Пигментный ретинит (RP) - это гетерогенная группа наследственных заболеваний сетчатки, вызванных прогрессирующей дегенерацией фоторецепторов в виде палочек и колбочек, что в конечном итоге приводит к потере зрения. Мутации в более чем 200 генах вызывают RP, и в совокупности они поражают одного из 3000-5000 человек, являясь основной причиной наследственных форм слепоты во всем мире. Мутации, вызывающие Х-сцепленный RP (XLRP), особенно тяжелы, и заболевание сетчатки проявляется в течение первых нескольких десятилетий жизни. Большинство мутаций, вызывающих XLRP, были идентифицированы как аллели потери функции в гене, кодирующем GTPase regulator (RPGR) [1-4].

Белок RPGR расположен в соединяющей ресничке фоторецептора [5], в заключенной в мембрану микротубулярной структуре, аналогичной переходной зоне первичных ресничек, которая соединяет биосинтетический внутренний сегмент фоторецептора и светочувствительный наружный сегмент. Наружный сегмент представляет собой специализированный отдел, заполненный стопками мембранных дисков, содержащих механизмы фототрансдукции, необходимые для высокой чувствительности к зрительным стимулам. Внутренний сегмент содержит основную массу цитоплазмы и органелл и, таким образом, является местом основных клеточных процессов, таких как производство энергии и синтез белка. Поскольку дистальные концы наружных сегментов постоянно отрываются и фагоцитируются прилежащими пигментными эпителиями сетчатки (RPE), белки фототрансдукции должны постоянно производиться во внутреннем сегменте и перемещаться по соединительной ресничке (цилиуму). Этот процесс высоко регулируется и включает несколько белков, связанных с заболеваниями сетчатки, включая RPGR, RPGRIP1 и CEP290 [6]. При отсутствии функции RPGR перемещение по ресничке нарушается, и белки могут более свободно перемещаться между компартментами, нарушая клеточный гомеостаз и, как следствие, приводя к гибели клеток. Аномальное накопление опсинов в клеточных телах фоторецепторов колбочек с дефицитом RPGR является ранним и устойчивым проявлением [5, 7, 8]. Подобные фенотипические проявления наблюдаются и в других животных моделях, где белки соединительных ресничек мутировали или отсутствуют [9-11].

В результате альтернативного сплайсинга RPGR образуется множество транскриптов, и две основные изоформы хорошо охарактеризованы [4, 12]. Изоформа по умолчанию, RPG^Rex1-19, широко экспрессируется во многих тканях, в то время как ограниченный тканями вариант RPG^RORF15 экспрессируется преимущественно в фоторецепторах сетчатки. Вариант RPG^RORF15 содержит уникальный 3экспресси' терминальный экзон ORF15, который кодирует два критических функциональных домена: высоко повторяющийся домен, богатый глицином/глутаминовой кислотой, и С-концевой основной домен с гомологией с тубулинами. Длина повторяющейся области сильно варьирует у разных видов и даже у здоровых людей. Более того, in-frame делеции, укорачивающие эту область на одну треть, хорошо переносятся и не вызывают функциональных нарушений у мышей [13, 14]. Тем не менее, достаточно большое количество остатков глутаминовой кислоты в этой области должно быть сохранено для глутамилирования - пост-трансляционной модификации, необходимой для функционирования RPGR, отсутствие которой вызывает заболевания сетчатки [15]. Напротив, мутации, нарушающие рамку считывания и уничтожающие С-концевой домен, неизменно нарушают функцию белка и вызывают заболевание сетчатки. Экзон ORF15 содержит более 70% известных мутаций, вызывающих заболевания в RPGR, что делает его привлекательной мишенью для генотерапии [4, 16].

Хотя генотерапия путем замены генов при заболеваниях, связанных с RPGR, показала свою перспективность в качестве терапевтической стратегии [17-21], создание и доставка рекомбинантных генных конструкций RPGR сопряжены с повышенным риском из-за уникальных характеристик последовательности. Повторяющаяся область RPGR по своей природе нестабильна, ее сложно секвенировать, и она подвержена спонтанным мутациям при обработке in vitro и субклонировании [20]. Позже было обнаружено, что гены RPGR дикого типа, упакованные в векторы AAV, содержат множество спонтанных изменений в этой повторяющейся области [21]. Более того, избыточная экспрессия RPGR может быть токсичной и требует тщательной дозировки при доставке генов [21]. Для дальнейшего улучшения перспектив успешной генотерапии мы попытались проверить альтернативную стратегию, основанную на упрощенной форме редактирования генома, при которой генная мутация исправляется в хромосоме in situ. Для любой генной мутации, вызывающей заболевание, редактирование генов открывает захватывающую перспективу окончательного излечения. В этом подходе используется система CRISPR/Cas9 для индукции разрывов двойной нити ДНК (DSB) в сайте мишени, а затем - в зависимой матрицы, направленной на гомологи репарации, которая заменяет мутантную последовательность последовательностью дикого типа. При нынешней технологии первый этап высокоэффективен в нарушении функции гена in vivo [22], но второй этап является ограничивающим из-за его низкой эффективности. Редактирование генома на основе этого подхода было подтверждено на клеточных линиях, культивируемых in vitro, в которых редкие события исправления могут быть отобраны и умножены, но это не имело большого успеха in vivo. В отсутствие необходимой матрицы для гомологичной рекомбинации, за обусловленными CRISPR разрывами двойной нити следует негомологичное соединение концов (NHEJ), механизм восстановления клетки-хозяина, который обычно приводит к вставке или удалению пар оснований. Редактирование генов на основе CRISPR было изучено как потенциальная генотерапия для наследственной дегенерации сетчатки [23, 24], и может быть полезно для разрушения доминантных мутантных аллелей [25-27]. Недавние исследования также показали, что на RPG^RORF15 можно воздействовать с помощью CRISPR/Cas9 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках [28, 29]. Однако исправление мутаций путем редактирования генома in vivo для большинства генов в настоящее время не представляется возможным.

Используя уникальные особенности экзона RPGR OFR15, мы предложили упрощенный, вариантный вариант редактирования генов. В этой конструкции разрыв двойной нити в геномной ДНК с помощью CRISPR сначала осуществляется в сайте мишени в повторяющемся регионе. Затем в результате последующего NHEJ происходят случайные вставки или делеции оснований, которые теоретически могут сместить рамку считывания в трети клеток, восстанавливая тем самым экспрессию критического С-концевого домена. Хотя не ожидается, что такая терапия восстановит структуру генов во всех клетках-мишенях, на основании предыдущих клинических исследований дегенеративных заболеваний сетчатки и известного резервного потенциала нейронов сетчатки, даже небольшая часть выживших фоторецепторов будет поддерживать значимую зрительную функцию и поможет сохранить качество жизни пострадавших людей. Эта конструкция устраняет необходимость в лимитирующем скорость и зависящем от матрицы этапе гомологичной рекомбинации, что делает ее потенциально возможной для вмешательства in vivo. В качестве экспериментального образца для лечения XLRP, вызванного мутациями со сдвигом рамки, мы выбрали естественно встречающуюся модель мыши rd9, которая несет 32-п.п. вставку в экзоне ORF15, что приводит к сдвигу рамки считывания и укорочению белка RPG^RORF15 [7, 30]. Мы протестировали эту новую форму редактирования генов у мышей rd9 с помощью CRISPR, доставленного посредством субретинальной инъекции векторов AAV или пронуклеарной инъекции комплекса sgRNA/SpCas9 рибонуклеопротеина (RNP), для восстановления функции RPGR в соматических клетках сетчатки и клетках зародышевой линии. Мы исследовали, может ли этот подход восстановить экспрессию полноразмерного RPG^RORF15 и облегчить проявления заболевания.

Х-сцепленный RP, вызванный мутациями RPGR, является привлекательной мишенью для разработки генотерапии из-за своей клинической тяжести и большого числа пациентов. Он стал предметом интенсивных исследований во многих лабораториях. Поскольку высокоповторяющаяся последовательность в ORF15 оказалась сложной для манипуляций [20, 21, 37], современные подходы к генотерапии используют различные модифицированные версии RPGR для минимизации случайных, спонтанных мутаций в ORF15 при конструировании и доставке векторов экспрессии [13, 17, 18]. В настоящее время проводится несколько испытаний на ранней стадии, и предварительные результаты обнадеживают [19]. Однако эффективность еще не доказана, а дозировка генов будет проблемой для любой стратегии, основанной на доставке генов, особенно если повышенные уровни белка обнаружат токсичность. Дополнительные стратегии, такие как исправление мутации in situ путем редактирования генома, продолжают изучаться, поскольку они предлагают привлекательные альтернативы для пациентов с мутациями RPGR.

В этом исследовании мы изучили упрощенную версию CRISPR/Cas9-опосредованного редактирования генома, используя несколько отличительных особенностей высокоповторяющейся, содержащей только пурин области экзона RPGR ORF15. Во-первых, длина этого региона может быть изменена без влияния на функцию белка, поэтому небольшие делеции/вставки, вызванные клеточной репарацией, будут хорошо переноситься. Различия в длине этой повторяющейся области позволяют предположить, что она не играет существенной роли в фоторецепторах, и что восстановление других доменов белка, таких как RCC1-подобный домен на N-конце и основной домен на С-конце, обеспечивает фоторецепторам достаточную активность для спасения фенотипа и задержки дегенерации сетчатки. Следовательно, предложенная стратегия редактирования генов может иметь большой потенциал при условии, что длина indels, которые генерирует механизм NHEJ, не будет чрезмерной. Во-вторых, отсутствие пиримидиновых остатков означает, что стоп-кодоны в любой из рамок считывания не будут генерироваться, это минимизирует вероятность прекращения трансляции благодаря сдвигу назад к правильной рамке считывания. Таким образом, единственной целью исправления мутации RPG^RORF15 является сдвиг рамки считывания и восстановление экспрессии С-концевого домена. Привлекательность этой конструкции заключается в том, что она позволяет обойти зависимую от матрицы гомологичную рекомбинацию - лимитирующий этап редактирования генома с низкой эффективностью, которая в настоящее время препятствует ее широкому применению в естественных условиях. Наш первоначальный дизайн предполагал, что количество оснований, вставленных или удаленных во время NHEJ, будет почти случайным, и, таким образом, до одной трети клеток-мишеней теоретически могут иметь восстановленную рамку считывания ORF15. Мы протестировали эту конструкцию с помощью терапии клеток зародышевой и соматической линии и подтвердили, что с помощью этой стратегии действительно можно восстановить функциональную экспрессию RPGR-ORF15. Хотя восстановление было далеко не полным в сетчатке, этот подход имеет ряд ключевых преимуществ. Мутация была исправлена in situ на уровне генома, который должен оставаться стабильным. В отличие от заместительной генной терапии путем доставки вне-хромосомных копий векторной ДНК, которая полагается на сохранение эписом для длительной эффективности, что невозможно предположить. Кроме того, регуляция экспрессии в нашем подходе контролируется родными, присущими клеткам механизмами, а не использованием гетерологичных промоторных элементов, которые не могут полностью воспроизвести физиологические профили экспрессии. Таким образом, в тех клетках, в которых была восстановлена экспрессия RPGR, эффект лечения приближается к "излечению", и эффективность должна оставаться постоянной.

Эта стратегия, однако, также имеет свои ограничения. Она не является широко применимой и может быть использована только для целенаправленного воздействия на мутации в геномных контекстах, сходных с геном RPGR. Поскольку точный контроль событий, следующих за первоначальным разрывом ДНК, невозможен, в лучшем случае удастся спасти часть популяции клеток-мишеней. Хотя это серьезный компромисс, преимущества этого подхода, о которых говорилось выше, в значительной степени компенсируют ограничения в отдельных случаях по сравнению с современными стратегиями замены генов. Как утверждалось ранее, восстановление небольшой части клеток до полностью функционального состояния окажет глубокое положительное влияние на пострадавших людей и, таким образом, является достойной целью.

Наше исследование является первым, демонстрирующим коррекцию без матрицы in vivo в зрелых фоторецепторах в качестве доказательства принципа для будущих работ, направленных на коррекцию вызывающих заболевания мутаций в RPG^RORF15. Хотя вывод о том, что экспрессия RPGR-ORF15 может быть восстановлена, обнадеживает, остается несколько вопросов, которые должны быть рассмотрены в будущих исследованиях. Мы смогли добиться коррекции только 10% фоторецепторов, что не соответствует теоретическому верхнему пределу в 33% в обработанных сетчатках. Следует отметить, что этот теоретический верхний предел был предложен на основании предположения, что редактирование будет происходить в основном через NHEJ, и он будет достижим только при двойной трансдукции направляющих и Cas9 AAVs в 100% клеток-мишеней, что вряд ли возможно в реальных условиях. Более того, наблюдения за мышами, по целенаправленному воздействию на зародышевую линию, показывают, что NHEJ не является преобладающим результатом в данном исследовании (см. ниже). Поэтому дальнейшие усилия должны быть направлены на лучшее понимание молекулярных событий после CRISPR-опосредованных разрывов ДНК в гене RPGR и на повышение общей эффективности трансдукции AAV для достижения более высокой доли коррекции генов. Недавние сообщения [38] о том, что NHEJ-ассоциированные вставки/удаления оснований не являются случайными, дают еще одно возможное объяснение низкой скорости редактирования генов. Интересно, что неслучайность вставки/удаления оснований предполагает, что процессом можно манипулировать для достижения более высокой частоты редактирования генов, чем теоретический предел. Другие вопросы, оставшиеся без ответа в данном исследовании, связаны с нашей неспособностью подтвердить точные модификации, внесенные CRISPR/Cas9 в сетчатку из-за трудностей секвенирования, что является известной проблемой для области ORF15 RPGR. Глубокое секвенирование было проведено на сетчатке, обработанной AAV, чтобы охватить весь спектр генных модификаций. Возможно, неудивительно, что ампликон ORF15 оказалось трудно секвенировать, несмотря на многочисленные попытки и платформы, а гетерогенность последовательностей, полученных как от образцов, нацеленных на ORF15, так и от контрольных образцов, не позволила подтвердить точное редактирование. Тем не менее, использование изоформ-специфических антител позволило однозначно показать, что полноразмерный белок RPGR-ORF15 был восстановлен в сетчатке rd9 после лечения, и что белок был глутамилирован и правильно локализован в соединительных ресничках. Наконец, одним из основных ограничений системы CRISPR/Cas9 является то, что могут возникать пагубные мутации вне мишени, что может представлять потенциальный риск при клиническом применении. Секвенирование следующего поколения может выявить такие мутации вне мишени, хотя чувствительность может быть низкой, если такие мутации редки. Методы, основанные на предсказании, обеспечивают более высокую чувствительность обнаружения с использованием специфических для мишени амплификаций ДНК. Эти анализы помогут определить профиль безопасности выбранной конструкции CRISPR. Поскольку последовательности RPGR ORF15 плохо сохраняются между мышами и людьми, будущий выбор последовательностей направляющей РНК CRISPR будет существенно отличаться по мере перехода будущих исследований к моделям на основе клеток человека. В текущем исследовании на мышах мы не оценивали эффект вне мишени CRISPR/Cas9 и не можем сделать какое-либо заявление о вне-целевом действии конструкции CRISPR у мышей. Однако следует подчеркнуть, что тщательная оценка внецелевых мутаций, возможна, в органоидах сетчатки, полученных из iPSC человека, что имеет решающее значение для определения безопасности этой стратегии.

В ходе этого исследования было обнаружено интригующее наблюдение, которое позволяет предположить, что NHEJ может быть не единственным механизмом, опосредующим соединение концов и репарацию в экзоне ORF15. Сначала мы были удивлены, обнаружив, что оба основателя, произошедшие из независимых партий микроинъекций, несли одну и ту же модификацию, которая оказалась делецией в 32 п.н. вблизи места разрыва ДНК. Мы провели строгие контрольные эксперименты и оценили схемы разведения, исключив любую возможность того, что это могло произойти из-за перекрестного загрязнения или смешения штаммов мышей. Наиболее показательно, что основатели показали восстановленную экспрессию RPG^RORF15 в участках фоторецепторов по всей сетчатке, что послужило доказательством того, что это были действительно химерные основатели. Более того, скорость передачи измененного геномом аллеля составила около 10-15%, что указывает на степень генетического мозаицизма, как и следовало ожидать у основателей, и резко контрастирует с ожидаемыми результатами контаминации диким типом или гетерозиготными родителями. Учитывая контекст высокоповторяющейся последовательности, наши результаты показали интригующую возможность того, что делеция 32-п.н. сегмента была обусловлена альтернативным механизмом репарации ДНК, таким как микрогомологическое соединение концов (MMEJ) [39, 40]. Эти результаты согласуются с представлением о том, что результат редактирования генома не случаен и может быть связан с внутренними особенностями последовательности-мишени [38, 41]. В случае с нашими нынешними результатами мы предполагаем, что соседние повторяющиеся последовательности в ORF15 могут быть использованы в качестве матрицы для гомологичной рекомбинации после разрыва двойной нити ДНК. Это может произойти потому, что повторяющаяся область ORF15 состоит из серии почти идентичных 32-п.н. повторов. Таким образом, в отсутствие экзогенно предоставленных матриц ДНК или сестринских хроматид, точка разрыва может выровняться с соседним 32-п.н. элементом, локализованным в цис-положении, через петли ДНК, инициировать рекомбинацию и репарацию. Завершение этого процесса привело бы к удалению одного 32-п.н. сегмента. Это возвращает экзон ORF15 аллеля rd9 в правильную рамку считывания и эффективно устраняет мутацию, вызывающую заболевание. Эта гипотеза дает правдоподобное объяснение нашей неожиданной находке у мышей с зародышевой линией, и было бы очень важно подтвердить эту гипотезу в будущих экспериментах на клетках и тканях мыши, а также человека. По сравнению с NHEJ, процесс, управляемый MMEJ, открывает захватывающую перспективу того, что репарация может быть достигнута на уровнях, превышающих порог в одну треть, поскольку конечное присоединение не будет случайным событием. Для будущих исследований важно использовать органоиды сетчатки человека, полученные из iPSC, чтобы проверить этот подход на человеческих мутациях в RPG^RORF15. Такие исследования должны в конечном итоге определить, может ли упрощенная стратегия редактирования генома, описанная в данной работе, стать законной будущей терапией для Х-сцепленного RP, безопасной и эффективной.