Посещений: 
РАКОВЫЕ ОПУХОЛИ
CRISPR-Cas9 редактирование генов
Review of applications of CRISPR-Cas9 gene-editing technology in cancer research • Ziyi Zhao,
• Chenxi Li, • Fei Tong et al. Biological Procedures Online volume 23, Article number: 14 (2021)
| |
|
Рак - уникальное генетическое заболевание, требующее множественных мутаций [1], которые способствуют пролиферации клеток, подавляют апоптоз клеток и изменяют экспрессию специфических антигенов на поверхности клетки, чтобы избежать распознавания иммунной системой посредством активации / деактивации множества сигнальных путей. Раковые клетки часто инвазивны, разрушают нормальные человеческие ткани и вызывают отдаленные метастазы через лимфатические сосуды и кровеносные сосуды. Хотя заметный прогресс был достигнут в лечении рака (например, хирургия, химиотерапия, лучевая терапия, молекулярная таргетная терапия, комбинированная терапия и т. д.), Частота побочных эффектов, рецидивов и устойчивости к химиотерапии / лучевой терапии все еще высока [2]. Поэтому изучение новых уязвимостей, связанных с раком, является актуальным. Однако, хотя количество обнаруженных отвечающих за рак мутаций все еще ограничено, необходимы новые инструменты для определения функциональных факторов рака.
Являясь одним из наиболее эффективных инструментов редактирования генов на сегодняшний день, технология CRISPR и CRISPR-ассоциированного белка 9 (Cas9) продемонстрировала пригодность, простоту и эффективную возможность редактирования генов по сравнению с ранее разработанными инструментами манипуляций генами. [3, 4]. В настоящее время в исследованиях рака использование CRISPR-Cas9 в основном включает скрининг онкогенных мутаций и опухолевых супрессоров, создание моделей рака in vivo и in vitro и генотерапию рака [5, 6]. Обладая относительно высокой эффективностью редактирования и небольшим количеством эффектов вне мишени, система редактирования генов CRISPR-Cas способна изменять биологическое поведение опухолевых клеток на уровне генома, уменьшать разрушение нормальных клеток ткани человека и увеличивать время выживания пациентов.
Property and priority of CRISPR -Cas9 as an advanced gene-editing tool
Для достижения эффективного и точного редактирования генов были разработаны различные методы, включая РНК-интерференцию (RNAi), нуклеазы цинковых пальчиокв (ZFN) или эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN). Первоначально обнаруженная у Caenorhabditis elegans, RNAi запускается с помощью двухцепочечной РНК (dsRNA) [7]. Когда экзогенная dsRNA вводится в клетки, она сначала распознается и подвергается процессингу в малые интерферирующие РНК (siRNAs) в 21-23 пары оснований с помощью рибонуклеазы семейства РНКаз III. Эти siRNA затем созревают и направляют РНК-индуцированный комплекс замалчивания (RISC) к РНК мишени, что приводит к окончательному разрушению РНК мишени и к молчанию гена [8]. Однако изучение конкретных генов с помощью RNAi ограничено, поскольку RNAi нарушает экспрессию определенных генов на уровне транскрипции.
ZFN и TALEN представляют собой сконструированные нуклеазы, слитые с сиквенс-специфичными доменами связывания ДНК и модулями для неспецифического расщепления ДНК. Эти сконструированные нуклеазы индуцируют двухцепочечные разрывы (DSB) ДНК мишени, которые стимулируют склонное к ошибкам негомологичное соединение концов (NHEJ) или на гомологи направленную репарацию (HDR) [9, 10]. Следовательно, ZFN / TALEN делают возможным редактирование генома. Однако при нынешнем статусе технологии эффекты вне мишени при ZFN по-прежнему остаются высоким. Кроме того, TALENS могут влиять на микроокружение хроматина, и их связывающая активность может быть нарушена в областях конденсированного хроматина [11].
Система CRISPR-Cas, впервые обнаруженная у Escherichia coli (рис. 1), представляет собой адаптивную иммунную систему, которая защищает от инвазивных чужеродных нуклеиновых кислот [12]. Семейство "классических" систем CRISPR-Cas в основном состоит из 6 типов, которые сгруппированы в два класса. Члены класса I (системы типов I, III и IV) используют несколько белков Cas, тогда как члены класса II (системы типов II, V и VI) имеют только один белок Cas с несколькими доменами [13]. Следовательно, системы CRISPR-Cas класса II проще использовать в приложениях генной инженерии. Среди членов системы CRISPR Cas типа II, CRISPR-Cas9, полученный из Streptococcus pyogenes (т.е., "S. pyogenes"), является наиболее широко применяемой системой у млекопитающих [14].
Fig. 1 Genomic structure of the bacterial CRISPR-Cas9 system: CRISPR is a special repetitive sequence-spacing array of clustered bacterial genomes made up of spacing sequences from phage DNA and recombination sequences from the host bacteria genome adjacent to the Cas gene. CRISPR mainly includes tracrRNA genes, Cas genes, leaders, repeat sequences and interval sequences
Типичная система CRISPR-Cas9 состоит из единственной направляющей РНК (sgRNA) и Cas9. SgRNA - это синтетически слитые CRISPR РНК (crRNA) и транс-активирующая crRNA (tracrRNA). Распознавая последовательность приблизительно из 20 оснований, crRNA специфически связывается с сайтом-мишенью, в то время как дополнительная последовательность, соответствует части tracrRNA [14, 15]. Белок Cas9 представляет собой эндонуклеазу с доменом Ruvc и доменом HNH. Домен HNH расщепляет одиночную нить ДНК, комплементарную sgRNA, тогда как домен Ruvc расщепляет некомплементарную нити ДНК [16]. Во время редактирования 5'-конец sgRNA чётко распознает сайт мишень, а 3'-конец, связанный с белком Cas9, направляет его к последовательности мишени. Комплекс sgRNA / Cas9 распознает мотив, прилегающий к протоспейсеру (PAM), и расщепляет двухцепочечную ДНК [17]. Прилегающий к последовательности ДНК мишени, PAM обычно состоит из NGG или NAG (N = A, T, G или C) в системе CRISPR Cas, разработанной из S. pyogenes [18]. Когда DSB индуцируются, путь HDR активируется предоставленной ДНК-матрицей для достижения нокаута гена или замены пары оснований. Альтернативно, может быть активирован склонный к ошибкам путь NHEJ (рис. 2). Специфический нокаут гена может возникать, поскольку репарация NHEJ часто вызывает инсерционные / делеционные (Indel) мутации, приводящие к сдвигу открытой рамки считывания гена мишени [3].
 Fig.2
The molecular mechanism of CRISPR-Cas9: SgRNA consists of tracrRNA and crRNA. The crRNA contains a 20-base recognition sequence and an additional sequence that complements tracrRNA. TracrRNA is hybridized with crRNA and combined with the Cas9 protein to form the CRISPR-Cas9/sgRNA complex, which produces DSBs at the target sites of the genome. SgRNA is often designed to contain two key fragments: a double-stranded RNA structure that binds Cas9 at the 3'-end and a guide sequence that binds the target DNA sequence at the 5'-end. SgRNA can recognize a specific sequence in the genome. The Cas9 protein is an endonuclease containing two domains (RuvC and HNH). The RuvC domain cleaves the noncomplementary DNA strand, while the HNH domain cleaves the complementary DNA strand. After DSBs are formed, either the NHEJ pathway or HDR pathway is activated. The NHEJ pathway often leads to insertions/deletions (Indel) and an open reading frame shift of the target gene. In contrast, the HDR pathway requires a donor DNA template to repair DSBs. The donor DNA template is used to insert the correct DNA sequence precisely into the target site
Application of CRISPR -Cas9 in gene screening
Чтобы понять молекулярные механизмы онкогенеза и изучить новые терапевтические мишени, важно определить основные генетические зависимости и ключевые онкогенные мутации при раке (рис. 3). Следовательно, необходим эффективный и беспристрастный скрининг генов in vitro и in vivo.
Fig. 3
Basic steps of CRISPR-Cas9 gene screening: First, plasmids were constructed that expressed the corresponding CRISPR components, they were packaged as viruses, libraries were built, and the cancer cells to be studied were infected. Then, uninfected cancer cells were removed by drug selection (e.g., puromycin), and the screened cancer cells were divided into three groups: the day 0 population, drug-treated population (treatment) and control population (mock-drug control, typically treated with a vehicle such as DMSO). After specific drug treatments, genomic DNA was extracted from the transduced cells, and high-throughput sequencing was performed to sequence the sgRNA coding region that the virus had integrated into the host genome. Finally, bioinformatics analysis was performed to compare the sequencing results of the three groups of cancer cells, and the genes that were affected by specific drugs were preliminarily obtained
Методы RNAi применяются при генном скрининге библиотек siRNA/shRNA. Однако, хотя RNAi нацелена на транскрипты мРНК и ген-специфический нокаут обычно является частичным или неполным, объем скрининга генов с помощью RNAi ограничен [19]. Технология CRISPR-Cas в существенной мере преодолевает это ограничение, поскольку применение CRISPR-Cas9 при скрининге генов дает возможность нацеливаться на более широкий диапазон ракового генома [20, 21]. Было доказано, что пролиферация множественных линий раковых клеток зависит от maternal embryonic leucine zipper kinase (MELK) посредством RNAi или низкомолекулярных лекарственных препаратов. Поэтому, OTS167 считается новым химиотерапевтическим препаратом, нацеленным на MELK [22-24]. Однако Ann Lin et al. не обнаружили значительных изменений в приспособленности линий клеток рака груди или шести других линий раковых клеток после мутации MELK с помощью CRISPR-Cas9. Более того, OTS167 все еще подавлял пролиферацию линий клеток, нокаутированных по MELK. Таким образом, авт. предположили, что OTS167 может препятствовать делению клеток с помощью других механизмов [25]. Это исследование подчеркивает необходимость скрининга и проверки лекарственных мишеней в доклинических исследованиях с использованием метода CRISPR-Cas9. Это исследование также раскрывает проблемы с использованием технологии CRISPR для правильной идентификации основных генов рака. С другой стороны, Michiko Kodama et al. объединили библиотеку shRNA с полногеномной библиотекой CRISPR-Cas9 для проведения in vivo скрининга потери функции, который в результате идентифицировал KPNB1 как новую терапевтическую мишень для эпителиального рака яичников. Интересно, что в опухолях с использованием CRISPR-Cas9 наблюдалось больше делеций генов, чем в опухолях с использованием shRNA, что показывает, что между двумя методами скрининга до некоторой степени существуют функциональные различия [26].
Полногеномный скрининг CRISPR-Cas9 дал множество высококачественных данных [27-29]. Sidi Chen et al. получили специфические функционально дефектные мутации, необходимые для роста и метастазирования опухоли, с помощью полногеномного CRISPR-скрининга, такие как Cdkn2a, Fga и Cryba4 [30]. Точно так же Ryan d. Chow et al. идентифицировали несколько функциональных супрессоров, а также совместимость и корреляцию специфических мутаций в глиобластоме посредством скрининга CRISPR in vivo. Они идентифицировали возникающие одновременно комбинации драйверов, включая B2m-Nf1, Mll3-Nf1 и Zc3h13-Rb1, путем компьютерного анализа [31]. Технология CRISPR-Cas9 также обеспечивает новый подход к функциональному скринингу слияния онкогенов. Gabriele Picco et al. пришли к выводу, что большинство событий слияния генов не влияет на приспособленность опухоли согласно функциональному анализу слияния с использованием данных о потере приспособленности CRISPR-Cas9 [20].
Стратегии скрининга, связанные с CRISPR, обычно нацелены на мутации экзонов на 5'-конце генов-кандидатов [21, 32, 33]. Junwei Shi et al. предположили, что нацеливание на экзоны, кодирующие функциональные белковые домены, с помощью CRISPR-Cas9 обеспечивает более высокую долю делеционных мутаций [34]. С другой стороны, для повышения эффективности скрининга Najm FJ et al. соединили Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) с SpCas9 и установили правила для разработки sgRNA SaCas9 с использованием метода машинного обучения для достижения двойного целенаправлененого воздействия на несколько типов клеток [35]. Эти исследования способствуют использованию стратегии скрининга генов системой CRISPR-Cas9. Однако все же существует неоспоримый риск предвзятости. Геномное целенаправленное анти-пролиферативное воздействие с помощью CRISPR-Cas9 индуцирует ген-независимую реакцию клеток, которая может искажать скрининг критических генов в амплифицированной области [36].
В большинстве случаев эффективность противоопухолевых препаратов в клинике постепенно снижается, что в основном связано с повышенной экспрессией генов лекарственной устойчивости в опухолевых клетках. Следовательно, скрининг генов лекарственной устойчивости имеет большое значение для повышения клинической эффективности лекарств и для поиска новых схем комбинированного лечения. TP53 и SOCS6 представляют собой резистентные к иматинибу (imatinib) гены-кандидаты в желудочно-кишечных стромальных опухолях (GIST), которые были идентифицированы с помощью полногеномного метода нокаутного скрининга CRISPR-Cas9. Также предполагается, что DBP, NR3C1, TCF12 и другие участвуют в устойчивом к иматинибу механизме GIST, который показывает направление для исследования новых терапевтических мишеней и дальнейшего выяснения механизма устойчивости к иматинибу [37]. Wei L et al. идентифицировали первый активированный фермент фосфоглицератдегидрогеназы (PHGDH) в пути синтеза серина (SSP) в качестве критического фактора устойчивости к сорафенибу (sorafenib) посредством скрининга CRISPR-Cas9 по всему геному и подтвердили, что ингибитор PHGDH NCT-503 обладает синергическим действием с сорафенибом, нарушая рост гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) in vivo [38]. Это исследование также показало большой потенциал CRISPR-Cas9 для выявления генов лекарственной устойчивости.
Хотя системе CRISPR / Cas9 уделяется большое внимание, DSB, вызываемые этой системой, часто приводят к нежелательным вставкам, делециям и перестройкам [39, 40]. Чтобы решить эту проблему, исследователи идентифицировали мутантные dead-нуклеазы Cas9 (dCas9), которые не вызывают разрывы, но не нарушают связывание с ДНК [16]. dCas9 может блокировать транскрипцию некоторых генов в клетках бактерий и млекопитающих. Gilbert et al. показали, что когда каталитически dead белок Cas9, лишенный эндонуклеазной активности, ко-экспрессируется с sgRNA, то образуется комплекс распознавания ДНК, который может специфически препятствовать удлинению транскрипции, связыванию РНК-полимеразы или связыванию фактора транскрипции. Этот процесс называется CRISPR-интерференцией (CRISPRi) [41]. Технология CRISPRi позволила проводить скрининг функций генов в клетках млекопитающих в масштабе генома, что оказалось ценным для идентификации генов в не кодирующих и кодирующих областях. S John Liu et al. использовали CRISPRi для скрининга 5689 локусов lncRNA в клетках глиобластомы человека (GBM), выявив 467 мутации, которые изменяли рост клеток в присутствии клинически значимых доз фракционированного излучения. Они определили lncGRS-1 как терапевтическую мишень, специфичную для глиомы, и разработали универсальный подход для быстрой идентификации новых терапевтических мишеней в больших не кодирующих областях генома для усиления лучевой терапии [42]. Аналогичным образом Shiyang Liu et al. разработали библиотеку sgRNA CRISPRi для целенаправленного воздействия на transcription start site (TSS) каждой из Wnt-регулируемых lncRNAs. Они отобрали в общей сложности 1503 Wnt-регулируемых lncRNAs для CRISPRi-скрининга в линии клеток HPAF-II (клетки аденокарциномы поджелудочной железы человека), которые содержали 3151 транскрипт, включая различные изоформы. Исследователи обнаружили, что четыре локуса lncRNAs, регулируемые Wnt (RP11-481J2.3, LINC00910, LINC00263, CCAT1), которые были обнаружены при скрининге in vivo и in vitro, важны для роста раковых клеток HPAF-II [43]. dCas9 также можно использовать для активации экспрессии гена в подходе, называемом активацией CRISPR (CRISPRa). Bikard et al. показали, что слияние омега-субъединицы РНК-полимеразы и мутантной нуклеазы Cas9, направленное на связывание вышележащих промоторных областей, может достигать программируемой активации транскрипции в Escherichia coli [44]. В эукариотических клетках исследователи слили 4 копии хорошо охарактеризованного активатора транскрипции VP16 или одну копию домена активации p65 (AD) с dCas9. Они одновременно трансфицировали dCas9-VP64 или dCas9-p65AD и конструкцию sgRNA, которая нацелена на Gal4 UAS (upstream activation sequence), в линию репортерных клеток HEK293, экспрессирующих репортер Gal4 UAS-GFP. Результаты показали, что как dCas9-VP64, так и dCas9-p65AD могут эффективно активировать экспрессию репортерного гена [45]. Цитарабин (Cytarabine) (1-p-d-арабинофуранозилцитозин, Ara-C) является химиотерапевтическим агентом первой линии, часто используемым при лечении острого миелоцитарного лейкоза (AML) [46]. Однако примерно от 30% до 50% пациентов рецидивируют с заболеванием, устойчивым к химиотерапии. Assaf C Bester et al. провели функциональный скрининг с использованием технологий на основе CRISPRa, используя новую библиотеку некодирующих sgRNA для всего генома (активация CRISPR lncRNA, CaLR). Они идентифицировали кандидаты lncRNAs, которые способствовали устойчивости к лечению Ara-C с помощью подхода CaLR, такие как GAS6-AS2 и AC008073.2 [47]. Эффективность CRISPRi и CRISPRa в генетическом скрининге впечатляет. В течение следующих нескольких лет усовершенствования конструкции sgRNA и dCas9 для CRISPRi и CRISPRa могут еще больше повысить эффективность этих подходов.
The CRISPR -Cas9 delivery system used in cancer research
Было разработано несколько систем для эффективной доставки компонентов CRISPR к клеткам-мишеням, которые в основном делятся на системы доставки на основе вирусов и невирусные системы доставки.
Viral-based delivery system
Аденоассоциированный вирус (AAV), лентивирус и аденовирус обычно используются для доставки основанной на плазмиде системы CRISPR-Cas9 в исследованиях рака. Поскольку непатогенный аденоассоциированный вирус инфицирует как делящиеся, так и неделящиеся клетки с умеренной иммуногенностью [48, 49], Wang G et al. успешно индуцировал рак печени путем мутации в печени Cre-индуцируемых мышей Cas9 аденоассоциированным вирусом в качестве носителя для доставки библиотеки sgRNA, нацеленной на возможные гены-супрессоры опухоли, такие как Trp53, Setd2, Cic и Pik3r1 [50]. При относительно более низкой иммуногенности и более высокой эффективности инфицирования, экспрессия генов, трансфицированных лентивирусом, длится дольше [3]. После полногеномного скрининга CRISPR-Cas9 с лентивирусными векторами было продемонстрировано, что дефицит RNASEH2 может быть вызван синтетическим летальным агентом с ингибированием ATR in vitro и in vivo [51]. Однако упаковочная способность аденоассоциированных вирусов и лентивирусов ограничена [52, 53]. Таким образом, мышей с помощью с генной инженерии, экспрессирующих Cas9, можно получать, просто вводя sgRNA, так были сконструированы подходы, чтобы преодолеть ограничение в объеме упаковки. Randall J. Platt et al. получили Cre-зависимую мышь с нокаутом гена Cas9. Они использовали векторы AAV для введения мутаций p53, Lkb1 и Kras в легкие, что привело к образованию опухолей легких [54]. В отличие от AAV и лентивирусов, аденовирусы имеют больший размер для трансгенов и меньше ограничений в последовательности [55]. Компонент CRISPR также доставлялся в мышиные клетки через трахеальный рекомбинантный аденовирус, чтобы вызвать слияние генов Eml4-Alk, что индуцировало онкогенез легких с высокой проницаемостью и низкой латентностью [56]. Однако высокая иммуногенность и ограниченная ориентация тканей ограничивают применение аденовирусных векторов [57].
Nonviral delivery systems
Хотя эффективность доставки невирусных систем доставки относительно ниже, чем у вирусных векторов, эти системы намного безопаснее для хозяина. Гидродинамическая инъекция, электропортация, наночастицы и носители транспозонов являются стандартными невирусными методами доставки. Zeming Chen et al. разработали наночастицы гидрогеля (LHNP) на основе липосом в сочетании с технологией мини-кольцевой ДНК для доставки системы CRISPR-Cas9, нацеленной на Plk1 (polo-like kinase 1), которая эффективно подавляет рост опухоли и повышает выживаемость мышей с опухолями [58]. В качестве альтернативного носителя для доставки библиотек гид РНК (gRNA) для скрининга in vivo транспозоны piggyBac (PB) могут достигать эффективности трансдукции от 86,85% до 92,43% в печени мышей [59]. Однако невирусная система доставки часто не обеспечивает тканевой специфичности, которую можно преодолеть соответствующей модификацией белка Cas9. Asialoglycoprotein receptor (ASGPr) представляет собой лектин c-типа, экспрессирующийся почти исключительно на поверхности клеток печени. Romain Rouet et al. разработали белок Cas9, несущий лиганд ASGPr и образующий комплекс с sgRNA для доставки системы CRISPR-Cas9 специфически к клеткам печени [60].
Application of CRISPR -Cas9 in cancer models
Рак взывактся множественными точечными мутациями, транслокациями и хромосомными потерями и добавлениями, которые усложняют геном рака [61]. Таким образом, выявить мутации драйверы при раке сложно. Необходимо моделировать развитие и прогрессирование рака и разрабатывать модели рака с характеристиками заболеваний человека. CRISPR-Cas9 ускоряет этот процесс благодаря своей эффективной и простой возможности редактирования генов. Модели рака можно условно разделить на две категории: in vitro и in vivo. Обычными моделями in vitro являются органоиды - крошечные самоорганизующиеся трехмерные тканевые культуры, полученные из стволовых клеток. Модель рака с биологическим поведением, аналогичным поведению опухоли, может быть построена путем исключения определенных генов с использованием технологии CRISPR-Cas9 для имитации спектра мутаций, наблюдаемых во время возникновения и развития рака. Обычно мышиные модели рака in vivo конструируются путем индукции онкогенных мутаций или хромосомных перестроек посредством доставки системы CRISPR-Cas9 к конкретным органам или тканям мышей.
Hepatocellular carcinoma
При моделировании рака печени компоненты CRISPR обычно вводят мышам через хвостовую вену. Например, Wen Xue et al. сконструировали модель рака печени мыши, воздействуя на гены-супрессоры опухолей Pten и p53 в печени мыши [62]. Кроме того, чтобы точно имитировать характеристики сложных мутаций при раке, исследователи изучают возможность запуска множественных мутаций в клетках печени мышей с использованием CRISPR-Cas9. Julia Weber et al. . создали модель рака печени у мышей, введя множественные мутации гена-супрессора опухоли в печень мышей через систему CRISPR-Cas9. Их целью стали Trp53, Smad4, Pten, Cdkn2a, Apc, Arid1a, Tet2, Brca1 / 2 и другие. В определенных генетических (KrasG12D) моделях и моделях повреждения печени (CCl4) исследователи впервые показали, что целенаправленное воздействие на соматический ген CRISPR / Cas9 может быть использовано для индукции HCC. После анализа функциональной геномики они подтвердили роль модификаторов хроматина в онкогенезе печени [63].
Pancreatic cancer
Аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC) - это очень злокачественный рак с плохим прогнозом. Согласно соответствующим исследованиям, ожидается, что к 2030 году рак поджелудочной железы станет второй ведущей причиной смерти от рака [64]. Чтобы понять основные молекулярные процессы рака поджелудочной железы, были построены различные модели рака поджелудочной железы. Roman Maresch et al. успешно смоделировали образование рака поджелудочной железы путем индукции множественных генных мутаций (таких как Trp53, Smad4, Pten, Apc и другие) в поджелудочной железе мыши с помощью системы CRISPR-Cas9 на основе плазмиды путем электропортации. Они также использовали мультиплексы CRISPR-Cas9 для скрининга отрицательного отбора в поджелудочной железе и подтвердили инактивацию Brca2 как как слабое место в клетках поджелудочной железы с мутациями Kras [65]. Кроме того, Shin-Heng Chiou et al. генерировали трансгенных мышей с единственной вставкой посредством сайт-направленной интеграции кассеты LSL-Cas9 в локус H11 (H11 LSL- Cas9). Они создали модель рака поджелудочной железы у мышей путем инъекции аденовирусного вектора непосредственно в поджелудочную железу трансгенных мышей путем ретроградной инъекции катетера в поджелудочную железу. Затем был получен быстрый рост опухоли путем целенаправленного воздействия на Lkb1 с использованием CRISPR-Cas9 [66].
Colorectal cancer
Колоректальный рак (CRC) - одно из самых распространенных злокачественных новообразований в США [67]. Органоидные методы можно применять в сочетании с CRISPR-Cas9. Поскольку мутации, вызванные ошибками репликации, накапливаются в MLH1-дефицитных клетках колоректального рака, то профиль, наблюдаемый при дефектных по репарации несоответствиях в колоректальных раках, может быть точно смоделирован путем нокаута MLH1 с использованием техники CRISPR-Cas9 [68]. Модели in vivo могут быть созданы путем трансплантации клеток, полученных от пациентов с колоректальным раком, в вентральные и почечные капсулы и селезенку мышей [69, 70]. Однако этот метод приводит к образованию опухолей на эктопических участках. Jatin Roper et al. создали мышиную модель колоректального рака путем индукции образования опухоли в дистальном отделе толстой кишки мышей путем инъекции в слизистую оболочку под контролем колоноскопии компонентов CRISPR-Cas9, содержащих лентивирусные конструкции. Исследователи показали, что редактирование генов in situ было успешным у мышей дикого типа с использованием лентивирусных конструкций, экспрессирующих короткую гид РНК, нацеленную на Apc и Cas9, для моделирования CRC. С введением колоноскопии сайт-ориентированные опухоли могут быть быстро и эффективно индуцированы на моделях мышей [71].
Lung cancer
Рак легких - самая частая причина смерти от рака у мужчин и женщин во всем мире [72]. Опухоли легких с гистопатологическими и молекулярными характеристиками рака легких человека могут быть индуцированы у мышей посредством мутаций генов, опосредованных CRISPR-Cas9, и перестройки хромосом. Platt RJ et al. использовали ген Cas9 для доставки множественных sgRNAs через вектор AAV мышам, вызывая функциональные делеционные мутации p53 и Lkb1 в легких, а также мутации Kras G12D, опосредованные HDR, и создали модель аденомы легких у мышей [54] . С другой стороны, Danilo Maddalo et al. индуцировали хромосомные перестройки с использованием вирус-опосредованной системы CRISPR-Cas9 для экспрессии слитого гена Eml4-Alk, создавая мышиную модель рака легкого, управляемого Eml4-Alk, которая реагировала на лечение ингибиторами ALK [56].
Breast cancer
Рак груди - наиболее распространенный вид рака среди американских женщин (за исключением рака кожи) и вторая по значимости причина смерти женщин от рака после рака легких [73]. С помощью системы CRISPR -Cas9 было разработано множество моделей рака груди. Annunziato S et al. продуцировали мышей с нокаутом посредством условной экспрессии Cre в редакторе оснований цитозина. После доставки in situ вектора, кодирующего sgRNA, эффективные точечные мутации могли быть индуцированы в одном или нескольких эндогенных генах ( Pik3ca, Akt1 и т. д.) С помощью технологии CRISPR-Cas9, эта система была успешно применена к модели трижды отрицательного рака молочной железы. [74]. В дополнение к индукции in situ, трансплантаты органоидов рака груди у мышей также могут имитировать образование опухоли груди у людей. Dekkers JF et al. использовали CRISPR-Cas9 для целенаправленного воздействия на четыре гена-супрессора опухолей, связанных с раком груди ( P53, PTEN, RB1 и NF1) в клетках-предшественниках молочных желез от шести доноров. После трансплантации мутантной клеточной линии 1/6 P53 / PTEN / RB1 и 3/6 мутантной клеточной линии P53 / PTEN / RB1 / NF1 мышам были получены долговременные культуры и образовались ER + внутриклеточные опухоли [75 ].
Application of CRISPR -Cas9 in cancer treatment
Исследователи активно изучают потенциал CRISPR-Cas9 для лечения рака, воздействуя на определенные последовательности в геноме рака и на мутации, связанные с прогрессированием рака (рис. 4). Обычно индуцируют апоптоз опухолевых клеток с помощью CRISPR-Cas9, нацеленного на онкогенные мутации. Koo T et al. использовали метод CRISPR-Cas9, чтобы отличать онкогенные мутации от аллелей EGFR дикого типа, а затем с высокой точностью удаляли онкогенные мультиактивные аллели EGFR, что значительно уменьшило размер опухоли в моделях ксенотрансплантатов рака легких человека [76]. Кроме того, Chen ZH et al. идентифицировали уникальную последовательность, вызываемую перестройкой гена TMEM135-CCDC67 или MAN2A1-FER в геноме раковых клеток, используя метод CRISPR-Cas9, и вносили ген, кодирующий тимидинкиназу вируса простого герпеса типа 1 (HSV1-tk). При лечении ганцикловир (ganciclovir) в HSV1-tk инициировал накопление лекарства в клетках, что приводило к апоптозу клеток, в то время как в HSV1-tk-отрицательных клетках млекопитающих такого эффекта не наблюдалось. Снижение опухолевой нагрузки на моделях ксенотрансплантатов мышей наблюдалось в группе, получавшей HSV1-tk, и ни одна мышь не умерла во время исследования [77]. Эти стратегии подчеркивают способность выборочно убивать раковые клетки без каких-либо неблагоприятных воздействий на нормальные тканевые клетки, что важно для клинического лечения рака.
Fig. 4 Applications of CRISPR-Cas9 technology in cancer research: (A) Modifications of cancer cell genomes with different types of CRISPR-Cas9 systems in vitro and in vivo; (B) CAR T cell therapy combined with CRISPR-Cas9 technology Тем не менее, по-прежнему сложно генерировать специфические точечные мутации с помощью системы CRISPR-Cas9 без каких-либо побочных продуктов, таких как вставки, делеции и перестройки [39, 40, 78, 79]. Для точной генерации точечных мутаций был разработан редактор оснований цитозина (CBE), который позволяет преобразовывать пары оснований C-G в пары оснований A-T без DSB [80, 81]. На основе системы CRISPR-Cas9 были слиты dCas9, цитидиндезаминаза и ингибитор урацил-ДНК-гликозилазы (UGI). Во-первых, gRNA направляет слияние dCas9 на связывание с конкретным сайтом, не вызывая DSB. Затем цитозиндезаминаза дезаминирует цитозин, превращая C в U и образуя промежуточную пару U-G. В то же время UGI ингибирует uracil n-glycosylase (UNG), защищая промежуточные соединения U-G от обратного превращения в C-G. Наконец, U-G превращается в A-T в процессе репликации ДНК. Liu et al. скорректировал доминантно-отрицательную мутацию p53 Tyr163Cys с использованием CBE в клеточных линиях рака молочной железы человека (клетки HCC1954) с частотой образования делеций в 0,7%, что обеспечивает эффективный и точный подход к лечению рака [81].
Благодаря глубокому пониманию иммунологии опухолей иммунотерапия опухолей стала центром исследований. Блокада пропускного пункта (checkpoint) белка 1 запрограммированной смерти (PD-1) и Т-клеточная терапия chimeric antigen receptor (CAR) являются относительно распространенным вариантами иммунотерапии опухолей. Иммунотерапия с блокадой checkpoint PD-1 достигла значительного прогресса в лечении рака легких и поздних гематологических злокачественных новообразований [82, 83]. Однако эта терапия неэффективна для пациентов с низкой экспрессией programmed death ligand 1 (PD-L1) [84]. Для повышения эффективности иммунотерапии против PD-1 новые мишени могут быть идентифицированы с помощью скрининга CRISPR-Cas9. Manguso RT et al. обнаружили, что повышенная экспрессия Ptpn2 индуцирует устойчивость к блокаде checkpoint PD-1 в опухолевых клетках посредством скрининга CRISPR in vivo, и подтвердили, что нокаут Ptpn2 в опухолевых клетках может повышать чувствительность опухолевых клеток к блокаде checkpoint PD-1 [85]. CAR-T-клеточная терапия эффективна для лечения В-клеточного острого лимфобластного лейкоза и хронического лимфобластного лейкоза, но обнаруживает низкую противоопухолевую активность против большинства солидных опухолей [86, 87]. Для повышения эффективности терапии CAR-T-клетками были предложены подходы с использованием технологии CRISPR-Cas9. Например, клетки CAR-T можно модифицировать генетически с помощью CRISPR-Cas9 для повышения их противоопухолевой активности. Justin Eyquem et al. показали, что направление CD19-специфичного CAR к локусу T-cell receptor α constant (TRAC) с использованием метода CRISPR-Cas9 может не только индуцировать однородную экспрессию CAR в Т-клетках периферической крови человека, но также повышать активность Т-клеток. Кроме того, отредактированные клетки показали себя намного лучше, чем полученные обычным способом клетки CAR-T в мышиной модели острого лимфобластного лейкоза [88]. TCR, молекула HLA класса I и клетки CAR-T с дефицитом PD-1 также были разработаны с использованием системы CRISPR-Cas9 для усиления уничтожения раковых клеток при одновременном снижении аллогенной реактивности [89].
Подходы CRISPR-Cas9 могут быть нацелены на некодирующие области, а также на кодирующие области генов. Некодирующие РНК - это класс молекул РНК в транскриптоме, которые не кодируют белки и играют важную роль в регулировании экспрессии генов и влиянии на биологическое поведение различных видов рака. Было показано, что класс не кодирующих РНК, long noncoding RNAs (lncRNAs) влияет на прогрессирование рака. Yu Duan et al. обнаружили, что lncRNA SNHG3 значительно подавлена в тканях и клеточных линиях папиллярной карциномы щитовидной железы (PTC) и что экспрессия SNHG3 отрицательно коррелирует со стадией TNM и плохим прогнозом у пациентов с PTC. Удаление SNHG3 с помощью технологии CRISPR-Cas9 способствовало пролиферации, миграции и инвазии клеток PTC. Следовательно, SNHG3 может быть многообещающим кандидатом на роль мишени при PTC [90]. Аналогичным образом Xin Wang et al. нокаутировали эндогенную длинную некодирующую РНК RP11-159K7.2 в клетках TU-212 и AMC-HN-8 с помощью системы CRISPR-Cas9. Результаты показали, что нокаут RP11-159K7.2 снижает пролиферацию и инвазию клеток плоскоклеточного рака гортани (LSCC) in vivo и in vitro, что позволяет предположить, что lncRNA RP11-159K7.2 может быть потенциальным биомаркером для терапии LSCC [91]. С другой стороны, микроРНК (miRNA) привлекают все большее внимание из-за их роли в прогрессировании рака. Сообщалось, что MiR-3064 является важным супрессором опухолей при раке яичников [92]. Однако другие исследования пришли к другому выводу. Векторы Lenti-CRISPR-miR-3064 трансфицировали в PaCa-2 (линия клеток аденокарциномы протоков поджелудочной железы), которую вводили подкожно мышам nude. Что касается скорости роста и размера опухоли, нокдаун miR-3064 значительно ингибировал рост опухолей ксенотрансплантата PaCa-2 у мышей, это указывает на то, что miR-3064 может действовать как опухолевый супрессор или онкоген в различных раковых опухолях человека и может представлять собой потенциальную мишень. для PC-терапии [93].
Limitations and future directions CRISPR-Cas9: Off-target effects and immune response
Хотя технология CRISPR-Cas9 имеет значительные преимущества в отношении эффективности редактирования генов, диапазона последовательностей мишеней и простоты, бесспорно, что ее эффекты вне мишени препятствуют ее клиническому применению. Jinek et al. впервые обнаружили, что затравочная последовательность в 12 оснований на 3'-конце последовательности sgRNA, смежной с вышестоящим PAM, имела низкую толерантность к несовпадениям с основаниями CRISPR-Cas9 [16]. В то же время Yanfang Fu et al. предположили, что эндонуклеаза Cas9 может преодолевать несовпадения одного или двух оснований и что активность гена мигени более чувствительна к несовпадениям на 3'-конце последовательности sgRNA [94]. Помимо несоответствия оснований, делеция и вставка пар оснований в последовательности ДНК также может приводить к эффектам, не связанными с мишенью. Yanni Lin et al. обнаружили, что система CRISPR-Cas9 также расщепляет геномные сайты, когда последовательности ДНК содержат вставки или делеции по сравнению с последовательностью направляющих гид РНК [95].
Были разработаны новые методы для точного обнаружения эффектов вне мишени и для выявления новых содных участков вне мишени. Shengdar Q. Tsai et al. описали полногеномное секвенирование с несмещенной идентификацией (GUIDE-seq), которое основано на захвате двухцепочечных олигонуклеотидов для обнаружения CRISPR-Cas-индуцированных двухцепочечных разрывов в ДНК, и обнаружили сайты вне мишени, которые не распознаются существующими методы подсчета [78]. Тем не менее, GUIDE-seq требует индивидуальной трансфекции каждой мишени или источника клеток и не так чувствителен, как методы in vitro, что затрудняет масштабирование [96]. Чтобы повысить чувствительность обнаружения, была разработано секвенирование circularization for in vitro reporting of cleavage effects by sequencing (CIRCLE-seq) для выявления нецелевых мутаций, связанных с однонуклеотидными полиморфизмами, специфичными для определенного типа клеток [97, 98]. Однако, существенная трудоёмкость CIRCLE-seq и многочисленные реакции для обработки, необходимые для одного анализа, затрудняют параллельный анализ большого количества мишеней [96].
С другой стороны, была разработана циркуляризация для высокопроизводительного анализа влияния нуклеазы на весь геном путем секвенирования (CHANGE-seq), масштабируемого автоматического метода маркировки, основанного на метке, измерения in vitro активности Cas9 на уровне всего генома. CHANGE-seq был применен к 110 одиночным гид РНК-мишеням в 13 терапевтических сайтах первичных Т-клеток человека и идентифицировало 201 934 сайтов вне мишени, что позволило разработать модели машинного обучения, чтобы прогнозировать нецелевую активность [96]. В дополнение к методам обнаружения in vitro участков вне мишени, исследователи также пытаются обнаружить эффекты ве мишени in vivo. Pinar Akcakaya et al. разработали систему Verification of In Vivo Off-targets (VIVO), которая разделена на два этапа. На начальном этапе "открытия" in vitro с помощью CIRCLE-seq используется для идентификации набора потенциальных сайтов расщепления нуклеаз вне мишени. На этапе "подтверждения" у второго человека обнаружение indels -мутаций выполнялось в локусах, идентифицированных с помощью CIRCLE-seq в ткани-мишени, обработанной нуклеазой, что в основном позволяет обнаруживать in vivo эффекты вне мишени геномной CRISPR-Cas нуклеазы [99]. Эти методы позволят дополнительно оценить безопасность использования CRISPR-Cas9 для генной терапии.
В настоящее время существует два основных подхода к снижению эффектов вне мишени: 1) оптимизация правил конструирования sgRNA и 2) выбор вариантов эндонуклеазы Cas9. Doench JG et al. интегрировали общегеномные библиотеки мыши и человека, проанализировали нецелевую активность тысяч sgRNA и оптимизировали их общегеномные библиотеки на основе их улучшенных алгоритмов для прогнозирования активности как на мишени, так и вне ее [100]. Между тем, Benjamin P. Kleinver и его коллеги описали высокоточный вариант SpCas9-HF1 с такой же направленной активностью, что и у большинства SpCas9 дикого типа, который не обнаруживал заметных эффектов вне мишени [101].
Другим препятствием для применения CRISPR-Cas9 является то, что у хозяина может быть иммунная реакция на белок SpCas9, что ограничивает применимость CRISPR-Cas9 для экспериментов in vivo и терапевтических подходов. Wang D et al. использовали вектор аденовируса (Ad) для доставки SpCas9, нацеленного на Pten, в печени мышей, что привело к увеличению содержания IgG у мышей, подтверждая, что SpCas9 может индуцировать гуморальный иммунитет и специфический клеточный иммунный ответ [102]. Аналогичным образом Chew WL et al. обнаружили, что экспрессия Cas9 в передней большеберцовой мышце взрослого человека посредством доставки компонентов CRISPR AAV приводит к увеличению дренирующих лимфатических узлов и увеличению количества клеток. Экспрессия Cas9 в мышцах значительно увеличивала частоту CD45+ гематопоэтических клеток, которые концентрировались вокруг миофибрилл, экспрессирующих трансген [103].
Чтобы преодолеть иммуногенность SpCas9, Ajina R et al. скрещивали knockin Rosa26-LSL-Cas9 (Cas9-KI+ /+) мышей-самцов на фоне C57BL / 6J с самками мышей WT C57BL / 6J для получения гетерозиготных трансгенных мышей Cas9. Анализ многоцветной проточной цитометрии не обнаружил существенных различий в популяции иммунных клеток селезенки между исходными трансгенными мышами Cas9 и исходными мышами WT C57BL / 6J, что обеспечивает многообещающий подход и идею для преодоления иммуногенности SpCas9 в подходах in vivo [104] .
Conclusion
As a genetic disease characterized by malignant cell proliferation, cancer is a severe threat to human health and requires an effective way to determine its complex genetic dependence. CRISPR-Cas9 gene-editing technology has broad application prospects in cancer research and can lead to the development of effective treatment strategies and improve research. In addition to the off-target effects and the immune response described above, ethical issues are also of concern for this technique, which have long been debated. Despite the limitations of the applications of CRISPR-Cas9 gene-editing technology, we believe that CRISPR-Cas9 gene-editing technology will contribute to improving the treatment of cancer.
|