, требует нескольких и частых введений. Однако ASO имеют более широкое биораспределение, чем RNAi, в центральной нервной системе после доставки.

Первое доклиническое исследование с использованием ASO для лечения нарушений PolyQ было проведено на мышиной модели HD. В этом исследовании животным внутрь желудочков вводили фосфоротиоат-модифицированный ASO, что, в свою очередь, вызвало значительное снижение содержания мутантного и дикого типа хантингтина в спинномозговой жидкости и устранение патологического фенотипа.⁸³ Это исследование дало основания для оценки полезности терапии ASO при полиQ-атаксии.⁶⁶ Впоследствии для этих нейродегенеративных заболеваний был проведен ряд исследований на клеточных и животных моделях (Таблица 2).



TABLE 2. ASO therapies for polyglutamine spinocerebellar ataxias

При SCA1 аллель-специфическая регуляция увеличенного CAG-повтора была применена к модельным фибробластам, полученным от пациентов, что привело к значительному снижению увеличенных транскриптов.⁸⁴ Аналогичным образом, внутрижелудочковое введение MOE ASO, нацеленного на ATXN1, в модели мышей с нокаутом SCA1 привело к значительному снижению уровней мРНК в мозжечке, коре головного мозга и стволе мозга до 12 недель после инъекции и вызвало уменьшение двигательных нарушений и гибели животных.⁸⁵

При SCA2 интрацеребровентрикулярная инъекция MOE gapmer ASO в двух трансгенных моделях мышей снижала уровни мРНК ATXN2 и атаксина-2. Это снижение было обнаружено через 70 дней после однократной инъекции со значительным восстановлением дефицита движений и восстановлением морфологии и частоты возбуждения клеток Пуркинье. Связанные со SCA2 белки, экспрессируемые в клетках Пуркинье, нормализовались после введения ASO.⁸⁶

Примечательно, что снижение мРНК ATXN2 с помощью ASO в трансгенной мышиной модели TDP43/ALS (боковой амиотрофический склероз) уменьшило агрегацию TDP-43, улучшило двигательную функцию и увеличило выживаемость животных.⁸⁷ Также ASO, направленные на экспрессию атаксина-2, восстанавливали нуклео-цитоплазматический транспорт в дифференцированных в нейроны hiPSCs пациентов с боковым амиотрофическим склерозом (ALS).⁸⁸ Эти результаты согласуются с известной ролью промежуточного аллеля ATXN2 как фактора риска развития ALS у людей.⁸⁹

Терапевтические подходы на основе ASO к SCA3 были широко изучены. Использование PNA ASO, направленного на увеличенные повторы CAG, привело к значительному снижению уровня мутантного атаксина-3 в фибробластах, полученных от пациентов.⁹⁰ В другом исследовании с использованием MOE ASO сообщалось о снижении уровня мутантного атаксина-3 в фибробластах и в двух различных моделях мышей, в которых не было обнаружено признаков астроглиоза и микроглиоза.⁹¹

Что касается механизма пропуска экзонов, Evers et al.⁹² использовали модифицированные ASO для удаления CAG-повторов, содержащих область, с пропуском 9-го и го экзона пре-мРНК ATXN3. Усеченный белок сохранил свою способность связывать убиквитин в фибробластах, полученных от пациентов со SCA3. Внутрижелудочковое введение этого ASO мышам C57bl/6j привело к элиминации PolyQ-содержащего экзона в мозжечке без токсичности для животных. В другом исследовании усеченный белок атаксина-3 без экзона 10 привел к уменьшению накопления нерастворимого атаксина-3 в ядре фибробластов и у трансгенных мышей MJD84.2.⁹³.

Исследование, в котором использовался MOE gapmer ASO, нацеленный на транскрипт ATXN3 у гомозиготных мышей MJD84.2/84.2, показало значительное снижение уровня атаксина-3 и его агрегатов в течение нескольких недель после введения, а также восстановление слоя клеток Пуркинье в мозжечке.⁹⁴ В другом исследовании тот же ASO восстановил возбудимость клеток Пуркинье у трансгенных мышей YACMJD84.2Q-C57BL/6 за счет восстановления уровней транскрипта двух калиевых каналов, связанных с напряжением.⁹⁵

Что касается SCA7, то в 2018 году Niu et al.⁹⁶ сравнили эффект двух стратегий ASO для лечения дегенерации сетчатки. Они использовали ASO против мРНК ATXN7 (ATXN7-ASO) и другой, направленный на увеличенный CAG-тракт (CAG-ASO). Введение в стекловидное тело введение ATXN7-ASO мышам с нокаутом SCA7 снижало экспрессию гена ATXN7 и агрегацию белка в глазах животных. Такое подавление гена способствовало восстановлению гистопатологии сетчатки, экспрессии генов фоторецепторов и зрительной функции, даже если лечение начиналось после появления симптомов. Инъекция CAG-ASO уменьшала агрегаты мутантного атаксина-7 в меньшей степени, чем ATXN7-ASO, в то время как уровни белка дикого типа оставались неизменными.

После изучения терапевтического потенциала, нацеленного на один CAG-повтор, ASO для лечения различных заболеваний PolyQ, Kourkouta и др. ⁹⁷ оценили универсальный ASO для подавления регуляции мутантных белков атаксина-1 и атаксина-3 in vitro и in vivo путем пропуска экзонов. Это лечение вызвало снижение уровня атаксина-3 в фибробластах и атаксина-1 и атаксина-3 в головном мозге мышей с нокаутом SCA1 и у трансгенных мышей SCA3, соответственно. Таким образом, данное исследование позволило доказать потенциальную полезность универсальных ASO для лечения PolyQ атаксии.

Современные методы редактирования генов основаны на точной индукции разрывов двойной нити ДНК (DSBs) в определенных последовательностях мишени для стимулирования клеточного механизма репарации.⁹⁸ Механизм редактирования на основе DSB включает инженерные эндонуклеазы для создания специфических DSBs с высокой точностью, что повышает эффективность нацеливания генов посредством гомологичной рекомбинации.⁹⁹ Основными платформами для редактирования генов являются нуклеазы с цинковыми пальчиками (ZFNs), нуклеазы с эффектором, подобным активатору транскрипции (TALENs), и системы кластеризованных регулярно интерферирующих коротких палиндромных повторов (CRISPR)/Cas9.¹⁰⁰

И ZFNs, и TALENs являются химерными ферментами с ДНК-связывающим доменом, слитым с неспецифическим каталитическим доменом эндонуклеазы Fok-I. Таким образом, эти димеры могут производить DSBs в целевых участках ДНК. Система CRISPR/Cas9 требует наличия короткой направляющей гид РНК и эндонуклеазы Cas9 в рибонуклеопротеиновом комплексе. Вкратце, специфическая направляющая гид РНК распознает последовательность в ДНК мишени и направляет нуклеазу Cas9 на создание DSBs в этом конкретном сайте.^{101, 102}

Общей проблемой стратегий редактирования генов является индукция внецелевых механизмов в результате эндонуклеолитического расщепления нежелательных участков с высокой гомологией последовательностей с регионом мишени. Однако для минимизации этих внецелевых эффектов было разработано несколько стратегий, таких как точный дизайн направляющих гид РНК с химическими модификациями и варианты Cas9, разработанные для повышения их эффективности в отношении целевой последовательности.^{103, 104}.

В дополнение к нецелевым эффектам, системы доставки стратегий редактирования генов влияют на безопасность и эффективность этих потенциальных терапевтических инструментов. В настоящее время наиболее используемыми методами являются векторы AAV и электропорация или микроинъекция в клетки мишени. Оба метода имеют свои преимущества и недостатки, которые зависят от того, используется ли система ex vivo или in vivo.¹⁰⁴

Поскольку технология редактирования генов позволяет точно и навсегда исправить ген, она рассматривалась как потенциальный подход к удалению мутаций CAG-повторов при заболеваниях polyQ. Несколько исследований показали, что нуклеазы, нацеленные на повторы CAG, могут уменьшать увеличенные последовательности CAG/CTG в различных моделях в результате репарации разрывов ДНК.²⁷ Например, внедрение платформы TALEN в тринуклеотидные повторы CAG/CTG способствовало сокращению тракта PolyQ в дрожжевой модели,¹⁰⁵ в то время как использование ZFN вызывало расщепление повторов CAG в клеточных линиях человека и грызунов.¹⁰⁶ Некоторые успешные стратегии редактирования генов были разработаны в доклинических моделях HD.^107-109.

Для PolyQ атаксий доказательство концепции технологии редактирования генов было получено при SCA3. Это исследование продемонстрировало успешное использование платформы CRISPR/Cas9, нацеленной на мутантный аллель ATXN3 в hiPSCs, полученных от пациентов с SCA3. В частности, авторы использовали две направляющие гид РНК, окружающие тракт CAG-повторов в экзоне 10 гена и обнаружили значительную делецию экспансии PolyQ без влияния на плюрипотентность и дифференцировку клеток клеточных линий или на убиквитин-связывающую способность отредактированного ataxin-3.¹¹⁰ Аналогичный подход был использован в фибробластах пациентов со SCA1, где наблюдалось значительное снижение мутировавшего белка ataxin-1 с минимальными нецелевыми эффектами¹¹¹ (Таблица 3).

TABLE 3. Gene editing therapies for polyglutamine spinocerebellar ataxias

Хотя стратегии генотерапии дали многообещающие результаты в клеточных и животных моделях PolyQ атаксии, они еще не одобрены для использования в клинических испытаниях, поскольку некоторые технологические, этические и экономические проблемы все еще не решены.¹¹² Технологические проблемы включают восприимчивость терапевтических молекул РНК к клеточным эндонуклеазам, их неспособность пересечь клеточную мембрану и они вызвают иммунный ответ в организме гостя.¹¹³. Таким образом, выбор подходящих векторов и методов доставки является ключевым вопросом для успешной генной терапии.⁷⁹ Например, лентивирусы и AAV считаются подходящими векторами для генной терапии при атаксии PolyQ, поскольку они минимально иммуногенны и эффективно проникают в мозжечок.⁷³ Кроме того, настоятельно рекомендуется использовать невирусные векторы, поскольку они более безопасны, чем вирусные, а их комбинация с химически модифицированными ASO повышает их стабильность для доступа к клеткам¹¹⁴. В частности, липосома DCL64 считается потенциальным средством доставки ASO при лечении атаксии PolyQ, поскольку она обеспечивает широкое распределение олигонуклеотидов в клетках Пуркинье после внутривенного введения.⁸² Другие методы оптимизации доставки ASO и RNAi включают разработку наночастиц для обволакивания отрицательно заряженных молекул, чтобы позволить им преодолеть мембрану клетки-мишени.¹¹²

Еще одной проблемой генной терапии при полиQ-атаксии является предполагаемый пагубный эффект уменьшения количества белков дикого типа при использовании неспецифических аллельных стратегий, поскольку большинство этих белков выполняют важные клеточные функции и функционально связаны друг с другом в хорошо разработанной сети белков, связанных с атаксией и имеющих решающее значение для функции мозжечка¹¹⁵.

Например, выключение гена TBP,¹¹⁶ чья экспансия CAG приводит к SCA17 , эмбрионально летальной у мышей, в то время как ген CACNA1A вызывает дистонию и позднюю мозжечковую дегенерацию.¹¹⁷ Кроме того, у мышей, лишенных генов ATXN1 и ATXN2, наблюдался аномалии, связанные с болезнью Альцгеймера¹¹⁸ , и аномальным жировым обменом,¹¹⁹ соответственно. Напротив, потеря генов дикого типа ATXN3120 и ATXN7121 не представляется столь проблематичной. Однако, существование некоторых паралогичных генов с высокой функциональной гомологией с генами PolyQ атаксии^{115, 122-124} может уменьшить беспокойство по поводу не аллель-специфической редукции таких генов.

Как и другие терапевтические стратегии, подходы генотерапии должны преодолеть отсутствие надежных клинических, биологических и нейровизуализационных биомаркеров и необходимость проведения испытаний в больших когортах, особенно на продромальных или ранних клинических стадиях. Кроме того, применение протоколов, сочетающих традиционное фармакологическое лечение и генную терапию, может повысить биодоступность лекарств³⁸.

Некоторые из технологических проблем были расширены недавним прекращением трех клинических испытаний ASO у пациентов с HD.¹²⁵ Во-первых, исследование III фазы с ASO tominersen компании Roche не смогло замедлить прогрессирование заболевания, несмотря на снижение уровня мутантного хантингтина. Более того, подгруппа пациентов, получавших препарат каждые 8 недель, показала худшие результаты в двигательной функции и в познавательной способности, чем группа плацебо. Считается, что эти негативные результаты были вызваны снижением уровня нативного хантингтина, неэффективной доставкой ASO в нейроны-мишени или включением пациентов с прогрессирующим заболеванием.126

В двух других неудачных клинических испытаниях (фаза 1b/2a) использовались ASO WVE-120101 и WVE-120102 компании Wave Therapeutics, соответственно.¹²⁵ Эти антисмысловые кандидаты были разработаны для аллель-специфического подавления расширенного HTT путем воздействия на два различных SNP, связанных с увеличением CAG-повторов. Однако, ни в одном из исследований не наблюдалось значительного снижения мутантного белка или дозозависимого эффекта, вероятно, из-за неэффективного захвата мишени. Кроме того, оба исследования были прекращены из-за недостаточной эффективности. Тем не менее, третий ASO (WVE-003), направленный на другой SNP, связанный с повтором CAG, и разработанный на основе фосфорамидата (PN) нового поколения, в настоящее время проходит клинические исследования. Исследователи с оптимизмом смотрят на этот ASO, поскольку он показал повышенную потенцию и лучшие фармакологические свойства в доклинических исследованиях.

Неудача этих клинических испытаний, вероятно, замедлит разработку ASO-терапии при PolyQ атаксии, но они позволяют извлечь некоторые уроки для предстоящих клинических испытаний. Во-первых, не аллель-специфических стратегий следует избегать в тех подтипах, в которых потеря белка дикого типа приводит к пагубным фенотипам (SCA17), а также к аномальным двигательным (SCA6), поведенческим (SCA1) или метаболическим особенностям (SCA2). Однако для SCA3 и SCA7 могут быть применимы неаллель-специфические стратегии.

Второй полученный урок - это необходимость достижения эффективного действия ASO в мозжечке. Хотя в доклинических исследованиях были получены доказательства интрацеребровентрикулярного воздействия на мозжечок мыши (табл. 2), значительно больший размер мозжечка человека и распространенный характер в нём нейродегенерации, включающий как кору, так и глубокие ядерные области,² дает основания для использования более эффективных систем доставки ASO, таких как наноносители и/или ASOs, химически модифицированные для улучшения их биораспределения в мозжечке. Кроме того, лучшего вовлечения мозжечка можно достичь путем увеличения дозы ASO, но при этом необходимо учитывать риск токсичности препарата. Предполагается, что использование повышенных доз томинерсена ASO способствовало отрицательным результатам клинического исследования компании Roche.¹²⁵ Кроме того, включение пациентов на ранних или даже продромальных стадиях атаксии PolyQ является обязательным для предстоящих клинических исследований.

Кроме того, продолжается клиническое испытание 1 фазы ASO (BIIB105), направленного на ген ATXN2 у пациентов с ALS с промежуточными экспансиями CAG-повторов или без них (ClinicalTrials.gov: NCT04494256). В этом случае результаты исследований безопасности, переносимости и фармакокинетического профиля препарата были бы ценны для разработки клинических испытаний и у пациентов с SCA2. Однако следует учитывать различия в основной мишени нейродегенерации при обоих заболеваниях, главным образом из-за предполагаемых более высоких доз, необходимых для поражения мозжечка при использовании ASO.

Перевод исследований в области генотерапии в клинический контекст при PolyQ атаксии не свободен от этических проблем. Во-первых, предполагаемые побочные эффекты, вызванные нецелевыми механизмами, и недостаточная эффективность препарата, обусловленная ограничениями доставки и биораспределения, могут негативно повлиять на соотношение затрат и пользы от лечения. Другая этическая дилемма, которая может возникнуть при использовании этих методов лечения, заключается в том, что их эффект должен зависеть от стадии заболевания; поэтому они могут быть не очень эффективны в наиболее тяжелых случаях, которые имеют наибольшую потребность в лечении.

Поскольку полиQ-атаксии считаются редкими заболеваниями, они предлагают низкие стимулы для фармацевтических компаний, что не только замедляет развитие методов генотерапии, но и делает их более дорогими. Следовательно, приведение стоимости в соответствие с социальными и медицинскими требованиями пациентов является постоянной проблемой.

В целом, многообещающие результаты генной терапии в доклинических моделях атаксии PolyQ дают основания для ее использования у людей, но внедрение в клиническую фазу все еще сопряжено с некоторыми технологическими, этическими и экономическими проблемами, которые требуют надлежащего решения.