Транстиретиновый амилоидоз - это опасное для жизни заболевание, вызванное накоплением неправильно сформированного белка transthyretin (TTR) в виде амилоидных фибрилл в нервах и кардиомиоцитах, что в конечном итоге приводит к амилоидной полинейропатии, кардиомиопатии или комбинации обоих заболеваний. NLTA-2001 - это препарат, использующий систему CRISPR-Cas9 для ингибирования производства TTR в его источнике в печени. В частности, lipid nanoparticles (LNPs) с печеночным тропизмом загружаются мРНК, кодирующей эндонуклеазу Cas9, и соответствующей направляющей гид РНК (система CRISPR-Cas9). После внутривенного введения эти частицы трансдуцируют гепатоциты in vivo и выводят из строя TTR посредством активности CRISPR-Cas9 с последующим негомологичным соединением концов ДНК. Тропизм к гепатоцитам осуществляется посредством аполипопротеин Е, который опосредует связывание LNPs с рецепторами low-density lipoprotein (LDL). В недавней статье, опубликованной в New England Journal of Medicine, Gillmore и его коллеги сообщили, что однократного приема NLTA-2001 достаточно для снижения уровня TTR в сыворотке крови пациентов на 96% (ссылка 1), что свидетельствует о действенности этой стратегии. Ожидается, что такое снижение уровня TTR, если оно будет продолжительным, улучшит симптомы заболевания и послужит убедительным доказательством того, что редактирование генов достигло следующего уровня в клинической разработке.

До эпохи редактирования генов введение функциональной копии гена представляло собой единственную доступную стратегию для успешного лечения аутосомно-рецессивных моногенетических заболеваний, что подтверждается одобрением на рынке препаратов генотерапии, которые все опираются на эту концепцию. Однако эта концепция редко может быть применена к аутосомно-доминантным заболеваниям, таким как наследственная форма транстиретинового амилоидоза, поскольку доминантно-отрицательные эффекты можно лечить только с помощью стратегии аллель-специфического подавления. В этом контексте успешно применяются подходы, направленные на РНК-транскрипты (например, с помощью РНК-интерференции).

Искусственно созданные нуклеазы и, в частности, система CRISPR-Cas9 с целенаправленным воздействием на РНК, пионерами которой стали Jennifer Doudna и Emmanuelle Charpentier², могут считаться переломными моментами, поскольку они дают возможность точной модификации генома, направленной на устранение основного дефекта. Это, несомненно, представляет собой святой Грааль амбиций генотерапии, поскольку поврежденный ген, когда он восстанавливается с помощью специально разработанной модификации генома, находится в своей естественной внутриядерной среде и контролируется своими естественными промоторными и усиливающими элементами. Хотя этот подход показал свою эффективность на животных моделях, перевод его в клинические испытания на людях остается чрезвычайно активной областью исследований во всем мире³.

Ранее в этом году было описано первое успешное редактирование генов у пациентов с бета-талассемией и серповидно-клеточной анемией⁴. Как и в случае с NLTA-2001, система CRISPR-Cas9 была использована для разрушения отдельной последовательности генов путем индуцирования эндогенной репарации ДНК посредством негомологичного концевого соединения. Однако вместо того, чтобы нацеливаться на сам ген, авторы нарушили эритроид-специфический энхансер BCL11A, чтобы снизить экспрессию репрессора BCL11A, что позволило экспрессировать γ-глобин и производить фетальный гемоглобин у пациентов с бета-талассемией и серповидно-клеточной анемией. В другом исследовании воздействовали на ген, кодирующий ко-рецептор вируса иммунодефицита человека CCR₅ (CC-хемокиновый рецептор 5), чтобы нарушить проникновение этого вируса в клетки⁵. В обоих исследованиях клетками-мишенями были гемопоэтические клетки CD34+, которые были собраны у пациентов, модифицированы ex vivo и затем обратно введены пациентам после миелоаблации. Помимо использования для лечения моногенетических и инфекционных заболеваний, редактирование генома вошло в область иммунотерапии рака с помощью CRISPR-Cas9-инженерных Т-клеток⁶. Эти модифицированные Т-клетки экспрессируют рекомбинантный Т-клеточный рецептор, нацеленный на раковые антигены NY-ESO-1 и LAGE-1, с одновременным удалением иммуноингибирующего рецептора PD-1 и эндогенного Т-клеточного рецептора. Генетически модифицированные Т-клетки успешно прижились у пациентов и сохранялись до 9 месяцев.

Текущее исследование Gillmore и коллег¹ создает основу для продвижения подходов генотерапии на следующий уровень, поскольку редактирование генов переходит от генотерапии ex vivo к генотерапии in vivo (рис. 1). Использование печени в качестве терапевтической ткани-мишени и TTR в качестве гена-мишени является разумным шагом для этого первого клинического шага редактированию гена in vivo, поскольку печень относительно легко нацелить с помощью LNPs, содержащих аполипопротеин Е, а TTR экспрессируется почти исключительно (более 99%) в гепатоцитах. Кроме того, уничтожение как мутантного, так и здорового аллеля не имеет серьезных патологических последствий, поскольку единственная известная функция TTR дикого типа заключается в транспорте ретиноевой кислоты, и ее утрата может быть преодолена добавлением витамина А.



Fig. 1: In vivo and ex vivo strategies for CRISPR-Cas9-based gene editing. In vivo strategies for CRISPR-Cas9 (left) include tailored LNPs loaded with Cas9 mRNA and CRISPR single-guide RNA (sgRNA), as well as targeted adeno-associated virus (AAV) vectors equipped with the CRISPR-Cas9 system. CRISPR-Cas9-mediated gene editing of hematopoietic stem cells (HSCs) or T cells is performed ex vivo from patient-derived cells (right), and genetically modified cells are re-infused into the patient. ApoE, apolipoprotein E. Created with BioRender.com.

В перспективе генотерапия in vivo, а также "готовые" препараты, модифицированные ex vivo, считаются жизнеспособными вариантами для предоставления генотерапии всем нуждающимся пациентам, учитывая проблемы персонализированных подходов к генотерапии ex vivo. Помимо доступности высококачественных и совместимых с человеческим лейкоцитарным антигеном донорских клеток и времени, необходимого для их производства, стратегии генной терапии ex vivo зависят от специализированных лечебных центров с опытом трансплантации и оборудованием для модификации клеток, соответствующим требованиям надлежащей производственной практики.

Генотерапия in vivo решает эти проблемы и, вероятно, снизит общие затраты на такие стратегии, что, в свою очередь, повлияет на доступность этих инновационных вариантов лечения, которые изменят область медицины. Необходимым условием для этого является наличие адаптированных векторных систем, которые точно, эффективно и безопасно доставляют терапевтический груз в клетки-мишени по выбору. Был успешно разработан портфель стратегий для невирусных векторов (например, использование LNPs)^7,8 и вирусных векторов^9,10, и работа в этом направлении продолжается. Хотя результаты особенно многообещающи в контексте повышения эффективности трансдукции клеток-мишеней, результаты экспериментов по нацеливанию на клеточную поверхность показали, что доставка в мишени без эффектов вне мишени в принципе достижима, но это зависит от наличия рецепторов, специфичных для типа клеток. В настоящем исследовании уже использовалась эта стратегия путем нацеливания на рецептор LDL для повышения эффективности доставки мРНК в гепатоциты¹.

Хотя текущие данные получены на очень ранней стадии исследования (то есть через 28 дней после лечения), первые результаты впечатляют своей эффективностью и отсутствием связанных с терапией серьезных нежелательных явлений. Однако необходимы дальнейшие данные для полной характеристики этого ген-терапевтического подхода с точки зрения эффективности, продолжительности и безопасности. Безусловно, важно отслеживать потенциальные эффекты внецелевого связывания с клетками (поскольку рецептор LDL присутствует не только на гепатоцитах), а также эффекты вне мишени в геноме (включая инсерции-делеции и слияния хромосом). Такие стратегии могут быть усовершенствованы путем контролируемого регулирования компонентов CRISPR-Cas9 и включения недавно описанных передовых технологий CRISPR-Cas9, таких как редактирование оснований¹¹ и редактирование праймеров (prime editing) ¹².