Мутации CNGA3 являются наиболее распространенной причиной ахроматопсии на Ближнем Востоке и в Китае, составляя около 60% случаев [31]. Для изучения особенностей этого гена было создано несколько моделей животных. Первой описанной моделью были мыши с нокаутом Cnga3, которые показали, что мутации в CNGA3 приводят к прогрессирующей гибели колбочек и последующей потере опосредованной колбочками световой реакции [31, 32]. Гомозиготные мутации в гене CNGA3 у овец приводили к снижению физиологической функции колбочек [33].

Ген CNGA3 был выбран в качестве мишени в нескольких испытаниях генной терапии. Модифицированные AAV векторы серотипов 5 и 8, содержащие капсиды ДНК CNGA3 человека, были преобразованы для медицинских целей, причем последний вектор показал лучшую эффективность по трансдукции фоторецепторов, чем первый [34-36]. Было проведено несколько экспериментальных исследований на животных для оценки проникающих свойств векторов в сетчатку и успешности предложенной генотерапии. Мыши подвергались субретинальным [25, 37-40] и интравитреальным [25] инъекциям вирусных векторов. Кроме того, векторы AAV5 доставлялись в субретинальное пространство глаз овец в генетическом эксперименте Banin et al. и Gootwine et al. [41, 42]. Результаты этих исследований на животных моделях были в целом многообещающими. Сообщалось о восстановлении функциональных и физиологических характеристик системы колбочек, что подтверждалось фотопическими электроретинограммами (ЭРГ), при субретинальных инъекциях [38, 40]. Сообщалось, что эти положительные результаты были долгосрочными, поскольку они сохранялись в течение как минимум 5 месяцев после лечения [38, 40, 41]. Mühlfriedel и др. провели субретинальную инъекцию около 5 x 10⁹ геномов вектора в каждый глаз CNGA3-мутантных мышей, используя два серотипа AAV: AAV5 и AAV8 [37]. Функциональное восстановление колбочек наблюдалось с помощью записи вспышек ЭРГ и, по сообщениям, сохранялось в течение как минимум 12 месяцев после инъекции. Статистически значимой разницы между двумя типами векторов не наблюдалось (p = 0,75) [37]. Однако более молодой возраст на момент первой инъекции был связан с лучшими результатами. Pang и др. и Michalakis и др. также проводили эксперименты на CNGA3-мутантных мышах, используя субретинальные инъекции AAV5 [38, 39]. Они оба сообщили, что дегенерация колбочек была предотвращена инъекциями AAV5-CBA-Cnga3, а нормальная экспрессия M- и S-опсина у обработанных мышей сохранялась в течение как минимум 5 месяцев [38, 39]. Dai и др. сравнили эффективность субретинальных инъекций AAV2 и AAV8 у мутантных мышей CNGA3 [40]. Инъекции проводились на раннем этапе жизни мышей, примерно на 14-й постнатальный день, и содержали 10¹³ геномов вектора на мл. Последующие электроретинограммы проводились через 1 месяц, 3 месяца и 9 месяцев после инъекций [40]. Значительное увеличение амплитуд фотопической и скотопической ЭРГ наблюдалось в двух группах: AAV2 и AAV8 (p < 0.01) [40]. Однако глаза, обработанные AAV8, дольше сохраняли желаемые результаты. Кроме того, флуоресцентная микроскопия обработанной сетчатки показала сохранение белка M-опсина, по сравнению с очень малым количеством и неправильной локализацией белка M-опсина в необработанных глазах [40]. Двадцать овец с обнаруженными мутациями CNGA3 лечили субретинальными инъекциями рекомбинантных векторов AAV5 по методу Banin и других [41]. Поведенческие оценки проводились несколько раз, вплоть до 3 лет, после инъекций. Вылеченные глаза были способны к навигации по лабиринту в фотопических условиях, где время навигации и частота столкновений были аналогичны тем, которые наблюдались у контрольных овец (дикого типа) (p < 0.05) [41]. Кроме того, ЭРГ показала значительное увеличение амплитуды ответа при трех самых высоких интенсивностях стимулов (2,5, 5 и 10 кдо/м2) (p = 0,03). Для дальнейшей оценки успешности субретинальных инъекций у овец Banin и др. провели иммуногистостатирование и показали, что в обработанных сетчатках наблюдался высокий уровень экспрессии белка CNGA3, сравнимый с таковым в контрольных глазах и выше, чем в мутантных не обработанных глазах [41]. Овец также использовали Gootwine и др., где пораженных CNGA3 животных лечили AAV5, содержащим нормальные человеческие гены CNGA3 [42]. Выполнялись односторонние субретинальные инъекции с доставкой от 4,5 до 5 х 10¹¹ геномов вектора на мл. Для изучения реакции после инъекций проводили ЭРГ, которая показала, что фотопическое зрение у двух из четырех исследованных овец было восстановлено [42].

К сожалению, субретинальные инъекции были связаны с рядом побочных эффектов, хотя при таком способе вирусные векторы наиболее эффективно доставляются в клетки сетчатки [25]. Чаще всего наблюдалось отслоение сетчатки [25, 38]. Du и др. сравнили эффективность и безопасность субретинальных и интравитреальных инъекций векторов AAV5 и AAV8 [25]. Они сообщили, что векторы AAV8 с ДНК человека CNGA3 дикого типа восстанавливали функцию колбочек при введении в стекловидное тело и субретинальное пространство мышей, о чем свидетельствовали исследования ЭРГ, проведенные в течение длительного периода наблюдения, до 6 месяцев. С другой стороны, векторы AAV5 были эффективны только при введении в субретинальное пространство, возможно, из-за их более низкой эффективности по трансдукции фоторецепторов по сравнению с AAV8. [25, 34-36] Следовательно, только введенные в стекловидное тело AAV8, но не витреальные AAV5 векторы могли мигрировать и проникать в сетчатку, обеспечивая терапевтический результат. Кроме того, при инъекциях в стекловидное тело не наблюдалось значительных побочных эффектов [25].

В одном из последних исследований проверялась безопасность и результаты субретинальной генной терапии на пациентах с ахроматизмом [43]. Девять взрослых (8 мужчин; 1 женщина) с диагнозом ахроматопсия, связанная с CNGA3, средний возраст которых составлял 39,6 ± 11,9 лет, были включены в открытое нерандомизированное контролируемое исследование, проведенное Fischer и др. Доклинические испытания безопасности на мышах (нечеловеческих приматах) показали, что AAV8.CNGA3 может быть введен в субретинальное пространство без вреда [43]. Девять пациентов в соответствии с протоколом были разделены на три группы с возрастающими дозами (1 x 10¹⁰ векторных геномов (vg), 5 x 10¹⁰ vg, 1 x 10¹¹ vg). Безопасность AAV8.CNGA3 и переносимость пациентами проверяли: анализы крови (включая иммунный ответ), жизненные показатели и типичные клинико-химические тесты [43]. Данные были собраны по результатам тестов на остроту зрения и контрастную чувствительность, а также других тестов, оценивающих разрешение, цветность и яркость, начиная с исходного уровня и до одного года. Буквенная оценка остроты зрения с наилучшей коррекцией (BCVA) до начала генной терапии варьировалась от 34 до 50, оценка по шкале Снеллена - от 20/200 до 20/100, оценка контрастной чувствительности - 0,1-0,9 [43]. Через год после односторонней субретинальной инъекции дозы AAV8.CNGA3 (каждому пациенту в соответствии с назначенной группой) результаты показали среднее улучшение на 2,9 буквы (95% ДИ, 1,65-4,13 буквы, p = 0,006) и на 0,33 log балла контрастной чувствительности (95% CI, 0,14-0,51 log, p = 0,003). Это означало улучшение остроты зрения и контрастной чувствительности, что позволило сделать вывод об активации фоторецепторов колбочек у взрослых ахроматов, при этом после инъекции не развилось никаких осложнений [43]. Хотя это исследование было основано на небольшом количестве участников - девять человек, которые наблюдались только в течение одного года, авторы пришли к выводу, что лечение ахроматопсии с помощью генотерапии у взрослых безопасно и перспективно [43]. Будущие исследования позволят оценить связь более раннего начала лечения с уровнем успеха.

В настоящее время нерандомизированное клиническое исследование 1/2 фазы генотерапии CNGA3 на людях проводится Feinsod и др. в нескольких медицинских центрах (NCT02935517) [44]. Исследование все еще находится на стадии набора участников и должно завершиться к сентябрю 2025 года [44]. Двадцать четыре человеческих глаза с мутациями CNGA3 планируется подвергнуть инъекции вектора AAV2 в субретинальное пространство.

Мутации CNGB3 чаще всего регистрируются в Европе и США, их распространенность приближается к 50% случаев ахроматопсии [31]. Были созданы нокаутные животные модели гена CNGB3, включая мышей и собак; колбочки были уменьшены, а не полностью отсутствовали, и наблюдалась прогрессирующая дегенерация колбочек [31]. Многочисленные исследования генотерапии были направлены на этот ген. Два основных используемых серотипа вирусов - AAV2 и AAV5. Адено-ассоциированный вирус серотипа 5, рекомбинированный с геном CNGB3 человека, был введен в субретинальное пространство 33 глаз собаки [45]. Функция колбочек в глазах мутантов CNGB3 была восстановлена после субретинальной инъекции, что измерялось по ЭРГ с мерцанием колбочек. Эти результаты сохранялись до 2,5 лет, а средний период после лечения составил 1 год [45]. Глаза мышей с мутациями CNGB3 также использовались в качестве модели для лечения векторами AAV2 [46, 47]. Функция колбочек была восстановлена в глазах, подвергшихся субретинальным вирусным инъекциям. Однако побочные эффекты включали хориоретинит и увеит, отслоение сетчатки и рубцевание сетчатки в местах инъекций [45-47].

Зарегистрировано два клинических испытания на CNGB3-мутантных глазах человека: Dolgin и др. набирают 28 участников в нескольких медицинских центрах США и будут лечить их с помощью субретинальных инъекций AAV2 - CNGB3 (NCT02599922) [47]. Кроме того, Brainbridge и др. завершили нерандомизированное, открытое исследование фазы 1/2 в Moorfields Eye Hospital, которое включало 23 человека (NCT03001310) [49]. Набор был закрыт в июле 2020 года; результаты еще не получены [49].

Было обнаружено множество типов мутаций, ответственных за ахроматопсию, связанную с Gnat2: одна нонсенс-мутация, одна большая делеция в 2019 п.н., четыре мутации со сдвигом рамки считывания (делеция и/или вставка) и миссенс-мутация [50, 51]. На уровне молекулярного фенотипа все они блокировали формирование функционального сигнального G-белка или его взаимодействие со зрительными пигментами [52]. Однако специфическая последовательность для ахроматопсии GNAT2 еще не идентифицирована. В 2007 году было проведено успешное прецедентное исследование генотерапии, направленное на фоторецепторы колбочек, восстанавливающие цветовое зрение при мышиной ахроматопсии [50]. Замещающая мутация (D200N), приводящая к миссенс-мутации, задействована у мышей GNAT2^cpfl3; у них не наблюдалось изменений в реакции ЭРГ, адаптированной к темноте, но и реакция ЭРГ, адаптированная к свету, была незначительной или отсутствовала по сравнению с диким типом. Таким образом, при проверке эффективности обработанных глаз основное внимание уделялось изменениям в адаптированной к свету ЭРГ реакции [50]. Для создания генома вектора AAV был выбран промотор красно-зеленого опсина размером 2,1 кб (PR2.1). Мышам вводили 4 х 10¹⁰ vg в субретинальное пространство. В возрасте до семи месяцев обработанные глаза отвечали, причем функция колбочками-опосредованной ЭРГ восстанавливалась [50]. Более того, оптометрические измерения показали улучшение в пролеченных глазах с результатами, приближающимися к остроте зрения дикого типа. Планируются дальнейшие исследования для работы над более общим промотором, направленным на все три типа колбочек [50].

Mancuso и др. провели исследование с участием беличьих обезьян, у которых была мутация в гене L-опсина, кодирующем колбочки, чувствительные к длинным волнам света [53]. 2,7 х 10¹³ rAAV2/5, соединенных с PR2.1 и фрагментом кДНК рекомбинантного человеческого L-опсина, были введены субретинально. За обезьянами наблюдали до 20 недель после инъекции, и было зафиксировано восстановление трихроматического зрения, при котором сине-зеленая и красно-фиолетовая спектральные чувствительности значительно улучшились, что было измерено с помощью компьютерного теста цветового зрения [53]. Mancuso и др. отметили, что добавление третьего типа колбочек было необходимо для обретения почти идеального цветового зрения с использованием ранее существовавших нейронных путей [53]. Реакция на лечение продолжалась более двух лет [53].

Zhang и др. изучали генотерапию на 30 крысах, мутантных по М-колбочкам [54]. В норме у крыс отсутствуют L-колбочки; таким образом, они служили животной моделью для монохроматии синих колбочек (когда в сетчатке человека отсутствуют как L-, так и M-колбочки). Крысам были сделаны субретинальные инъекции двух серотипов AAV: AAV5 и AAV8, содержащих кДНК генов L-опсина и M-опсина человека, соответственно [54]. Электроретинограммы снимали после инъекции для отслеживания изменений в реакции. Авторы сообщили, что сетчатка, в которую вводили гены M-опсина, а не L-опсина, показала значительное восстановление функциональности колбочек через 2 месяца после инъекции [54]. Эти результаты были объяснены тем, что человеческие гены L-опсина не совместимы с системой фототрансдукции крыс [54].

Аналогичное исследование было проведено Deng и др., где мышам с мутантным М-конусом были сделаны субретинальные инъекции векторов AAV5 с генами человеческого L-опсина и М-опсина [55]. ЭРГ проводилась через 6 недель после инъекций и показала, что реакции М-колбочек восстановились. Эти реакции были значительно выше, чем в контрольных глазах без лечения (p < 0.005) [52].

Генотерапия является многообещающим новым методом лечения нарушений цветового зрения. Было проведено несколько экспериментальных исследований на животных моделях для трех наиболее распространенных генов ахроматопсии: CNGB3, CNGA3 и GNAT2, а также несколько клинических испытаний I/II фазы. Гены L-опсина и M-опсина также были выбраны в качестве мишеней. Все они показали длительное улучшение функциональности клеток колбочек, продемонстрированное с помощью ЭРГ и зрительно вызванного поведения. Также было документально подтверждено, что доставка генов в терапии посредством интравитреальных, а не субретинальных инъекций может быть более безопасной. Немногие исследования показали значительную связь между ранним вмешательством и лучшими результатами. Проведенные на сегодняшний день исследования являются многообещающими и считаются большим достижением в генетической офтальмологии. Тем не менее, необходимо еще больше исследований и времени, прежде чем генная терапия станет одобренным и безопасным методом лечения.