Посещений:
НАРУШЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА



Подходы к генотерапии

Revisiting gene delivery to the brain: silencing and editing
Joao Conniot, Sepehr Talebian, Susana Simoes, et al.
Biomaterials Science Issue 4, 2021

Neurodegenerative disorders, ischemic brain diseases, and brain tumors are debilitating diseases that severely impact a person's life and could possibly lead to their demise if left untreated. Many of these diseases do not respond to small molecule therapeutics and have no effective long-term therapy. Gene therapy offers the promise of treatment or even a cure for both genetic and acquired brain diseases, mediated by either silencing or editing disease-specific genes. Indeed, in the last 5 years, significant progress has been made in the delivery of non-coding RNAs as well as gene-editing formulations to the brain. Unfortunately, the delivery is a major limiting factor for the success of gene therapies. Both viral and non-viral vectors have been used to deliver genetic information into a target cell, but they have limitations. Viral vectors provide excellent transduction efficiency but are associated with toxic effects and have limited packaging capacity; however, non-viral vectors are less toxic and show a high packaging capacity at the price of low transfection efficiency. Herein, we review the progress made in the field of brain gene therapy, particularly in the design of non-toxic and trackable non-viral vectors, capable of controlled release of genes in response to internal/external triggers, and in the delivery of formulations for gene editing. The application of these systems in the context of various brain diseases in pre-clinical and clinical tests will be discussed. Such promising approaches could potentially pave the way for clinical realization of brain gene therapies.
Концепция генной терапии основывается на доставке рекомбинантных нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) для добавления, замены, восстановления или даже удаления нуклеотидных последовательностей генов. Доставка нуклеиновых кислот вызывает изменение фенотипа клетки, что в случае заболевания означает замедление прогрессирования болезни или приводит к излечению. Хотя идея может показаться чрезвычайно простой, регуляция генов очень сложна, и многие заболевания возникают в результате изменения нескольких генов, как, например, некоторые нейродегенеративные заболевания, такие как болезни Альцгеймера и Паркинсона. Генотерапия также может быть использована для воздействия на раковые клетки путем введения гена, который вызывает фенотип, более восприимчивый к дополнительным терапевтическим стратегиям или даже смертельный. Несмотря на то, что внедрение генотерапии началось в начале 1990-х годов, недостаток знаний о генных векторах, клетках-мишенях и, в частности, заболеваниях, привел к неутешительным результатам.1,2 В начале 2000-х годов разработка новых векторов и инструментов редактирования генов в сочетании с более глубоким пониманием клеток-мишеней возобновила интерес, а новые испытания продемонстрировали устойчивые генетические модификации и клинические преимущества в некоторых случаях.3-5
РНК-интерференция (RNAi), с помощью которой можно специфически глушить гены болезни, имеет большой потенциал стать успешной терапевтической стратегией для лечения неврологических заболеваний.6 Малые интерферирующие РНК (siRNAs) и микроРНК (miRNAs) привлекли значительное внимание благодаря своей роли в регуляции генов, что делает их вероятными мишенями для открытия и разработки лекарств.7 Терапевтические подходы на основе siRNA предполагают введение синтетической siRNA в клетки-мишени, чтобы вызвать РНК-интерференцию (RNAi), тем самым ингибируя экспрессию определенной мРНК для получения эффекта подавления генов. В отличие от этого, терапия на основе миРНК включает два подхода: ингибирование миРНК и замена миРНК.8 Ингибирование миРНК напоминает антисмысловую терапию, при этом синтетические одноцепочечные РНК действуют как антагонисты миРНК (также известные как антагомиры или anti-miRs), подавляя действие эндогенных миРНК. С другой стороны, при подходе замещения синтетические миРНК (также известные как мимики миРНК) используются для имитации функции эндогенных миРНК, что приводит к деградации/ингибированию мРНК и вызывает эффект замалчивания генов.9 В любом случае, использование RNAi ограничено мишенями, для которых нокдаун генов выгоден. Кроме того, RNAi часто не может полностью подавить экспрессию генов и поэтому вряд ли принесет пользу при заболеваниях, при которых для терапии необходимо полное отключение функции гена.10 Поэтому технологии редактирования генома, основанные на программируемых нуклеазах, таких как нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFNs),11 нуклеазы с эффектором, подобным активатору транскрипции (TALENs),12,13 и кластеризованная регулярно перемежающаяся короткая палиндромная повторная (CRISPR)-ассоциированная нуклеаза Cas9,14 открывают возможность терапевтического редактирования генома в мутантных клетках и тканях, что приводит к удалению или исправлению пагубных мутаций или вставке защитных мутаций.
Растущий интерес к генной терапии был вызван тем, что теоретически генные подходы могут обеспечить при однократном воздействии устойчивое производство эндогенных белков клетками-мишенями, что устраняет необходимость в повторном введении белковой терапии. Однако генетические манипуляции в ЦНС сопряжены со многими трудностями. Специфические характеристики большинства нейронов, которые являются окончательно дифференцированными, требуют особых стратегий доставки, таких как векторы, которые сохраняются в пост-митотических клетках. Что касается генотерапии, которая показала многообещающие результаты при лечении ряда заболеваний ЦНС, таких как лизосомные болезни15 , болезнь Паркинсона16 , болезнь Альцгеймера17 и опухоли мозга18 , доставка генов после системного (в/в) введения остается одной из главных проблем, в основном из-за гематоэнцефалического барьера (BBB).19 Прежде чем мы добьемся широкого применения доставки генов в мозг и нервную систему, особенно в клинике, необходимо приложить дополнительные усилия для точной настройки целевых стратегий и гарантии их безопасности и эффективности.
Здесь мы рассмотрим последние достижения в области доставки генов в мозг с акцентом на замалчивание и редактирование. Хотя в недавних исследованиях были рассмотрены аспекты генотерапии мозга,20,21 они были ограничены в отношении интеграции стратегий замалчивания и редактирования и охватывали невирусные системы доставки. Вначале мы рассмотрим стратегии доставки генов в головной мозг с использованием вирусных векторов (например, аденовируса, лентивируса, вируса простого герпеса) и невирусных векторов (например, катионных липосом, катионных полимеров, органических и неорганических наноматериалов). Затем будет обсуждаться важность терапии подавляющей гены для лечения заболеваний мозга, таких как рак и нейродегенеративные заболевания. Наконец, мы расскажем о стратегиях редактирования генов мозга, сосредоточившись в основном на системе CRISPR/Cas.
2. Gene-delivery strategies to the brain


Многие хронические неврологические заболевания не реагируют на терапию малыми молекулами и не существует их эффективной долгосрочной терапии.22 Генотерапия обещает стать эффективным средством лечения как генетических, так и приобретенных заболеваний головного мозга, однако прогресс в клинических испытаниях был медленным, а основным ограничивающим фактором является доставка гена в головной мозг.23 Это связано в первую очередь со сложностью мозга, побочными эффектами и непроницаемым гематоэнцефалическим барьером (BBB).24 С этой целью для переноса генетической информации в клетку-мишень использовались различные векторы (транспортные средства), которые в основном включали вирусные и невирусные векторы (см. рис. 1).25,26 Каждый тип вектора имеет свой набор преимуществ и недостатков, поэтому в следующем разделе мы дадим полное описание каждого типа вектора и приведем соответствующие примеры их использования для доставки генов в головной мозг.



Рис. 1 Схематическое изображение вирусного (слева) и невирусного (справа) вектора для доставки генов в мозг.

2.1. Вирусные векторы


Идеальные векторы на основе вирусов для большинства приложений генотерапии используют путь вирусной инфекции, но избегают последующей экспрессии вирусных генов, которая приводит к репликации и токсичности.27 В частности, вирусные частицы инкапсулируют модифицированный геном, несущий терапевтическую генную кассету вместо вирусного генома.28 Особенностями идеального вирусного вектора являются: (i) специфический тропизм для высокоэффективной трансдукции ткани мишени и минимальной трансдукции "нецелевых" клеток, тканей или органов; (ii) способность экспрессировать трансген в течение определенного периода времени и на таком уровне, чтобы оказывать максимальное терапевтическое воздействие, вызывая при этом минимальный иммунный ответ хозяина; (iii) минимальные побочные эффекты, такие как связанные с вектором патологии и/или иммунный ответ хозяина26. Спектр вирусных векторов, используемых в фундаментальных исследованиях, включает вирусы с простым капсидом - такие как рекомбинантный аденовирус и адено-ассоциированный вирус - и другие, такие как ретровирус/лентивирус и вирус герпеса, в которых капсид окружен оболочкой из липидного бислоя29. Разница между каждым классом вирусных векторов заключается в их способности к упаковке, способности к трансдукции, интеграции в геном хозяина, длительности экспрессии трансгенов и индуцированном патогенезе.30 Следует отметить, что векторы, полученные из некоторых ретровирусов, таких как вирус мышиного лейкоза Молони (MoMLV), имеют ограниченное применение в качестве векторов для ЦНС из-за их неспособности доставлять гены в неделящиеся клетки. Ретровирусные векторы успешно применялись для модификации не нейрональных клеток ex vivo перед трансплантацией в нервную систему.31 Однако адено-ассоциированный вирус, лентивирус и вирус герпеса являются подходящими векторами для эффективной трансдукции нейронов ЦНС.26 Тем не менее, из-за свойств связывания и проникновения белков в капсид или оболочку вируса, некоторые клетки по своей природе более восприимчивы к инфекции определенными векторами. Кроме того, в зависимости от типа вируса, он может взаимодействовать с различными рецепторами клеток-мишеней, что, соответственно, опосредует различный механизм эндоцитоза.32 В целом, способы доставки вирусных векторов можно разделить на те, которые направлены на широкую доставку генов в мозг (глобальные), и те, которые направлены на определенные популяции клеток в головном мозге (фокальные). Соответственно, фокальная доставка часто достигается путем местного введения, когда векторы вводятся либо непосредственно в паренхиму мозга, желудочки или сосудистую сеть, либо опосредованно через интратекальное или интраназальное введение, при этом различные типы векторов и способы введения предназначены для поражения избранных мишеней29. Местное введение этих вирусных векторов предполагает, что фокальные способы доставки способны обойти BBB, а также они менее подвержены нейтрализации циркулирующими антителами33. Напротив, методы глобальной доставки включают инъекцию в сонную артерию, способствуя проникновению через гематоэнцефалический барьер путем локального разрушения BBB (с помощью фокусированного ультразвука, направляемого магнитным резонансом, и микропузырьков, вводимых внутривенно) или рецептор-опосредованного транспорта через трансцитоз (с помощью рецепторов трансферрина, белков родственных LDL рецепторам, или рецептора инсулина), или с помощью вирусного вектора, который естественным образом пересекает BBB (например, AAV9). 34 Тип заболевания мозга может определять подходящий метод доставки вируса. Например, фокальная доставка предпочтительна для лечения болезни Паркинсона, поскольку направлена на очаговые области патогенеза заболевания, тогда как глобальная доставка более подходит для широко распространенных заболеваний ЦНС, таких как опухоли мозга и лизосомные болезни хранения.35 В настоящее время опосредованная вирусными векторами генотерапия заболеваний центральной нервной системы сосредоточена на угрожающих жизни или серьезно ослабляющих заболеваниях, отчасти из-за неизвестных факторов риска, связанных с вирусными векторами. Неврологические заболевания, при которых эти векторы могут оказаться эффективными, включают инсульт, травму спинного мозга, нейродегенеративные заболевания, лизосомные болезни, опухоли мозга и боль.29 В следующем разделе мы рассмотрим наиболее распространенные вирусные векторы, используемые для доставки генов в головной мозг.

2.1.1 Аденовирусы...




2.1.2 Адено-ассоциированный вирус...




Fig. 2 Вирусная и невирусная доставка для замалчивания генов в головном мозге , (A) AAV-опосредованное глушение SOD1 путем избыточной экспрессии миРНК против кодирующей последовательности SOD1 человека для предотвращения дегенерации моторных нейронов, вызванной мутацией SOD1. Воспроизведено с разрешения.188 Copyright 2015, Wiley. (B) Опосредованная лентивирусом миРНК-направляемая метка нейрона ("mAGNET") для ограничения экспрессии трансгена кортикальными ингибирующими (GABA+) нейронами в неокортексе мыши (GABA mAGNET). Воспроизведено с разрешения.189 Copyright 2018, Elsevier. (C) RNAi-терапия глиобластомы человека in vivo с использованием нетоксичных химерных полимеров, нагруженных siRNA, нацеленных на мозг (ANG-CP-siRNA). Воспроизведено с разрешения.190 Copyright 2018, Elsevier. (D) Циклический пептид iRGD (CCRGDKGPDC)-конъюгированная твердая липидная наночастица (SLN) для доставки малых интерферирующих РНК (siRNAs) против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и PD-L1 для комбинированной целевой и иммунотерапии против глиобластомы. Воспроизведено с разрешения.138 Copyright 2019, American Chemical Society. (E) Адресная доставка тераностической полифункциональной поверхности золото-железо-оксид наночастицы (polyGION), загруженной терапевтическими миРНК (miR-100 и antimiR-21), к глиобластоме у мышей. Воспроизведено с разрешения.177 Copyright 2019, Elsevier.

2.1.3 Lentivirus...
2.1.4 Herpes simplex virus ...
2.2. Невирусные векторы


Хотя вирусные векторы существенно продвинули область генjтерапии, с ними связан ряд ограничений, включая канцерогенез, иммуногенность, широкий тропизм, ограниченные возможности упаковки ДНК и сложность производства векторов.118 В связи с этим невирусная генотерапия имеет потенциал для устранения многих из этих ограничений, особенно в отношении безопасности, поскольку она менее иммуногенная и не интегрируется в геном хозяина.25 Невирусные векторы также имеют потенциал для доставки большего генетического груза и обычно легче синтезируются, чем вирусные векторы.119 Тем не менее, немногие из этих векторов до сих пор были разработаны в клинических условиях из-за их низкой эффективности доставки по сравнению с вирусными векторами.118 До настоящего времени для доставки генов использовались различные невирусные векторы, включая катионные липиды и липосомы, катионные полимеры, полипептиды и органические/неорганические наночастицы.19,25,120-122. В контексте доставки генов идеальный невирусный вектор должен быть нацелен на определенную популяцию клеток для доставки своей полезной нагрузки в виде конденсированной ДНК или РНК, чтобы опосредовать соответствующую внутриклеточную доставку достаточного терапевтического количества для достижения функционального результата.25 Однако, в зависимости от способа введения (системного или местного), невирусные векторы могут сталкиваться с различными барьерами.
Соответственно, системно доставляемые невирусные векторы должны предотвращать деградацию эндонуклеазами сыворотки крови и избегать иммунного распознавания (что может быть достигнуто путем химической модификации нуклеиновых кислот и инкапсуляции векторов). Они также должны избегать очистки почками из крови и предотвращать неспецифические взаимодействия, используя полиэтиленгликоль (ПЭГ) или благодаря специфическим характеристикам частиц.118 Кроме того, для успешной доставки генов в ЦНС невирусные векторы должны проходить через ВВВ. Соответственно, структурные и физико-химические свойства векторов, включая размер молекулы, заряд, потенциал водородных связей и липофильность, и определяют механизм прохождения через ВВВ.123 Соответственно, были предложены следующие механизмы переноса: (i) векторы открывают плотные соединения между эндотелиальными клетками или вызывают местное токсическое воздействие, что приводит к локальной проницаемости ВВВ, позволяющей проникнуть грузу, конъюгированному с векторами (это также может быть достигнуто путем осмотического разрушения, ультразвукового или магнитного разрушения, хотя они могут нарушить целостность ВВВ124); (ii) векторы проходят через эндотелиальную клетку путем трансцитоза (через абсорбционно-, транспортерно- или рецепторно-опосредованный трансцитоз125); или (iii) сочетание нескольких механизмов, описанных ранее. 19 Более того, после прохождения через ВВВ векторы должны избирательно воздействовать на больные клетки, сводя к минимуму проникновение в нормальные клетки мозга.126 Кроме того, после интернализации векторы сталкиваются с новым набором внутриклеточных препятствий (включая воздействие эндолизосом, транспорт через цитоплазму, ядерную локализацию и распаковку), которые необходимо преодолеть для успешной доставки генов.119 Тем не менее, для достижения эффективных концентраций в мозге векторы должны вводиться в дозах, которые не связаны с неблагоприятными эффектами в периферических органах.127
Поэтому, локальная доставка невирусных векторов была предложена в качестве альтернативного подхода для преодоления некоторых препятствий, связанных с их системной доставкой. Таким образом, интрапаренхимное (непосредственно в больные участки мозга, что облегчается конвективной доставкой или включением в биоразлагаемые полимерные имплантаты), интравентрикулярное (в спинномозговую жидкость, образующуюся в желудочках мозга), интратекальное (в интратекальное пространство, окружающее спинной мозг) и интраназальное введение использовались в качестве местных подходов к доставке генов с помощью невирусных векторов в ЦНС, 128-130, хотя местные способы доставки подвержены ограничениям, таким как локальная травма нейропиля мозга, которая приводит к воспалению и токсичности, а также ограниченная диффузия из места инъекции (для внутрипаренхимального способа), и конечное низкое соотношение успешно доставленных векторов в мозг (для интратекального и интраназального способов). 131 В следующем разделе мы рассмотрим наиболее часто используемые невирусные векторы для доставки генов в мозг.
2.2.1 Катионные частицы на основе липидов...
2.2.2 Cationic polymers ...
<
2.2.3 Organic and inorganic nanomaterials...


3 Gene therapy: replacement and silencing
<
3.1 Gene therapy in inherited diseases


Некоторые врожденные генетические дефекты оказывают пагубное влияние на мозг, например, лизосомные болезни хранения (LSD. При LSD генетические дефекты приводят к дисфункции лизосом, что приводит к накоплению нерасщепленных липидов, гликопротеинов и/или гликозаминогликанов. Как следствие, морфология клеток может быть изменена вследствие высокого окислительного стресса, выраженного воспаления нейронов и нарушения функций тканей и органов.191,192 Существующие в настоящее время методы лечения LSD основаны на замене ферментов или трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, которые являются чрезвычайно дорогостоящими и имеют неясную долгосрочную эффективность.193 Эти метаболические наследственные заболевания являются перспективными кандидатами для генотерапии мозга, поскольку они обычно являются результатом дефекта одного гена, и нефункциональный мутировавший ген можно заменить и восстановить нормальный фенотип. Генотерапия может предложить более доступное, комплексное лечение всех состояний при этих заболеваниях. Некоторые доклинические исследования и клинические испытания уже показали многообещающие результаты при различных заболеваниях, таких как болезнь Гоше,194 мукополисахаридоз,195,196 и болезнь Нимана-Пика типа С1,197,198 с помощью заместительной генотерапии.
3.2 Генотерапия при приобретенных заболеваниях


Несмотря на то, что генетическая структура приобретенных заболеваний намного сложнее, чем врожденных дефектов одного гена, генотерапия также может стать актуальным подходом при нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезни Паркинсона (PD) и Альцгеймера (AD), или при опухолях мозга.
3.2.1 Болезнь Паркинсона


При PD происходит прогрессирующая потеря dopamine (DA) нейронов в substantia nigra, это приводит к снижению уровня DA и влияет на движения и положение тела. Современные методы лечения основаны на введении предшественника DA L-dopa, что при длительном лечении приводит к сильным побочным эффектам, которые перевешивают преимущества лечения199.
Стратегии генотерапии PD основаны на переносе генов, кодирующих нейротрансмиттер-синтезирующие или метаболические ферменты, для улучшения функции нарушенного синтеза. Например, в нескольких исследованиях сообщалось об успешном переносе кДНК тирозингидроксилазы (TH), лимитирующего фермента в синтезе DA, в стриатуме. Другие гены, кодирующие дополнительные ферменты синтеза DA, такие как декарбоксилаза ароматических аминокислот (AADC)200,201 и GTP cyclohydrolase (GTPCH)202 также были доставлены и, как было показано, максимизировали продукцию DA в стриатуме. Замалчивание гена SNCA (альфа-синуклеина) с помощью siRNA и shRNA также показало многообещающие результаты как in vitro, так и in vivo: уменьшение количества SNCA в мозге и смягчение двигательной дисфункции.203,204 С другой стороны, генотерапия также может использоваться для доставки генов трофических факторов и защитных белков, чтобы замедлить или блокировать нейродегенеративный процесс. Примерами молекул, ограничивающих прогрессирование PD, являются антиапоптотические, антиоксиданты и трофические пептидные факторы, такие как glial-derived growth factor (GDNF).205-208 Хотя этот белок не пересекает ВВВ при системном введении, генотерапия позволила доставить его в стриатум и substantia nigra, показав многообещающие результаты.208,209.
3.2.2. Болезнь Альцгеймера


AD - это прогрессирующее нейродегенеративное заболевание и наиболее частая причина деменции, характеризующаяся потерей памяти и снижением когнитивных функций.210 При AD происходит образование не только внеклеточных бляшек бета-амилоида (Аβ), но и, параллельно, внутриклеточных нейрофибриллярных клубков NFTs путем отложения гиперфосфорилированного белка Tau. Несмотря на то, что весь механизм патологии до сих пор неясен, исследования показали, что AD вызывается воспалительным процессом, который возникает в результате сочетания генетических и экологических факторов211.
Существующие в настоящее время методы лечения AD основаны на ингибиторах антихолинэстеразы и антагонистах NMDA для улучшения когнитивных функций и поведения. Однако эффективность этих препаратов была весьма ограниченной.212 Стратегии генотерапии до сих пор были направлены на уменьшение фосфорилирования Tau и бляшек Аβ. Наиболее очевидной мишенью для замалчивания генов является белок-предшественник амилоида (APP), протеолиз которого приводит к повышению уровня белка Aβ Однако этой стратегии замалчивания избегают из-за роли APP в развитии и дифференциации нейронов.213 В качестве альтернативной мишени были использованы ферменты, такие как β-секретаза, которые отвечают за расщепление APP, что приводит к накоплению белка Aβ. Доставка в естественных условиях siRNA для замалчивания β-секретазы привела к уменьшению накопления бета-амилоида (Aβ) в гиппокампе, а также к улучшению познавательной деятельности и памяти у мышей.153. Селективное замалчивание гена glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3β), фермента, участвующего в фосфорилировании Тау, вызвало сохранение памяти и синаптической пластичности у мышей.214 В клинических испытаниях ex vivo доставка генов фактора роста нервов (NGF) ослабила скорость снижения когнитивных способностей.215,216.
3.2.3. Brain tumors


Несмотря на достижения в области химио- и радиотерапии, а также новые хирургические методы, пациенты со злокачественными опухолями имеют плохой прогноз. Ограниченная эффективность имеющихся методов лечения объясняется генетическими мутациями в опухолевых клетках, которые становятся устойчивыми и избегают апоптоза.217 В целом, генотерапию против рака можно разделить на способствующую апоптозу генотерапию, суицидную генотерапию, антиангиогенную генотерапию, иммуномодулирующую генотерапию, терапию siRNA, редактирование генов или даже онколитическую генотерапию.218 В терапии опухолей мозга исследования были сосредоточены на цитотоксических или иммуномодулирующих стратегиях. Цитотоксическая генотерапия основана на доставке про-апоптотических генов, таких как p53-управляемый модулятор апоптоза, PUMA,219 или Bax,220 генов, которые сенсибилизируют клетки к лекарствам и радиации,221-223 или даже генов, которые модулируют ангиогенез.110 Онколитические вирусы, которые по своей природе токсичны для опухолевых клеток, также дали многообещающие результаты в качестве цитотоксического подхода.224-226 Трансфекция вируса, специфичного к аресту роста 5 (GAS5), подавляла злокачественность опухоли при глиоме за счет снижения регуляции микроРНК (miR)-222.227 Абляция онкогенного miR-10b с помощью редактирования генов показала сильный эффект в уничтожении как клеток глиомы, так и трансформированных астроцитов.228 С другой стороны, доставка генов, ответственных за иммунную модуляцию, должна повысить иммунитет по отношению к опухолевым клеткам и антигенам, а также цитотоксическую активность иммунных эффекторных клеток. В ходе пилотного клинического испытания и доклинических исследований генотерапия с помощью IFN-β вызвала мощную противоопухолевую активность у пациентов со злокачественной глиомой (Таблица 1).229,230

Table 1 Recent siRNA- and miRNA-based brain gene silencing strategies

4. Brain gene editing


Редактирование генов появилось в последние годы как инструмент изучения роли генов в нормальных взаимоотношениях между мозгом и поведением, а также как потенциальная терапевтическая стратегия при некоторых нейродегенеративных заболеваниях. Эти инструменты основаны на нуклеазах, которые способны специфически распознавать и вызывать двунитевые разрывы ДНК (DSBs) в определенных мишенях генома. К инструментам редактирования генома, основанным на сайт-специфических ДНК-нуклеазах, относятся нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFNs),11,242 нуклеазы с эффекторами, подобными активаторам транскрипции (TALENs),243,244 и эффекторные белки Cas систем кластеризованных регулярно перемежающихся коротких палиндромных повторов (CRISPR), такие как Cas9. 245,246 Основное различие между этими тремя инструментами редактирования генома заключается в том, что ZFNs и TALENs требуют изменений в доменах белков для целенаправленного воздействия на определенный участок гена, в то время как в случае белков Cas нацеливание осуществляется с помощью специфической последовательности направляющей РНК, способной распознавать последовательность ДНК-мишени благодаря комплементарности. Независимо от процесса редактирования генов, после индукции DSBs клетка активирует эндогенные пути репарации ДНК для устранения повреждений. Существует два основных типа процессов репарации: негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологично направленная репарация (HDR).247-249 NHEJ часто ассоциируется с наличием небольших инсерций и делеций (indels) в месте разрыва, что может привести к нокауту гена. Однако репарация DSBs с помощью HDR включает и копирование ДНК с гомологичного донорской матрицы, что приводит к точному исправлению DSB.249
С хронологической точки зрения, первыми эндонуклеазами для редактирования генов были нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN).242 Эти ферменты основаны на белках с цинковыми пальчиками, в семействе естественно встречающихся факторов транскрипции, слитых с эндонуклеазой FokI. Домены цинковых пальцев могут распознавать трехнуклеотидную последовательность ДНК, в то время как набор связанных доменов цинковых пальцев может распознавать более длинные последовательности ДНК, обеспечивая желаемую специфичность к мишени. Эндонуклеаза FokI работает как димер, что означает, что расщепление двухцепочечной ДНК происходит только в местах связывания двух ZFN с противоположными нитями ДНК.242 Система основана на двух ZFN, сконструированных для распознавания различных близко расположенных нуклеотидных последовательностей в сайте-мишени, и требует одновременного распознавания и связывания обоих ZFN, что, естественно, ограничивает эффекты вне мишени. Потенциал ZFNs как инструмента редактирования генов мозга был продемонстрирован на примере болезни Huntington's disease (HD).250,251 HD - это доминантно наследуемое нейродегенеративное заболевание, вызванное расширенными CAG-повторами в гене huntingtin (HTT). Редактирование генов было продемонстрировано in vivo, на генном и функциональном уровнях, в мышиной модели HD после стереотаксического введения в стриатум частиц AAV1250 или AAV6251, кодирующих ZFN. Важно отметить, что длительная экспрессия ZFNs в нейронах центральной нервной системы вызывала значительную репрессию генов в течение как минимум 6 месяцев251,252 и не вызывала измеримого воспаления или нейродегенерации253.
TALEN были вторыми эндонуклеазами, которые были оценены для редактирования генов.243,254,255 Один мотив TALE распознает один нуклеотид, а массив TALE может связываться с более длинной последовательностью. Активность каждого домена TALE ограничена только одним нуклеотидом и не влияет на специфичность связывания соседних TALE, что делает инженерию TALENs намного проще, чем ZFNs. Как и ZFNs, мотивы TALE связаны с эндонуклеазой FokI, которая требует димеризации для расщепления. Это означает, что необходимо связывание двух разных TALEN на противоположных нитях в непосредственной близости от ДНК мишени. Потенциал редактирования генов с помощью TALEN был продемонстрирован на генах, связанных с аутизмом (CACNA1C)255 и деменцией (NTF3),244,256 среди прочих. TALEN были использованы у модельных рыбок данио257 и мышей258 , но их потенциал в качестве системы редактирования головного мозга in vivo остается неясным.
Открытие системы редактирования генов CRISPR/Cas9 в 2012 году изменило нашу парадигму редактирования генов и трансформировало область исследований.245 Эта система состоит из фермента (Cas) и направляющей гид РНК, которая связывается с определенной последовательностью ДНК мишени. РНК вступает в комплекс с ферментом Cas9, в результате чего образуется рибонуклеопротеин Cas9 (РНП). Наиболее часто используемыми ферментами являются Cas9 из штаммов бактерий Streptococcus pyogenes (SpCas9)245 и Staphylococcus aureus (SaCas9).259 Направляющая РНК (gRNA) состоит из двойной последовательности РНК crRNA (CRISPR РНК) с мишенью для геномной ДНК и tracrRNA (транс-активирующая CRSPR РНК), которая связывается с ферментом. Эти две РНК также могут быть объединены в одну single hybrid guide RNA (sgRNA).245,260 Под контролем gRNA Cas9 индуцирует точные DSBs в сайтах мишенях генома.14 Система CRISPR/Cas9 относительно проста в приготовлении, поскольку для каждого применения готовится только направляющая РНК, что очень эффективно и экономично по сравнению с другими инструментами редактирования генов. Важно отметить, что помимо обычного редактирования генома Cas9, фермент может действовать как программируемый ДНК-связывающий модуль для контроля транскрипции. В этом случае нуклеаза Cas9 инактивируется (мертвая (dead) Cas9) путем аминокислотных замен,260 и полученный фермент (deadCas9) может быть слит с транскрипционными репрессорами, такими как KRAB261-263, или транскрипционными активаторами, такими как VP64. 262,264,265 Потенциал системы CRISPR/Cas9 для редактирования генов был продемонстрирован в контексте HD,266-269 болезни Альцгеймера (AD),270,271 синдрома хрупкости X хромосомы,272 болезни Паркинсона,273,274 шизофрении,275 и репрессии генов нервных стволовых клеток,276 среди прочих, как in vitro, так и in vivo. In vivo потенциал системы CRISPR/Cas9 для применения в мозге был подтвержден на мышах,266,268-270,272,276 крысах277,278 и обезьянах279 после интрацеребрального266,268-272,275,280 и интратекального275 введения. Были отредактированы нейроны,270,272,277,281-283 микроглия,272 нейронные стволовые клетки и клетки предшественники276,283 и астроциты272 в животных моделях на эмбриональной,280,284 плодной и взрослой270,277,284 стадиях. Были отредактированы также клетки мозга в различных местах, включая кору головного мозга,284 гиппокамп,270,272,283,284 стриатум,272,283,284 таламус,284 гипоталамус,284 мозжечок,284 средний мозг,284 и спинной мозг284, что демонстрирует универсальность платформы генного редактирования. Важно отметить, что большинство исследований по редактированию генов в мозге опираются на механизм восстановления NHEJ282 с успешностью до 60%.277 Выбор NHEJ, а не механизма восстановления HDR оправдан тем, что нейроны являются пост-митотическими клетками, и поэтому механизм восстановления NHEJ обладает высокой эффективностью. HDR-опосредованная генная модификация нейронов была продемонстрирована во взрослом мозге мыши, хотя и с ограниченным успехом (до ~30% нейронов мишеней)284.
4.1. Доставка системы CRISPR/Cas в мозг


Несмотря на широкий спектр применения системы CRISPR/Cas9 в контексте мозга, эффективная доставка CRISPR/Cas9 остается ключевым ограничивающим фактором. CRISPR/Cas9 может быть доставлен в трех различных формах, включая (i) ДНК, (ii) мессенджер РНК (мРНК Cas9) или (iii) комплекс ribonucleoprotein (RNP) Cas9 (комплекс Cas9:gRNA).285 Стратегии, используемые для доставки системы CRISPR/Cas9 в мозг (табл. 2), можно разделить на физическую доставку, вирусные векторы и невирусные векторы (рис. 3).



Рис. 3 Стратегии доставки CRISPR/Cas9. Для успешной доставки через клеточную мембрану было разработано множество физических, вирусных и невирусных методов.

Table 2 Viral and non-viral formulation for CRISPR/Cas9 delivery for brain gene editing

4.1.1 Physical delivery
4.1.2 Вирусная доставка
4.1.3 Non-viral delivery ...




Fig.4. Viral and non-viral delivery in gene-editing efficiency. (A) AAV-HDR for the delivery of a sgRNA and HDR donor template to insert the human influenza hemagglutinin (HA) tag in the embryonic brain. HA tag sequence is fused either to the N terminus of endogenous ?-actin (which expresses ubiquitously in most of cell types) or to CaMKIIa (which expresses exclusively in neurons). Confocal microscopic images of whole sagittal brain sections of Cas9 mice showing immunoreactivities for NeuN (magenta) and the HA tag (green) fused to the N terminus of endogenous ?-actin (top) and CaMKIIa (bottom). Reproduced with permission.66 Copyright 2017, Elsevier. (B) Genome-editing efficiency in distinct cell types regulated by AAV-HDR administration in E10 mouse embryonic. Adapted from ref. 66. (C) Gene-editing efficiency in multiple brain cells types depends on the CRISPR delivery system. In the case of viral delivery, the AAV2g9 seems to have a higher tropism to transfect neurons than other brain cells, whereas AAV9 can transfect preferentially astrocytes, neuronal and glial cells.66 Non-viral delivery shows higher gene editing in astrocytes and microglia (more proliferative cells), but they also can target neuro stem cells and neurons, according to ref. 272 and 283.



Fig. 5 CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complex challenges related to improving gene-editing efficiency (left) as well as tools and biomaterials for designing more efficient delivery systems in the future (right).

В целом, невирусные препараты выгодно отличаются от вирусных по отсутствию интеграции в клеточный геном, упаковочной способности и контролю пространственно-временного высвобождения груза CRISPR/Cas (рис. 3). Важный аспект безопасности, связанный с редактированием генов мозга, связан с иммунным ответом на Cas9 RNP. Некоторые исследования показывают, что Cas9RNP NPs, доставленные в головной мозг мыши, не активировали микроглию, основную часть иммунных клеток центральной нервной системы.283 Таким образом, составы кажутся безопасными; однако для более детального изучения этого вопроса необходимы дальнейшие исследования (рис. 5). Кроме того, хотя некоторые композиции, протестированные до сих пор в контексте головного мозга, показали большее предпочтение к нейронам, чем астроцитам, 283 контроль редактирования генов в конкретных популяциях клеток мозга еще предстоит продемонстрировать. Другой вопрос, который еще предстоит изучить, заключается в том, можно ли вводить невирусные препараты внутривенно и накапливать их в мозге. Эта стратегия может значительно упростить применение препаратов для редактирования генов в мозге. Недавно была продемонстрирована неинвазивная доставка наночастиц, содержащих вектор CRISPR/Cas9, с помощью магнитного воздействия, которые в этом случае могут пересекать гематоэнцефалический барьер (BBB) и подавлять латентную инфекцию ВИЧ-1 в клетках. микроглии 307.
4.1.4 Перспективы


За последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс в области доставки препаратов генотерапии в мозг. Теперь мы лучше понимаем свойства средств доставки (вирусных и невирусных), направленных на конкретные клетки мозга,142 знаем о стратегиях преодоления гематоэнцефалического барьера и достижения конкретных участков мозга,313,314 имеем инструменты для воспроизведения in vitro человеческих моделей BBB и тестирования проницаемости препаратов,315,316 и усовершенствованные составы для преодоления BBB.317,318. В результате этого прогресса было проведено несколько клинических испытаний (https://clinicaltrials.gov/) генотерапии мозга для лечения PD (например, для экспрессии GDNF в мозге) (NCT04167540),319 AD (например, для экспрессии активной теломеразы, аполипопротеина Е2) (NCT03634007; NCT04133454),320,321 ганглиозидоза (например, путем доставки функциональной копии гена GLB1 в ЦНС) (NCT03952637),322 и метахроматической лейкодистрофии (NCT03725670).323 Большинство этих стратегий предполагают экспрессию белков для замены отсутствующих или мутировавших (и, следовательно, неактивных).
В настоящее время подходы к редактированию генов мозга не достигли стадии клинических испытаний. Однако подходы к редактированию генов за пределами мозга в настоящее время проходят клинические испытания. Например, недавнее исследование продемонстрировало безопасность и осуществимость генного редактирования человеческих Т-лимфоцитов у больных раком с целью повышения их противоопухолевой активности.324 В ближайшие годы ожидается проведение клинических испытаний по редактированию генов мозга. CRISPR/Cas9-опосредованное редактирование генома обеспечит важные достижения в области новых терапевтических мишеней или нескольких мишеней. Невирусные системы имеют большой потенциал для упаковки и доставки больших генетических грузов и снижения риска ошибок вставки, которые могут возникать при вирусной доставке генов. Ген-терапевтические препараты для замалчивания определенных генов головного мозга также могут найти применение в контексте некоторых нейродегенеративных заболеваний. Например, препарат Patisiran, разработанный компанией Alnylam® Pharmaceuticals (https://www.alnylam.com/), был одобрен в США и Европе для борьбы с транстиретин-опосредованным амилоидозом325.
Ограничивающей проблемой в генотерапии головного мозга является доставка в мозг. Это ограничение связано с высокой сложностью головного мозга и непроницаемостью гематоэнцефалического барьера. Были разработаны препараты, способные эффективно преодолевать гематоэнцефалический барьер и накапливаться в паренхиме мозга.317,318 Кроме того, временное открытие гематоэнцефалического барьера с помощью фокусированного ультразвука может еще больше увеличить накопление препаратов в мозге.314 Эти инструменты следует тщательно изучить для доставки генотерапии в головной мозг.