Посещений:
ДЕГЕНЕРАЦИЯ СЕТЧАТКИ ЧЕЛОВЕКА



Редактирование генов

Genome-Editing Strategies for Treating Human Retinal Degenerations
Joel Quinn, Ayesha Musa,Ariel Kantor et al.
Human Gene Therapy Vol. 32, No. 5-6



Наследственные дегенерации сетчатки (IRDs) представляют собой гетерогенную группу нарушений, ассоциированных с мутациями более 250 генов, и они характеризуются дегенерацией фоторецепторов и/или подлежащего пигментного эпителия сетчатки retinal pigment epithelium (RPE), которая приводит к необратимой потере зрения (https://sph.uth.edu/RETNET/).1 Они затрагивают каждого из 2000 людей во всем мире и являются основной причиной слепоты у работающего населения.2
Несмотря на значительный прогресс в развитии терапии этих болезней в последнюю декаду, кульминацией которого стало разрешение генотерапии для наследственной дистрофии сетчатки, Leber congenital amaurosis (LCA) ассоциированного с биаллельными мутациями в RPE65 (Luxturna, Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland),3 и пригодные для имплантации протезы сетчатки при конечной стадии дегенерации сетчатки (Argus II; Second Sight Medical Products, Inc., Sylmar, CA; и Retinal Implant AG, Reutlingen, Germany), однако, большинство IRDs остаются неизлечимыми.
Сетчатка предоставляет уникальную возможность для разработки генотерапии благоаря своей иммунологической толерантности и уникальному зрительному и хирургическому доступу, что позволяет осуществлять не инвазивные вмешательства безопасные и эффективные.4 Adeno-associated viral (AAV) векторы являются наиболее часто используемыми для доставки генетического материала в клетки благодаря высокому тропизму к клеткам наружной сетчатки и высокому профилю безопасности.5 Помимо Luxturna, AAV-обеспечиваемая заместительная генотерапия по доставке рабочих копий генов. ассоциированных с болезнью в клетках сетчатки при рецессивной дегенерации сетчатки, напр., при choroideremia и RPGR-ассоциированным X-сцепленным пигментным ретинитом, оцениваются на продвинутой стадии клинических испытаний с многообещающей безопасностью и эффективностью.6,7
Однако из-за максимальной общей низкой кодирующей способности в ~4.8 kb многие крупные гены, связанные с заболеваниями, не могут быть доставлены с помощью одного вектора AAV, включая ABCA4 (6.8 kb) при болезни Штаргардта и USH2A (15.6 kb) при синдроме Ашера типа 2.8 Кроме того, добавление генов имеет ограниченное применение при аутосомно-доминантных заболеваниях сетчатки, при которых мутантные белки обнаруживают избыточную токсическую функции или доминантно-негативный эффект.
Антисмысловые олигонуклеотиды (ASO), которые изменяют сплайсинг или направлены на деградацию мРНК, в настоящее время исследуются для лечения наследственных заболеваний сетчатки, вызванных такими мутациями.9 Редактирование генома предлагает еще один многообещающий альтернативный подход для решения этой терапевтической проблемы путем целенаправленного исправления патогенных мутаций в клетках сетчатки. Исправление геномных мутаций, вероятно, приведет к более физиологическим уровням экспрессии, поскольку ген будет подвержен своей родной транскрипционной регуляции и эпигенетическому окружению.
Появление инструментов редактирования генов на основе CRISPR и устоявшихся методов доставки с помощью вирусных векторов сделало теоретически возможным исправление широкого спектра генетических мутаций в сетчатке. Быстрое развитие в области редактирования генов уже привело к тому, что Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств одобрило испытания на людях CRISPR-геномной терапии для лечения LCA типа 10 (LCA10) - наследственной дистрофии сетчатки, связанной с распространенной глубокой интронной мутацией в CEP290, которая вызывает аберрантный сплайсинг и часто приводит к слепоте в раннем младенчестве10.
Тем не менее, остаются серьезные проблемы и вопросы для разработки терапии редактирования генов сетчатки. Жизнеспособная стратегия должна подходить для доставки в сетчатку, иметь ограниченные вне мишени и иммуногенные эффекты, терапевтический уровень эффективности редактирования мишени, а в идеале быть адаптированной для лечения широкого спектра генетических мутаций.

CLASSIC CRISPR-Cas9-BASED GENOME EDITING


Геномная инженерия с использованием нуклеаз с цинковыми пальчиками или эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции, существует уже некоторое время, но клиническое применение этих методов было ограничено, как правило, низкой эффективностью редактирования in vivo.11 Открытие в 2012 году РНК-направляемой эндонуклеазы Cas9 из бактериальной адаптивной иммунной системы CRISPR - CRISPR-associated (Cas) произвело революцию в области молекулярной биологии и генотерапии.12
Система CRISPR-Cas включает в себя множество компонентов, которые различаются по механизмам действия и предлагают терапевтический потенциал путем прямого взаимодействия и/или редактирования генома. В целом, существует два класса систем CRISPR, каждый из которых содержит несколько типов CRISPR. Класс 1 включает системы типа I, типа III и типа IV; в то время как класс 2 включает системы CRISPR типов II, V и VI.13 Наиболее широко используемая платформа для целенаправленного воздействия на геном происходит от фермента Cas класса 2 типа II, Cas9, который действует как одиночный эффекторный белок; в отличие от этого, ферменты Cas класса I работают как много-субъединичные белковые комплексы. Несмотря на сложность семейства Cas, все системы имеют общее требование к CRISPR РНК (crRNA) для определения специфичности мишени, в то время как варианты типа II имеют дополнительное требование к транс-активирующей РНК, которая формирует структуру каркаса.
Для использования в редактировании генов две crRNAs, описанные ранее, объединяются в одну единственную направляющую гид РНК (sgRNA), что значительно упрощает доставку. Комплекс Cas9:sgRNA исследует ДНК в поисках соответствующего protospacer adjacent motif (PAM) - короткого мотива, примыкающего к последовательности мишени. При распознавании последовательности PAM двухцепочечная ДНК разматывается, позволяя связанной с Cas9 sgRNA гибридизоваться с открытой нитью ДНК (протоспейсером). Если последовательность ДНК мишени совпадает с целевой последовательностью sgRNA, то каталитические домены HNH и RuvC эндонуклеазы расщепляют обе нити ДНК мишени, образуя разрывы двойной нити (DSB)12.
Одним из ограничений Cas9 белка является его зависимость от вышеупомянутой последовательности PAM для соединения с ДНК мишени. Из-за своей простой последовательности 5'-NGG-3' (где N - любой нуклеотид) PAM-последовательность, Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) используется во многих различных приложениях. Однако исследователи активно изучают другие системы CRISPR для выявления Cas9-подобных эффекторных белков, которые могут иметь различия в размерах, требованиях к PAM и специфичности нацеливания. Естественно встречающиеся варианты Cas9 являются крупными белками, что вызывает ограничения при упаковке и доставке в клетки-мишени. Например, кодирующая последовательность SpCas9 составляет 4 098 пар оснований (пн), что затрудняет терапевтическую доставку из-за ограниченной способности векторов AAV к упаковке.14 В связи с этим открытие более мелких вариантов, таких как Cas9 из Staphylococcus aureus (SaCas9) размером 3 246 пн и Cas9 из Campylobacter jejuni (CjCas9) размером 2 952 пн., это обеспечивает им больший терапевтический потенциал.5 В дополнение к меньшим размерам, варианты SaCas9 и CjCas9 имеют отличные требования к PAM, расширяя репертуар геномных мишеней.
Хотя изучение разнообразия природных Cas обеспечивает одно из направлений для расширения и улучшения охвата PAM, эффективность Cas-активности варьирует, и на сегодняшний день ни один из ортологов не продемонстрировал заметного увеличения эффективности по сравнению с хорошо изученным SpCas9. Поэтому для модификации и улучшения сферы действия эффектора SpCas9 были использованы взаимодополняющие эволюционные и структурно-направленные инженерные подходы15.
В эукариотических организмах DSB, вызванные Cas9, восстанавливаются либо путем подверженного ошибкам негомологичного соединения концов (NHEJ), либо путем относительно безошибочной направленной на гомологи репарации (HDR).11 Хотя NHEJ приводит к случайным вставкам или делециям (indels) и, таким образом, к нарушению генов мишени, HDR может быть использован для вставки специфической матрицы ДНК для точного восстановления последовательности геномной ДНК (рис. 1A). Теоретически, HDR-опосредованная репарация мутантного аллеля с помощью аллеля дикого типа или другого шаблона может исправить большинство моноаллельных мутаций при IRD. Однако было показано, что точная модификация генов с помощью HDR-пути неэффективна в неделящихся клетках, таких как клетки сетчатки, и что Cas9-индуцированные DSB приводят к indels мутациям со значительной частотой, что аннулирует потенциальную пользу от коррекции мутаций11.


Figure 1. CRISPR-based genome-editing strategies. (A) CRISPR-Cas9-induced double-strand breaks. In eukaryotic cells, breaks are repaired through either the error-prone non-homologous end-joining pathway, leading to indel mutations, or the high-fidelity homology-directed repair pathway, which may be leveraged to introduce precise edits in dividing cells. Black triangles indicate Cas9 cut sites. (B) DNA editing with Base Editors. Base editors consist of a Cas9 nickase fused to a DNA deaminase and use an sgRNA to locate a target sequence, where the deaminase either converts C to T, via U (cytosine base editors) or A to G, via I (adenine base editors). (C) DNA editing with Prime Editors. Prime Editors use a Cas9 nickase fused to a reverse transcriptase, with a pegRNA. The nicked DNA strand base pairs with the 3? end of the pegRNA, which templates the desired DNA edit to be introduced by reverse transcription. (D) CRISPRi and CRISPRa. A catalytically dCas9 is guided by a sgRNA to locate a regulatory region of a gene of interest. CRISPRi involves either steric exclusion of RNAP by the dCas9 (left) or fusion of a transcriptional repressor (center) to reduce gene expression, whereas CRISPRa fuses a transcriptional activator to dCas9 to upregulate gene expression (right). CRISPR, clustered-regularly interspaced short palindromic repeats; Cas, CRISPR-associated; CRISPRi, CRISPR-interference; CRISPRa, CRISPR-activation pegRNA, prime editing guide RNA; RNAP, RNA polymerase; dCas9, dead Cas9; sgRNA, single guide RNA.

Таким образом, путь восстановления NHEJ в настоящее время является наиболее часто используемым подходом при разработке методов лечения заболеваний сетчатки, особенно мутаций, возникающих при аутосомно-доминантных заболеваниях. Благодаря тщательному дизайну направляющей гид РНК, мутантный аллель может быть избирательно разрушен, в то время как аллель дикого типа остается неизменным. В отсутствие эффекта гаплонедостаточности это может улучшить проявления заболевания, что было успешно использовано для нокаута мутантного гена родопсина (Rho) в моделях аутосомно-доминантного пигментного ретинита (adRP) у грызунов (Таблица 1). 16,17 В качестве другого примера, CRISPR-опосредованный аллель-специфический нокдаун может быть экстраполирован на лечение аутосомно-доминантной мутации основателя (S163R) в гене C1QTNF5, который, как известно, экспрессируется на высоком уровне в RPE и вызывает позднюю дегенерацию

Table 1. Studies of successful in vivo genome editing using CRISPR-Cas systems

Ограниченная точность и контроль над NHEJ снижают эффективность продуктивного редактирования, ограничивая его применение мутациями, исправленными с помощью инверсиb, делецией или небольшими indels. В случаях гаплонедостаточности NHEJ может инактивировать мутантный аллель, но все равно потребуется добавление генов дикого типа. Таким образом, точное редактирование генов с помощью HDR может быть более желательным, позволяя лучше контролировать результат редактирования и исправлять больший спектр мутаций. Чтобы преодолеть естественное отсутствие активности HDR в окончательно дифференцированных клетках сетчатки, HDR было индуцировано в фоторецепторах путем экспрессии рекомбиназы A (RecA) Escherichia coli с Cas919 (Таблица 1), хотя присутствие RecA может повысить иммуногенность.
Недавно разработанный подход под названием homology-independent targeted integration (HITI) может еще больше расширить спектр заболеваний сетчатки, которые можно исправить с помощью CRISPR. Вместо того чтобы полагаться на неэффективную репарацию, опосредованную HDR, HITI использует путь NHEJ для целенаправленной вставки больших генетических фрагментов в окончательно дифференцированные клетки. В мышиной модели аутосомно-рецессивного пигментного ретинита, вызванного делецией 1,9 кБ в гене Mertk, система CRISPR-Cas9 на основе HITI, доставленная посредством двух AAV-векторов, показала эффективную улучшенную реакцию на редактирование палочек и колбочек по сравнению с контролем, обработанным HDR20 (Таблица 1).
Доставка нескольких направляющих гид РНК в отдельные участки может обеспечить мультиплексное редактирование, и этот подход был использован для удаления вредных мутаций из генома при сохранении открытой рамки считывания. Недавнее исследование показало, что пара sgRNAs в сочетании с SpCas9 высокоэффективно вырезает или инвертирует сегмент интрона 26, который содержит распространенную глубокую интронную мутацию (c.2991 + 1655A > G) в CEP290, связанную с LCA10, восстанавливая тем самым нормальный сплайсинг между экзоном 26 и экзоном 27 in vivo10 (Таблица 1). Эффективность редактирования соответствовала целевому терапевтическому порогу в 10% и была использована на не человекообразных приматах (NHPs).
Важно отметить, что данное исследование продемонстрировало несколько важных особенностей. Пик экспрессии sgRNA сохранялся в течение всего исследования (40 недель); экспрессия Cas9, управляемая промотором киназы родопсина человека (GRK1), была специфична для фоторецепторов; приведение в соответствие терапевтической дозы между мышами и NHP обеспечило стратегию правильного дозирования для клинических испытаний; иммуногенность, вызванная препаратом, была ограничена. В совокупности эти результаты свидетельствуют о продуктивности промотора и толерантности Cas9, что создает основу для продвижения и других терапевтических препаратов для редактирования генома в клинику. Основываясь на этих доклинических результатах, компания Editas Medicine, Inc. (Кембридж, штат Массачусетс) начала фазу 1/2 клинических испытаний EDIT-101 для лечения LCA10 (ClinicalTrials.gov ID: NCT03872479), что знаменует собой первое клиническое применение CRISPR-опосредованного редактирования генов в сетчатке глаза.

STRATEGIES FOR EXTENDING THE EDITING CAPABILITY OF CRISPR-Cas


DNA base editing and prime editing


Хотя HDR-опосредованное редактирование генов может быть использовано для вставки определенной матрицы ДНК для точного восстановления последовательности ДНК, этот путь характеризуется низкой эффективностью и высокой частотой нежелательных мутаций indels, которые сводят на нет потенциальную пользу от восстановления мутации. Недавно были разработаны CRISPR-Cas-опосредованные системы редактирования одной пары оснований (или системы "редактирования оснований"), позволяющие обойти эти ограничения. Были описаны два класса редакторов оснований ДНК: редакторы оснований цитозина и редакторы оснований аденина21 (рис. 1B). Редакторы оснований включают в себя два ключевых компонента: никаза Cas9 (nCas9) с одним неактивным нуклеазным доменом для программируемого связывания ДНК-мишени и индукции вырезки в одной нити ДНК, и ДНК-модифицирующий фермент одной нити ДНК (цитозин- или аденин-деаминаза) для целевого изменения нуклеотидов. В совокупности все четыре переходные мутации (C -> T, T -> C, A -> G и G -> A) могут быть внесены с помощью доступных редакторов оснований CRISPR-Cas. Одним из ограничивающих факторов для применения редактирования оснований является наличие множества "побочных" цитидинов или аденинов в области мишени, которые также могут быть дезаминированы. Кроме того, целевой С или А должен быть расположен в пределах примерно 15 нуклеотидов (нт) от последовательности PAM.
Прайм-редакторы являются последним дополнением к набору инструментов геномной инженерии CRISPR и представляют собой новый подход, позволяющий расширить сферу точного редактирования ДНК в отсутствие донорской матрицы ДНК не только на все transition и transversion мутации, но и на небольшие indels.22 Прайм-редакторы используют искусственно созданную обратную транскриптазу, слитую с никазой, Cas9, и направляющую гид РНК prime editing guide RNA (pegRNA). Важно отметить, что pegRNA значительно отличается от обычных sgRNAs и играет важную роль в функционировании системы. PegRNA содержит не только (i) последовательность, комплементарную последовательности мишени, которая направляет nCas9 к сайту мишени, но и (ii) дополнительную последовательность, в которой прописаны желаемые изменения последовательности мишени (рис. 1С).
В дополнение к более широкому спектру возможных правок, прайм-редакторы нового поколения (например, PE3) уменьшили количество indels в местах редактирования до частоты 0,86% по сравнению с 2,5% для редакторов оснований. В окончательно дифференцированных нейронах in vitro направленные вставки с помощью прайм-редактирования были выполнены с коэффициентом эффективности редактирования 7,1%.22 В совокупности инструменты редактирования оснований ДНК и прайм-редактирования могут обеспечить точные замены нуклеотидов программируемым образом, не требуя донорской матрицы.
Редактирование оснований ДНК и прайм-редактирование имеют замечательный потенциал в качестве терапевтических инструментов для исправления вызывающих заболевания мутаций в геноме человека. Возможность целенаправленного воздействия на нуклеотиды как плюсовой, так и комплементарной минусовой нити ДНК значительно расширяет терапевтические возможности применения редакторов оснований. Более 25% патогенных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) человека могут быть исправлены с помощью целенаправленного воздействия на четыре transition мутации, и в принципе редактирование может исправить до 89% патогенных генетических вариантов человека в ClinVar.22 Важно отметить, что редактирование оснований использует клеточный механизм mismatch репарации и может быть применено для устранения этих дефектов как в делящихся, так и в окончательно дифференцированных клетках.
Редактирование оснований ДНК может оказаться особенно хорошо приспособленным для исправления мутаций в больших генах (более 4 kb), где векторная доставка ограничена пределами ёмкости векторов AAV.5 Например, мутации в генах ABCA4 (кодирующая последовательность ~6.8 kb) и USH2A (~15.6 kb) вместе составляют почти 25% всех наследственных заболеваний сетчатки.23
Редактирование оснований также может применяться при аутосомно-доминантных заболеваниях, когда добавление генf не является подходящим методом из-за требования подавления или устранения доминантно-отрицательного мутантного аллеля. Например, редактирование оснований может представлять собой привлекательный подход для целенаправленной коррекции распространенной мутации P23H в гене родопсина (RHO), связанной с adRP. Аналогичным образом, редактирование оснований может предложить новый терапевтический путь для коррекции гетерозиготных мутаций C > T в GUCY2D, являющихся основной причиной аутосомно-доминантной cone-rod dystrophy (CORD6). Би-аллельный нокаут гена GUCY2D в сетчатках взрослых мышей и NHP показал истончение наружного ядерного слоя и наружной ограничительной мембраны.24 Это было связано с чрезмерной потерей белка retGC во взрослой сетчатке; таким образом, редактирование оснований потенциально может решить эту проблему путем целенаправленной коррекции мутантного аллеля.
Кроме того, CRISPR-опосредованное редактирование оснований может обеспечить новый подход к воздействию на альтернативный комплементарный путь , который вызывает воспаление RPE. Недавно стратегия редактирования оснований для исправления распространенного SNP (rs1061170), связанного с риском возрастной макулярной дегенерации (AMD), в гене фактора комплемента H (CFH) показала 21,5% эффективность исправления нуклеотидов C-в-T без обнаружения эффектов вне мишени в клеточной линии HEK293A, экспрессирующей патогенный вариант CFH.25 Терапевтические перспективы прайм-редакторов могут быть особенно полезны при решении проблемы гетерогенности мутаций IRD. Одним из прогнозируемых применений является его использование в ABCA4, который имеет мутационно разнообразный, но кластеризованный спектр мутаций.26 Вырезание и замена кластеров мутаций позволит исправить несколько различных мутаций с помощью одного подхода.
Остаются значительные проблемы с доставкой терапевтических систем редактирования оснований и прайм-редактирования в клетки сетчатки. Цитозиновый или адениновый редактор оснований плюс направляющая гид РНК составляют в общей сложности ~6 kb, в то время как прайм-редакторы - более 7 kb, что значительно превышает ограничения по упаковке одного вектора AAV. Использование Cas9-ортологов меньшего размера может помочь смягчить эту проблему, хотя доставка остается сложной задачей. Надежная оценка метода доставки, долгосрочных последствий экспрессии и эффективности редактирования in vivo будет иметь большое значение для продвижения редактирования оснований и редактирования праймеров в клинику.

Эпигенетическое редактирование


Помимо редактирования генов, CRISPR-Cas9 может использоваться для регуляции транскрипции, при этом каталитически инактивированный "dead" Cas9 (dCas9) белок соединяется с транскрипционными эффекторами для прямой репрессии генов (так наз. CRISPR-интерференция или CRISPRi) или модифицируется для работы в качестве функционального транскрипционного активатора (CRISPRa)27 (рис. 1D). Многие группы показали, что простое связывание dCas9 с промоторами и другими регуляторными регионами может подавлять транскрипцию, стерически препятствуя действию РНК-полимеразы.27 Тем не менее, репрессивная способность системы значительно улучшается, когда dCas9 связан с доменом транскрипционного репрессора.28 CRISPRi можно использовать для подавления экспрессии патогенных генов, вовлеченных в заболевания сетчатки. Самое большое преимущество CRISPRi заключается в его обратимости, поскольку в геном не вносятся необратимые изменения. Таким образом, скоротечный метод доставки, например, доставка рибонуклеопротеина (РНП), способен обеспечить такой же кратковременный эффект.
Moreno et al.29 соединили dCas9 с Kruppel-associated box (KRAB) для направленной репрессии Nrl, главного регулятора детерминации палочковидных фоторецепторов. Авторы продемонстрировали, что нокдаун Nrl может опосредовать перепрограммирование палочковидных клеток в конусоподобные клетки, устойчивые к мутациям, специфичным для пигментного ретинита.29 Хотя этот подход может уменьшить количество и функцию палочковых фоторецепторов и, следовательно, привести к снижению ночного зрения, относительное сохранение колбочек может позволить пациентам сохранить остроту зрения и центральное зрение.
CRISPRi может иметь терапевтический потенциал при заболеваниях, вызванных развитием хороидальной неоваскуляризации, таких как влажная AMD. Например, CRISPR-опосредованное редактирование эпигенома может представлять собой новый подход для надежного и долгосрочного подавления фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-A) и обращения вспять фенотипа, связанного с AMD (Таблица 1).30 Кроме того, CRISPRi может обратимо заглушать мутантный аллель RHO (P23H) при adRP,17 тем самым обеспечивая более безопасную альтернативу indels-опосредованному разрушению мутантного аллеля, которое может быть связано с внецелевым нарушением аллеля дикого типа.
До настоящего времени применение CRISPRa было направлено на скрининг генов, но мы можем представить себе этот подход как альтернативу добавлению генов. CRISPRa полезна для лечения гаплонедостаточности, когда одной копии гена недостаточно для обеспечения нормального фенотипа, например, для супер-экспрессии гена PRPF31 рри adRP.31 Хотя CRISPRa обеспечивает преимущество в случае генов, которые слишком велики для доставки векторами AAV, этот подход потенциально чреват токсичностью, связанной с избыточной экспрессией генов. Несмотря на свои терапевтические перспективы, CRISPRa и CRISPRi могут иметь дополнительные ограничения. Важно отметить, что (i) CRISPRi не обладает аллельной специфичностью, поскольку оба аллеля используют один и тот же промотор, (ii) как CRISPRa, так и CRIPSRi могут оказывать воздействие помимо мишени на алогичные последовательности промотора, и (iii) для терапевтического эффекта обоих методов требуется постоянная и длительная экспрессия Cas9.

RISKS OF RETINAL GENE EDITING


Редактирование генома с помощью систем CRISPR-Cas9 in vivo сопряжено с рядом потенциальных рисков, в частности, с пагубными последствиями внецелевых мутаций, онкогенностью, возникающей в результате создания DSBs, и иммуногенностью, связанной с компонентами редактирования генома. Поэтому клиническая жизнеспособность терапии редактированием генома должна оцениваться с учетом соотношения риска и пользы.

Potential off-target effects


Специфичность систем CRISPR-Cas зависит от комплементарности 17-20 нт sgRNA, а также от способности самой эндонуклеазы. Экспериментально в клеточных линиях человека были выявлены сайты "вне мишени", в которых наблюдалось до пяти или шести несоответствий в guide RNA.32 Существует ряд компьютерных алгоритмов для предсказания сайтов мутаций "вне мишени" для систем CRISPR-Cas in silico. Эти инструменты полезны для проектирования sgRNA, но имеют ограниченную точность, хотя можно ожидать, что в будущем она улучшится за счет использования накопленных больших наборов данных и подходов машинного обучения.33
Экспериментальные анализы для беспристрастного обнаружения нецелевых мутаций включают методы in vitro, основанные на анализе генома, и клеточные методы.34 Кроме того, для оценки безопасности редактирования генов сетчатки в доклинических исследованиях с участием NHP может использоваться секвенирование целого экзома или секвенирование целого генома с использованием геномной ДНК из другого глаза в качестве эталонной последовательности. Хотя каждый метод имеет свои ограничения, на практике для оценки потенциальных внецелевых эффектов терапии при редактировании генома на разных стадиях разработки будут использоваться комбинации методов.
Несмотря на опасения по поводу нецелевых мутаций, вызванных CRISPR in vivo, доклинические исследования Maeder и др.10 показали, что 84-88% предсказанных внецелевых мутаций были ниже порога обнаружения 0,1% после SaCas9-опосредованного редактирования генов в клеточных линиях человека (U2OS и ARPE-19) и эксплантатах сетчатки человека с использованием комбинации GUIDE-seq и Digenome-seq.10 Это обнадеживает терапевтическое редактирование генома, хотя долгосрочное накопление даже редких мутаций остается источником клинических проблем. В настоящее время ведутся работы по мутагенезу и инженерии Cas9 с целью создания эндонуклеаз с большей специфичностью к мишени и меньшими эффектами вне мишени, что может значительно помочь в продвижении CRISPR-терапии.15
Экспрессия цитидиновых или адениновых деаминаз в составе конструкций для редактирования оснований ДНК создает дополнительные источники внецелевых эффектов. Например, секвенирование всего генома индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, стабильно экспрессирующих цитидиновый редактор оснований, вариант AncBE4Max Apobec1, продемонстрировало мутации C-в-T и C-в-G вне предсказанных in silico сайтов вне мишени, что совместимо с характером мутагенеза APOBEC35. Более того, цитидиновые и адениновые редакторы оснований могут быть нацелены как на ДНК, так и на РНК; таким образом, они способны вызывать внецелевое редактирование РНК в масштабах транскриптома, включая само-редактирование собственных транскриптов.36 Эту проблему можно решить с помощью модифицированных деаминаз с пониженной активностью нецелевого редактирования РНК, но с сохранением активности редактирования ДНК.36,37.
По сравнению с редактированием оснований, редактирование праймеров, по-видимому, связано с более низким уровнем нецелевых мутаций в клеточных линиях человека.22 Такая высокая специфичность может быть результатом дополнительных гибридизационных событий, необходимых при праймер-редактировании: то есть гибридизации между матрицей для обратной транскрипции и последовательностью мишени ДНК. Однако prime-редактирование потенциально может привнести небольшие вставки в сайт-мишень, поскольку активность обратной транскриптазы может распространяться на короткое расстояние в pegRNA-каркасе за пределы последовательности праймера. Кроме того, введение экзогенной обратной транскриптазы требует осторожности в связи с потенциальным воздействием на спящие провирусные или ретро-элементы. Хотя ранний транскриптомный анализ линий человеческих клеток, отредактированных по праймерам, не выявил каких-либо значительных токсических эффектов, клиническая жизнеспособность и безопасность редактирования праймеров in vivo еще предстоит проверить.22

Concerns related to oncogenicity


Вторым аспектом является онкогенный потенциал длительной экспрессии Cas9 in vivo. Помимо редких, но, возможно, пагубных эффектов внецелевых мутаций на гены-супрессоры опухолей, Cas9-индуцированные DSB могут усиливать транслокации или интеграции в хромосомы генома вируса AAV.5 Кроме того, Cas9-индуцированные DSBs вызывают остановку клеточного цикла в иммортализованных клетках RPE человека посредством активации опухолевого супрессора p53.38,39 Хотя это потенциально может стимулировать положительный отбор p53-дефицитных клеток в делящейся популяции (например, при редактировании ex-vivo стволовых кроветворных клеток), это вряд ли может представлять значительную проблему при редактировании генома сетчатки в окончательно дифференцированных фоторецепторах и обычно не делящемся RPE. Напротив, было показано, что преходящее ингибирование р53 является потенциальным дополнением для увеличения скорости гомологичной рекомбинации с донорской матрицей по сравнению с NHEJ; таким образом, оно может быть полезным при prime-редактировании38.

Immune and inflammatory responses


Происхождение компонентов CRISPR-Cas9 из обычных бактерий повышает вероятность внутриглазной иммунной и воспалительной реакции на редактирование генов сетчатки in vivo, что может привести к повреждению клеток и снижению клинической эффективности. Предсуществующие антитела к SaCas9 и SpCas9 были обнаружены у 78% и 58% людей,40,41 а также у NHP.10 Однако, у NHP не наблюдалось значительного воспаления после субретинального введения векторов AAV5, кодирующих конструкцию редактирования генов CRISPR-SaCas9, направленную на GUCY2D при аутосомно-доминантном CORD.24
Увеличение количества AAV-нейтрализующих антител и Cas9-специфических Т-клеточных ответов коррелировало с количеством созданных субретинальных кровоизлияний. Ни существовавшие ранее, ни индуцированные антитела и Т-клеточные реакции не привели к значительному внутриглазному воспалению у обработанных животных и не ограничили уровень редактирования генов. Фактически, животное с самым высоким ответом Т-клеток на Cas9 до введения дозы показало самую высокую эффективность редактирования при исследовании редактирования генов GUCY2D.24 Аналогичным образом, субретинальная доставка кодированного AAV5 CRISPR-SaCas9 для исправления распространенной глубокой интронной мутации в CEP290, связанной с LCA10, под названием EDIT-101 (Editas Medicine, Inc.), вызвала только слабые иммунные реакции у NHP без необходимости системной иммуносупрессии10. Воспалительные реакции коррелировали с уровнем антител к AAV5, но опять же, NHP с самым высоким уровнем уже существующих анти-SaCas9 Т-клеток обнаруживали наибольшую эффективность редактирования.

STRATEGIES TO CONTROL Cas9 ACTIVITY AND IMPROVE SAFETY


Поскольку большинство проблем безопасности терапевтического редактирования генома связаны с постоянной активностью Cas9 in vivo, могут быть разработаны различные стратегии для обеспечения преходящей или контролируемой экспрессии Cas9 (рис. 2).



Figure 2. Strategies to mitigate the risks of off-target editing. (A) Delivery of Cas9-sgRNA RNPs. RNPs can be packaged into synthetic gold or lipid nanoparticles for delivery by injection to the subretinal space. Nanoparticles that are taken up by retinal cells release the RNPs to perform gene editing until they are naturally degraded, providing transient activity to minimise off-target editing. (B) Temporal control of gene editing with small-molecule drugs. Narrowing the time window for gene editor activity can significantly reduce off-target editing and may be achieved with small-molecule-inducible systems. Successfully implemented systems include: (I) inducible expression of editing components through drug-sensitive repressors; (II) inducible stabilization of Cas9 by insertion of a ligand-binding domain into Cas9; and (III) inducible complex assembly by insertion of a drug-responsive intein domain. (C) RNA editing with REPAIR/RESCUE. A catalytically dCas13b is fused to the RNA deaminase domain from ADAR (ADARDD). The fusion utilizes a gRNA to locate the target RNA sequence and allow the deaminase to convert a pathogenic point mutation (shown in red) from A to I or C to U in the case of REPAIR and RESCUE, respectively. Incorporating a mismatched C or U into the desired position of the guide sequence (shown in light blue) improves the specificity of editing. dCas13b, dead Cas13b; RNP, ribonucleoprotein.



Delivery of Cas9-sgRNA RNPs


Cas9-sgRNA RNPs разрушаются примерно через 3 дня в клетках RPE.30 Для достижения преходящей активности редактирования генома следует рассмотреть невирусные векторы, так как они обеспечивают низкий риск иммунных реакций или инсерционного мутагенеза и обладают большей способностью доставки громоздких RNPs, ДНК или РНК конструкций (рис. 2А). Действительно, невирусные стратегии, основанные на физических (включая электропортацию, генную пушку, нуклеофекцию) и химических (включая системы с наночастицами) методах, достигли значительного прогресса. Кроме того, конъюгация РНК или нуклеиновых кислот с проникающими в клетки пептидами может еще больше улучшить доставку больших молекул в клетки сетчатки.42
Однако на сегодняшний день большинство невирусных методов доставки не применимы для клинической доставки генов из-за низкой эффективности или токсичности. Использование таких методов для доставки плазмидных последовательностей, содержащих большие трансгенные элементы, также вызывает опасения по поводу неконтролируемого распространения генов, устойчивых к антибиотикам, или других последовательностей, полученных от бактерий. Миникольца - это производные плазмид, лишенные бактериальных базовых элементов, что, как известно, повышает эффективность трансфекции, вероятно, из-за своего меньшего размера и, таким образом, они более приспособлены для достижения терапевтической экспрессии генов.43 Миникольца оказались надежным инструментом для эффективной экспрессии трансгенов в эукариотических клетках как in vitro, так и in vivo, а также для модификации ex vivo в ряде приложений клеточной и генной терапии, включая фоторецепторы.44 Их потенциальное применение для редактирования генов сетчатки еще предстоит оценить.

Drug-inducible Cas9 activity


Что касается редактирования генома с помощью вирусных векторов, индуцибельные конструкции Cas9 могут обеспечить преходящую и регулируемую экспрессию Cas9, тем самым предотвращая долгосрочное накопление мутаций вне мишени (рис. 2B). Временной контроль экспрессии Cas9 может быть достигнут путем использования преходящих или лекарствами индуцируемых промоторов, например, стероид-индуцируемых промоторов GRE5.45 Клиническая жизнеспособность стероид-индуцируемых промоторов облегчается наличием готовых к применению кортикостероидных глазных капель, периокулярных инъекций и внутриглазных имплантатов, которые также обеспечивают местную иммуносупрессию после генной терапии сетчатки. Однако следует учитывать опасения по поводу утечки экспрессии при использовании стероид-индуцируемых промоторов, поскольку даже очень низкая базовая экспрессия Cas9 может привести к накоплению внецелевых мутаций с течением времени.
Одним из лекарственно-индуцируемых промоторов, который может обеспечить более жесткий транскрипционный контроль экспрессии Cas9, является доксициклином (или тетрациклином) - индуцируемая система Tet-ON. Tet-ON-регуляция экспрессии Cas9 и sgRNA обеспечила временной контроль редактирования генов в клетках.46 Это послужило ценным доказательством концепции временного контроля редактирования генов, но in vivo доставка эффективной лекарственно-индуцируемой системы редактирования генов еще не описана. Вероятно, это связано с проблемой доставки экзогенных компонентов регуляции транскрипции, таких как обратный тетрациклиновый транс-активатор, в дополнение к Cas9 и sgRNA. Несмотря на то, что системы Tet-ON улучшают герметичность экспрессии по сравнению со стероид-индуцируемыми системами, они, тем не менее, не свободны от утечек и могут вызывать аналогичные опасения по поводу накопления мутаций с течением времени. Хотя лентивирусные векторы могут быть использованы для доставки систем Tet-ON в определенные типы клеток и тканей, но они, как правило, плохо переносятся фоторецепторами и вряд ли смогут достичь достаточной эффективности для терапевтического редактирования генов сетчатки.46
Альтернативной стратегией временного контроля активности Cas9 является индукция с помощью малых молекул на пост-трансляционном уровне, и было описано несколько таких систем.47 Была предложена деградация белка Cas9, вызываемая лекарственными препаратами, путем привлечения убиквитин-лигазы,47 однако это потребовало бы постоянной доставки лекарства. В отличие от этого, белки Cas9, активируемые малыми молекулами, представляются более применимыми для клинического редактирования генома. Одной из перспективных стратегий является вставка чувствительного к 4-гидрокситамоксифен (4-HT) домена intein в нуклеазу Cas9, который облегчает сплайсинг внутреннего белка для получения активного белка Cas9 только в присутствии тамоксифена.48 В качестве альтернативы, вставка от рецептора эстрогена-α (hERα) лиганд-связывающего домена в Cas9 для обеспечения аллостерической стабилизации белка только в присутствии 4-HT.
Лиганд-связывающий домен hERα был также присоединен к концам белка Cas9, что привело к его секвестрации в цитоплазме до тех пор, пока 4-HT-активированная транслокация в ядро не позволит редактировать геном.50 Эти системы продемонстрировали повышенную специфичность, достижимую с помощью индуцибельного Cas9. Однако в настоящее время они ассоциируются с пониженной эффективностью редактирования мишени по сравнению с аналогами Cas9 дикого типа, что, вероятно, связано с изменениями в структуре Cas9. Кроме того, эти системы основаны на крупном SpCas9, соединенном с другими громоздкими компонентами, что затрудняет их доставку с помощью векторов AAV. Хотя эти подходы многообещающие, необходимы дальнейшие усилия по оптимизации, чтобы получить легко доставляемый и терапевтически эффективный лекарственно-чувствительный белок Cas9.

Self-destructing CRISPR-Cas9


Само-разрушающиеся системы CRISPR, включающие самонаводящуюся sgRNA, были предложены и оказались жизнеспособными для редактирования генов сетчатки без ущерба для эффективности целенаправленного воздействия.51 Еще предстоит выяснить, смогут ли такие системы обеспечить полную инактивацию активности Cas9 in vivo и как они будут сочетаться с транскрипционными и пост-трансляционными регуляторными системами.

mRNA editing


Наконец, редактирование мРНК, а не ДНК, может обойти риски, связанные с редактированием генома, поскольку события вне мишени не приводят к настоящим мутациям.52 Большинство редакторов РНК используют домен деаминазы из человеческой аденозиндезаминазы, действующей на РНК типа 2 (ADAR2DD), которая преобразует аденозин в инозин преимущественно в белок-кодирующих областях пре-мРНК в её нативной роли. Образованный инозин затем интерпретируется как гуанозин при трансляции рибосомным механизмом.52 Слияние ADAR2DD с доменом направляющим гид РНК и связывающим РНК облегчает сайт-специфическое редактирование A-в-I в мРНК.
Были исследованы различные управляемые РНК ADAR2DD системы, например, слияние ADAR2DD с каталитически мертвой (dead) Cas13b (dCas13b) целенаправленно воздействующей на РНК (рис. 2A). Cox et al. разработали REPAIRv1 путем слияния dCas13b из Prevotella sp. P5-125 (dPspCas13b) с ADAR2DD(E488Q), гиперактивным мутантом с повышенной эффективностью редактирования A-в-I.53 Дополнительная мутация T375G в домене ADAR2DD, как было установлено, увеличивает специфичность в 919 раз при скромном снижении эффективности целенаправлененого воздействия, что позволило создать REPAIRv2. Недавно подход ADAR2DD-dCas13b был распространен на редактирование цитидина в уридин. Рациональный мутагенез ADAR2DD для создания цитидиндеаминазной активности и последующее слияние с dCas13b из Riemerella anatipestifer (dRanCas13b) позволили получить RESCUE (RNA Editing for Specific C-to-U Exchange).54 Вместе REPAIR и RESCUE позволяют исправлять до 61% патогенных точечных мутаций в мРНК.52 Кроме того, С-концевое укорочение dPspCas13b и dRanCas13b в REPAIR и RESCUE, соответственно, позволяет получить активные редакторы РНК, которые достаточно малы, чтобы быть упакованными в одиночные AAV.
Одной из ключевых проблем терапевтического редактирования РНК является необходимость стабильной и с длительной экспрессией редактирующей конструкции в клетках-мишенях. Оценка этих и других подходов к редактированию мРНК in vivo будет необходима для определения возможности их доставки и клинической эффективности.

MOVING RETINAL GENE EDITING TOWARD CLINICAL APPLICATION


Доказанная безопасность и клинический успех опосредованного вектором AAV введения генов для лечения рецессивных IRDs, связанных с мутациями потери функции3,6,7 , позволяет предположить, что новые стратегии редактирования генов лучше всего применять к мутациям, не поддающимся этому терапевтическому подходу. В первую очередь, следует ожидать, что специфические для мутаций подходы к редактированию генома будут направлены на борьбу с наиболее частыми мутациями, связанными с IRDs, в генах, которые находятся за пределами кодирующей ёмкости отдельных векторов AAV. Кроме того, терапия редактированием генов, вероятно, будет наиболее полезной, когда необходимо исправить или подавить доминантно-отрицательную мутацию или мутацию с усиленной функцией. Такие доминантно-негативные или сплайсинг мутации также могут поддаваться лечению с помощью доставляемой в стекловидное тело терапии с помощью ASO, что следует рассматривать как потенциально более безопасную альтернативу постоянному редактированию генома.9
Для мутаций, вызывающих гаплонедостаточность, может быть рассмотрено редактирование оснований, прайм-редактирование или CRISPRa, хотя технические проблемы, связанные с доставкой этих систем в клетки сетчатки, остаются. Также изучаются более общие подходы для замедления прогрессирования заболевания или восстановления зрительных функций при IRDs, включая AAV-опосредованную нейропротекцию55 и перепрограммирование фоторецепторов посредством AAV-CRISPR/Cas9-опосредованного нокдауна NRL.56 Кроме того, необходимо изучить пути воздействия на общие нейродегенеративные и нейровоспалительные заболевания, участвующие в прогрессировании IRDs, возрастной макулярной дегенерации и глаукомы.
Системы CRISPR/Cas, способные целенаправленно уничтожать мутантные аллели и вносить желаемые геномные изменения, вызвали ренессанс в области генотерапии. Появление и быстрое развитие редактирования оснований, редактирования праймеров и редактирования мРНК, как ожидается, сделает редактирование генов более безопасным в будущем. Внося лишь ограниченные изменения в последовательность направляющей гид РНК при сохранении идентичности остальных частей системы генного редактирования, можно исправить большое количество патогенных мутаций, связанных с наследственными заболеваниями сетчатки. Это делает технологии генного редактирования привлекательными для клинической разработки, особенно учитывая гетерогенную природу IRDs.
Одним из ключевых соображений при тестировании генно-редактирующих терапий является то, что специфическая для приматов природа терапевтических sgRNA требует проведения доклинических испытаний на тканях человека и NHP; таким образом, затраты на разработку таких терапий будут значительными (рис. 3). В связи с этим разработка органоидов сетчатки человека, вероятно, окажется полезной для упрощения и снижения затрат на доклиническую оценку терапевтических препаратов для редактирования генов сетчатки. Кроме того, как только несколько прототипов систем генного редактирования сетчатки пройдут тщательное тестирование in vivo на NHP или людях,10,24 будущие пути клинической разработки могут стать более простыми.



Figure 3. Pathway for developing retinal gene-editing therapies.

Conclusions


The AAV vector-mediated gene supplementation has demonstrated the feasibility of therapeutic gene therapy in the retina, whereas CRISPR/Cas9 systems can potentially allow a much broader range of inherited retinal diseases to be treated. Although the preclinical studies of EDIT-101 have delivered highly encouraging results, much attention will now be focused on the outcomes of the phase I/II clinical trial, which has dosed its first patient in early 2020. In vivo gene editing poses new challenges associated with drug delivery and questions with regards to long-term safety. Currently, the field is undergoing rapid development with a number of competing gene-editing strategies, including allele-specific knockdown, base editing, prime editing, and RNA editing, that are under investigation, with each offering a differing balance of on-target editing efficiency versus off-target risks. Moreover, a variety of strategies to improve temporal control of gene-editing systems in vivo need to be explored to minimize long-term risks. Testing these newly developed CRISPR technologies in human retinal tissue, organoids and in vivo will help to highlight the most viable therapeutic approaches for treating inherited retinal diseases in the future.