За последние два десятилетия исследования продвинули генотерапию глаз от концептуального обоснования до клинической реальности, поскольку первый генотерапевтический метод лечения редкого заболевания сетчатки, врожденного амавроза Лебера, вызванного мутациями в гене RPE65, был одобрен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США в 2017 году (Prado et al., 2020). По состоянию на 2017 год на глазные заболевания приходилось лишь 1,3% всех клинических испытаний генотерапии, в то время как на рак приходилось 65% (Таблица 1) (Ginn et al., 2017). Исследований, связанных конкретно с роговицей, значительно меньше, чем с сетчаткой (табл. 2) (Ginn et al., 2017), однако прогресс в области генотерапии роговицы поражает, несмотря на то, что все еще находится на доклиническом уровне. Накопленные литературные данные свидетельствуют о подтверждении правильности концепции, идентификации многих терапевтических генов, оптимизации важнейших инструментов и методов доставки генов, нацеленных на клетки, установлении новых молекулярных мишеней и демонстрации успеха генотерапии в лечении дефектов и заболеваний роговицы in vivo с использованием стандартных моделей животных (Di Iorio et al., 2019; Mohan et al., 2013, 2018). По данным Всемирной организации здравоохранения, слепота из-за нарушений роговицы является четвертой основной причиной слепоты во всем мире: более 39 миллионов человек полностью ослепли, а 246 миллионов испытывают ухудшение зрения. Заболевания роговицы являются причиной потери зрения почти у 4% населения США и второй основной причиной слепоты в большинстве развивающихся стран мира (Oliva et al., 2012; Pascolini and Mariotti, 2012). Еще более удивительным является рост числа молодых людей, у которых развивается заболевание роговицы и которые до конца жизни живут с инвалидностью (Oliva et al., 2012). Национальный институт глаза сообщает, что в настоящее время на офтальмологическую помощь тратится 70 миллиардов долларов в год, и прогнозирует, что к 2050 году эта сумма достигнет 717 миллиардов долларов; поэтому клиницисты/ученые должны найти средства профилактики, лечения и устранения роговичной слепоты. Основные причины слепоты включают инфекцию (трахома, онхоцеркоз) и травмы (травмы, боевые ранения), но ятрогенная этиология также рассматривается в связи с рутинной медицинской практикой, такой как фоторефракционная кератэктомия (PRK) (Всемирная организация здравоохранения, 2020).

Table 1. Gene therapy clinical trials based on study classification as of 2017 (Ginn et al., 2017).

Table 2. Ocular diseases for which human gene transfer clinical trials have been approved as of 2017 (Ginn et al., 2017).

Идеальная генотерапия предполагает безопасное и не иммуногенное введение генетического материала с помощью способного вектора в клетки мишени, делая их способными восстанавливать, заменять и/или усиливать функции дефектных/нефункциональных генов в терапевтических целях. Роговица является модельной тканью для генотерапии благодаря своей легкодоступности, иммуно-привилегированному статусу и расположению, позволяющему визуализировать реакцию генотерапии невооруженным глазом. Для введения вектора генотерапии в роговицу можно использовать все возможные методы, такие как топические, механические, хирургические, электрические или химические, а применение простых методов доставки вектора позволило добиться тканеспецифической доставки генов в нужные клетки роговицы кроликов и грызунов in vivo и клетки роговицы человека ex vivo. Кроме того, роговицу можно поддерживать в искусственной физиологической среде в течение нескольких недель в экспериментальных целях, а также для применения лечения перед пересадкой роговицы с целью минимизации пагубных последствий отторжения трансплантата (Mohan et al., 2013; Torrecilla et al., 2018).

В последнее время генотерапия получила новое развитие под названием редактирование генов, которое представляет собой совокупность современных технологических достижений, позволяющих исследователям ускорить редактирование желаемого генетического материала в геноме организма путем вставки, удаления, модификации или замены генетического материала. Для облегчения редактирования генов используются нуклеазы цинковые пальчики (ZNFs), нуклеазы с эффекторами, подобными активаторам транскрипции (TALENs), и системы Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Associated Systems (CRISPR/Cas9) с эффективными векторами для системной доставки и достижения высокоспецифичного редактирования генов с минимальными негативными последствиями (Chang et al., 2018; Raikwar et al., 2016). Редактирование генов обладает невероятным потенциалом для долгосрочного решения проблемы заболеваний роговицы, особенно врожденных или наследственных (Yin et al., 2014).

Успех генотерапии заболеваний роговицы во многом зависит от введения адекватных уровней терапевтических генов в искомые клеточные популяции при использовании наименее инвазивных методов (безопасность пациента) и минимальной иммунной реакции. В целом, существуют две основные категории векторов, вирусные и невирусные, которые используются для этой цели.

Вирусы стали одним из наиболее эффективных средств доставки терапевтических рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки для генотерапии роговицы. Вирусы обладают уникальной способностью быстро и с минимальным сопротивлением вторгаться в живые клетки; однако вирусные векторы, используемые для доставки генов, лишены способности к репликации. Они используют различные механизмы и начинают реплицироваться и производить больше копий, взламывая клеточные механизмы хозяина. Эти характеристики позволили исследователям использовать вирусы для культивирования физиологической функции генов, что привело к лечению различных заболеваний роговицы. Для целей генотерапии вирусы модифицируются с помощью технологии рекомбинантной ДНК и являются естественными, но не дикого типа. К широко используемым рекомбинантным (r) вирусным векторам для генотерапии роговицы относятся аденовирус (rAV), ретровирус (rRV), лентивирус (rLV), вирус простого герпеса (rHSV) и адено-ассоциированный вирус (rAAV) (Mohan et al., 2013). Таблица 3, Таблица 4 и Рис. 1 описывают свойства, размер, продолжительность экспрессии доставляемого гена, преимущества, ограничения и способ проникновения в клетки различных векторов для лечения различных заболеваний роговицы.



Таблица 3. Характеристики, преимущества и ограничения широко используемых векторов, применяемых в генотерапии роговицы.



Table 4. Target therapeutic genes, study models, species, and delivery techniques are outlined by various vector platforms and corneal disorders.



Fig. 1. Schematic diagram showing vectors size, mechanisms of cellular entry, and gene transduction, replication, and production processes. Also shown are the respective durations of transgene expression for each viral vector.

Аденовирус (AV) - это двунитевой ДНК-вирус семейства Adenoviridae с геномом от 30 до 40 тысяч пар оснований. Из 50 известных серотипов AV человека серотипы 2 и 5 обычно используются для создания rAV путем стирания гена E1, необходимого для экспрессии и репликации вирусных генов, и получения их с помощью clever системы (эмбриональные клетки почки человека), дающей продукты со стертым геном E1 (Sharma et al., 2010b). Векторы AV переносят терапевтические гены в клетки хозяина посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, используя клеточный поверхностный рецептор Коксаки-AV, интегрины αvβ3 и покрытые клатрином ямки. После достижения цитоплазмы вирусный геном высвобождается и транспортируется в ядро для эписомной репликации с целью получения терапевтической ДНК (рис. 1) (Mohan et al., 2005). Обычно рекомбинантный аденовирусный вектор (AV) трансфицирует эпителиальные и эндотелиальные клетки роговицы, но не кератоциты (Liu et al., 2008). Преимущества этого вектора включают отсутствие интеграции в клетку-хозяина без риска инсерционного мутагенеза, трансдукцию многих типов клеток (делящихся и неделящихся) и способность переносить большие гены в качестве терапевтических средств (~30 кб). К недостаткам относятся короткая продолжительность экспрессии терапевтических генов (обычно до 2 недель) и чрезмерные воспалительные и иммуногенные реакции из-за предшествующего воздействия AVs на пациента (Таблица 3) (Mohan et al., 2013). Для снижения побочных реакций было разработано несколько поколений векторов AV, и наиболее успешным является вектор третьего/последнего поколения, называемый gutless AV (лишенным всех генов AV) или хелпер-зависимым AV. Получение gutless AV в отсутствие helper AV, но в присутствии helper плазмиды оказалось новой платформой для генотерапии наследственных заболеваний. Этот метод привел к значительному сокращению загрязняющих helper AV в процессе производства, что привело к меньшей токсичности для клеток, инфицированных желаемым трансгеном (Lee et al., 2019).

Ретровирусы (RV), покрытые оболочкой однонитевые РНК-вирусы семейства Retrovirdae, были одними из первых вирусов, которые были протестированы для генотерапии. RVs состоят из двух одинаковых, линейных одноцепочечных РНК, расположенных в цилиндрической ядерной оболочке (core) с размером генома ~7-11 кб. Они состоят из трех подсемейств, включая онковирины, лентивирины и спумавирины, причем онко-RVs были первыми вирусами, использованными в генотерапии (Mohan et al., 2013). RVs содержат три основных гена - gag, pol и env, которые кодируют белки капсида, ферменты репликации (обратную транскриптазу или интегразу) и белки оболочки, соответственно. Белки оболочки ретровируса связываются с поверхностными рецепторами клетки-хозяина, и вирусное содержимое (core) проникает в клетку благодаря слиянию мембран. Попав внутрь клетки, вирусный геном высвобождается, преобразуется в двухцепочечную провирусную ДНК с помощью вирусной обратной транскриптазы, а вновь синтезированный геном попадает в ядро и интегрируется в геном клетки-хозяина, продуцируя терапевтические генные белки (рис. 1) (Sharma et al., 2010b). К основным преимуществам использования RVs относятся умеренная иммуногенность и длительная экспрессия терапевтического гена (от нескольких месяцев до нескольких лет) благодаря стабильной экспрессии доставляемого гена. Недостатки включают интеграцию RVs в геном клетки-хозяина с риском инсерционного мутагенеза. Кроме того, RVs могут быть онкогенными, высоко-иммуногенными и трансдуцировать только активно делящиеся клетки. Эти свойства ограничивают их применение для доставки генотерапии в митотически некомпетентные эндотелиальные клетки роговицы и другие подобные клетки глаза (табл. 3) (Mohan et al., 2013).

Лентивирус (LV) - это покрытый оболочкой однонитевой РНК-вирус семейства Retrovirdae, который связывает рецепторы клетки-хозяина и приводит к выбросу трансгенного материала в цитоплазму. Под действием вирусной обратной транскриптазы образуется ДНК, которая перемещается в ядро для образования вирусных белков. Способ введения терапевтических генов с помощью LV очень похож на RV, за исключением того, что геном LV экспрессируется в эписомах (рис. 1). Было показано, что LV трансфицируют эпителиальные и эндотелиальные клетки и кератоциты различными методами (Bainbridge et al., 2001; Bemelmans et al., 2009; Oliveira et al., 2010). Основными преимуществами LVs являются повышенная безопасность по сравнению с RVs, долгосрочная экспрессия трансгенов, широкий тропизм и способность трансдуцировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки. По сравнению с RVs, риск инсерционного мутагенеза от LVs значительно ниже и возникает только в случае нарушения. К недостаткам относятся высокая иммуногенность, ВИЧ-происхождение и возможность случайной интеграции (табл. 3). Векторы LV стали мощным инструментом для доказательной генотерапии и исследований профилирования экспрессии генов в лабораторных условиях (Mohan et al., 2013).

Herpes simplex virus (HSV) - это покрытый оболочкой вирус с двухцепочечной ДНК, относящийся к семейству Herpesviridae. Зрелый вирион простого герпеса содержит внешнюю оболочку из гликопротеинов, позволяющую проникнуть в клетку-хозяина, аморфный слой (тегумент) из структурных и регуляторных белков и икосадельтаэдрический капсид, содержащий тороидальную dsDNA (рис. 1). Геном HSV-1, человеческого патогена, вызывающего HSV-кератит, был изменен для целей генотерапии роговицы. Упаковочная способность вектора rHSV велика - до 150 кб (Manservigi et al., 2010; Mohan et al., 2005). Векторы HSV успешно доставляют трансген в эндотелиальные клетки роговицы человека и кролика ex vivo (Hudde et al., 2000) и роговицы мыши in vivo (Spencer et al., 2000). Векторы HSV раннего поколения показали высокую иммунную реакцию, сильное внутриглазное воспаление у приматов, но незначительное у грызунов, и кратковременную экспрессию трансгена (Liu et al., 1999; Spencer et al., 2000; Zhang et al., 2012). Разработанные впоследствии векторы HSV демонстрируют меньшую иммунную реакцию и устойчивую экспрессию доставленного гена в клетках глаза (Miyagawa et al., 2015). Почти девяносто процентов людей имеют антитела к HSV-1 или HSV-2, что вызывает опасения относительно их клинического применения (Wald and Corey, 2007).

Adeno-associated virus (AAV) - это одноцепочечный ДНК-вирус семейства Parvoviridae, который успешно используется у людей для глазной генотерапии. Известно более 100 серотипов AAV, но для генотерапии тестируются только серотипы 1-10. AAV представляет собой икосаэдрический капсид с геномом размером 4,7 кб, содержащим две открытые рамки считывания (ORF), которые кодируют rep и cap. ORF для rep кодирует 4 отдельных белка, rep40, rep52, rep68 и rep78. Rep68 и rep78 необходимы для репликации и трансляции вирусного генома, а rep40 и rep52 - для упаковки генома в капсид (Naso et al., 2017). Проникновение AAV в клетку-хозяина специфично для серотипа и диктуется последовательностью вирусного капсида, что также объясняет различия в тканевом питании (трофизме). Серотипы 1-3 связываются с гепарансульфатными протеогликанами, серотипы 4-6 связываются с 2,3-ассоциированной сиаловой кислотой, а серотипы 8 и 9 связываются с ламинином. AAV после связывания со своим основным рецептором и сопутствующими рецепторами, интегрином α_vβ₅ или основным фактором роста фибробластов, эндоцитируется через опосредованное рецептором образование ямки, покрытой клатрином (Mohan et al., 2013). Попадая внутрь клетки, геном AAV высвобождается в цитозоль посредством эндосомального лизиса и отжигается к комплементарной нити, предоставленной другим инфицирующим вирусом или захватом эндогенного механизма хозяина (рис. 1). Геном AAV либо интегрируется в хромосому 19, либо остается эписомным. Рекомбинантные AAV (AAV) производятся путем совместной трансфекции упаковочной клеточной линии двумя частями: вирусным вектором и вспомогательной плазмидой. Векторы AAV могут инфицировать все три основные клетки роговицы: эпителий, кератоциты и эндотелий (Liu et al., 2008). Тем не менее, векторы AAV демонстрируют уникальный клеточный тропизм и эффективность трансдукции для различных клеток роговицы благодаря отличительному капсидному белку. Исследование, сравнивающее тропизм AV и AAV к различным клеткам роговицы с использованием органных культур роговицы кролика и человека, показало, что больше трансдукции происходит в эпителий и эндотелий по сравнению со стромой (Liu et al., 2008). AAV1 и AAV8 показали более высокую трансдукцию в эпителий по сравнению с AAV2, AAV5 или AAV7. Эти серотипы трансдуцировали строму и эндотелий в роговице кролика на разном уровне (Liu et al., 2008). Клеточный тропизм и относительная эффективность трансдукции гибридных векторов AAV2/6, AAV2/8 и AAV2/9 были определены в порядке AAV2/6 > AAV2/9 > AAV2/8 для первичных фибробластов роговицы человека (Sharma et al., 2010a). С другой стороны, сравнительный анализ клеточного тропизма и относительной эффективности трансдукции трех гибридных серотипов AAV, AAV2/6, AAV2/8 и AAV2/9 для роговицы мыши in vivo и донорской роговицы человека ex vivo показал, что большее значение имеет AAV9, за которым следуют AAV8 и AAV6 (Sharma et al., 2010d). Рекомбинантный AAV также остается эписомным, и экспрессия не переносится в дочерние клетки после клеточного деления (O'Donnell et al., 2009; Colella et al., 2017). Преимущества AAV включают высокую эффективность для делящихся и неделящихся клеток роговицы, стабильную трансдукцию, длительную продолжительность экспрессии доставленного гена и сайт-специфическую интеграцию благодаря использованию определенных серотипов. К недостаткам относятся небольшой размер упаковочной ёмкости и опасения по поводу предсуществующего иммунитета (Таблица 3).

AAV2 является первым серотипом, испытанным для генотерапии роговицы, он успешно доставил трансген в строму кролика in vivo только при местном введении на оголенный стромальный слой, созданный с помощью микрокератома (Mohan et al., 2003a). Естественное присутствие серотипа AAV2 в организме человека может негативно повлиять на эффективность и безопасность лечения. Чтобы решить эту проблему, были созданы и испытаны для генотерапии роговицы гибридные rAAV-векторы, использующие геном AAV2 и капсид других серотипов. Накапливающаяся литература показывает, что эффективность трансдукции, время появления начального трансгена, уровень и продолжительность экспрессии доставляемого гена специфичны для каждого гибридного вектора (Mohan et al., 2013). Сравнительный анализ гибридных векторов выявил высокую доставку трансгенов AAV2/5, затем AAV2/6, AAV2/8 и AAV2/9 в фибробласты роговицы человека in vitro без значительной цитотоксичности (Buss et al., 2010; Sharma et al., 2010a, d). С другой стороны, однократное местное нанесение AAV2/5, AAV2/8 или AAV2/9 на лишенную эпителия роговицу обеспечивает значительную трансфекцию трансгена в стромальные кератоциты кролика/грызуна in vivo без значительных побочных эффектов в течение 12 месяцев (Mohan et al., 2011a, b, c; Sharma et al., 2010b).

Впоследствии были созданы double stranded self-complimentary AAV (scAAV), чтобы обойти требование генерации комплементарных цепочек и быстро получить инициальную экспрессию доставленного гена. Предположительно, векторы scAAV демонстрируют более высокую эффективность при более низких титрах в тканеспецифическим и серотип-зависимым способом (Buie et al., 2010). Эти векторы демонстрируют заметный перенос генов в различные клетки мишени роговицы in vivo (Gruenert et al., 2016; Kong et al., 2010; Wang et al., 2017; Yokoi et al., 2007). Поскольку внутриклеточный трафик вирусного капсида через убиквитин-протеасомный путь играет важную роль в определении эффективности трансдукции AAV, рекомбинантные тирозин-мутантные векторы AAV создаются путем модификации остатков тирозина на поверхности капсида. Мутация поверхностных остатков тирозина на капсиде AAV обходит этап убиквитинирования и ингибирует деградацию, опосредованную протеасомой, и, следовательно, значительно повышает эффективность трансдукции AAV. Одиночные или множественные тирозин-фенилаланиновые мутации в остатках тирозина в капсиде AAV (Y252, Y272, Y444, Y500, Y700, Y704 и Y730) увеличивали многочисленность инфекций от 100 до 10 000 (Petrs-Silva et al., 2009; Ryals et al., 2011; Zhong et al., 2008a). Тирозин-мутантные векторы AAV2, AAV8 и AAV9 эффективно доставляют гены в кератоциты и эндотелий роговицы кролика и мыши in vivo и фибробласты роговицы человека и эндотелиальные клетки in vitro (Mohan et al., неопубликованные данные; Sharma et al., 2010c). Более высокая экспрессия достигается при использовании тирозин-мутантных AAV из-за отсутствия убиквитинирования капсида и усиленного внутриклеточного транспорта в ядро (Zhong et al., 2008b). Неспособность rAAV переносить большую терапевтическую нагрузку (~1,8 кб) и технические трудности при упаковке и получении высоких титров сужают сферу их применения.

Невирусные векторы не имеют тех же ограничений, что и вирусные векторы, включая проблемы иммуногенности, сложности производства векторов, малую емкость упаковки ДНК и широкий тропизм. Однако у них есть свои проблемы, такие как низкая эффективность трансфекции, агрегация с кровью или другими жидкостями, коллоидная нестабильность в других физиологических жидкостях из-за содержания солей и возможное разрушение терапевтического гена эндонуклеазами (Yin et al., 2014). Невирусные векторы обычно просты, безопасны, их легко производить в промышленных масштабах, они неопасны, малоиммуногенны и экономически эффективны. Различные физические методы, химические вещества и наночастицы (NPs) были использованы в качестве вектора для разработки невирусных подходов генотерапии роговицы (Mohan et al., 2013).

Для разработки физических методов генотерапии роговицы были использованы различные механические, электрические и хирургические методы, такие как генная пушка, гидродинамика, электропортация, ионтофорез, ультразвук, лазеры, микроинъекции, гидратация стромы и другие. Все эти методы с разным успехом вводили плазмидную ДНК в клетки роговицы. Генная пушка использует регулируемые импульсы гелия низкого давления для введения плазмидной ДНК, гелированной металлическими микрочастицами, в ткани-мишени роговицы (Lu et al., 2003). Этот метод позволяет успешно вводить маркерные гены в эпителий роговицы in vivo, но при этом происходят значительные повреждение эпителия и стромы роговицы, включая сопутствующее воспаление (Hao et al., 2010; Klebe et al., 2000; Tanelian et al., 1997). Электропортация и ионтофорез используют электрический ток и электроосмотическую силу для введения плазмидной ДНК, несущей терапевтический ген, в клетки роговицы с легкой/умеренной токсичностью и побочными эффектами (Cassagne et al., 2016; Oshima et al., 2002). Ультрасонография использует ультразвук, микропузырьки и настройки акустических параметров для введения терапевтической ДНК в клетки роговицы без видимого повреждения тканей (Nabili et al., 2014; Sonoda et al., 2006). Разработка вычислительной модели для прогнозирования изменений пористости роговицы после ультразвукового воздействия предоставляет возможность для составления индивидуальных планов лечения для каждого пациента (Hariharan et al., 2017). В развитие сообщения о том, что прямой контакт вектора со стромой имеет решающее значение для доставки генов в кератоциты (Mohan et al., 2003), перенос генов в роговицу свиньи был осуществлен путем создания кармана с помощью фемтосекундного лазера и нанесения вектора на очерченный участок (Bemelmans et al., 2009). Применение различных распространенных хирургических методов, таких как топическая, микроинъекционная, фильтрационная хирургия, стромальная гидратация, LASIK и другие, было полезно для улучшения и достижения тканевой доставки трансгенов в доклинических роговицах кроликов и грызунов (Atencio et al., 2004; Bauer et al., 2006; Mohan et al., 2010; Yin et al., 2019). Вышеописанные физические методы обладают многими преимуществами, включая высокий профиль безопасности, возможность доставки терапевтического гена большого размера, низкую иммуногенность и селективность мишени, однако ненадежная неспецифическая доставка трансгена и низкая эффективность трансфекции ограничивают их более широкое применение.

Частицы размером 1-100 нм, называемые в народе "наночастицами" (NPs), легко эндоцитируются в клетки без какого-либо первоначального проникновения в какой-либо компартмент. Малый размер и большое отношение площади поверхности к объему делают NPs идеальным средством для переноса множества лигандов (например, антител, пептидов, ДНК и зондов) в клетку для генотерапии. Мультиплексирующие свойства NPs позволяют исследователям помечать большие терапевтические нагрузки, молекулярные сенсоры, флуоресцентные маркеры и клеточно-специфические факторы, что делает эти NPs чрезвычайно подходящими для генотерапии. NPs используют различные механизмы, такие как фагоцитоз, макро-пиноцитоз, клатрин- или кавеоло-зависимые или независимые пути проникновения в клетки (Mohan et al., 2012).

NPs широко исследуются для разработки генотерапии роговицы. Полимерные NPs состоят из природных и синтетических полимеров, таких как хитозан, альбумин, дендримеры, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и полиэтиленимин (ПЭИ). Хитозан присутствует в скелете моллюсков и представляет собой линейный полисахарид, состоящий из беспорядочно расположенных ацетилированных и деацетилированных сахарных единиц (D-глюкозамин). Различные составы хитозан-ДНК в NPs могут успешно доставлять гены в клетки роговицы грызунов (Klausner et al., 2010). Деацетилированный хитин является биосовместимым, биоразлагаемым и нетоксичным для клеток и рассматривается как перспективный вектор благодаря его электростатическому взаимодействию с отрицательными зарядами в слое слизи (Klausner et al., 2012). Аналогичным образом, альбуминовые NPs эффективно доставляют терапевтические гены, кодирующие растворимый фактор роста эндотелия сосудов, в роговицу и, как было установлено, снижают неоваскуляризацию без серьезных побочных эффектов (Jani et al., 2007). ПЭГ является наиболее часто изучаемым полимером для глазного применения благодаря низкой иммуногенности и способности успешно доставлять плазмиды в роговицу грызунов и другие глазные ткани in vivo (Cai et al., 2008). Другие полимеры и сополимеры, такие как поли (молочная кислота) PLA и поли (D,L-лактид-со-гликолид) PLGA, которые также являются биосовместимыми и биоразлагаемыми, используются в качестве строительных блоков для наноносителей. Продемонстрирована способность PLGA NPs доставлять лекарство/гены в роговицу грызунов и окологлазные ткани in vitro и in vivo (Amrite and Kompella, 2005; Li et al., 2019). Кроме того, PLGA NPs, нагруженные shRNA (короткая шпилечная РНК) гена VEGF, признаны эффективными и безопасными для регрессии неоваскуляризации мышиной роговицы in vivo (Qazi et al., 2012). С помощью плазмидной трансфекции в эксперименте ex vivo на лошадях были по отдельности подавлены способствующие фиброзу гены Suppressor of mothers against decapentaplegic (Smad) 2, 3 и 4 и избыточно экспрессирован анти-фибротический ген Smad5, что привело к снижению трансдифференцировки фибробластов роговицы в миофибробласты на 83% (Marlo et al., 2018). Torrecilla et al. (2018) использовали липидные NPs в качестве системы доставки генов для лечения воспаления, связанного с неоваскуляризацией роговицы, продемонстрировав подавление матрикс-металлопротеиназы-9 (ММП-9). Полиэтилениминовые (PEI) линейные NPs, в 22 кДа, были оптимизированы с использованием различных соотношений азота и фосфата для достижения максимальной терапевтической реакции на генотерапию в фибробластах роговицы человека и лошади in vitro и роговицы грызунов in vivo (Bosiack et al., 2012b; Donnelly et al., 2014; Rodier et al., 2019). Дендримеры, разветвленные молекулы в форме сферы, состоящие из ядра, внутренней оболочки и внешней оболочки, инкапсулирующей плазмидную ДНК, используются для доставки генотерапии в эндотелий роговицы (Hudde et al., 1999; Souza et al., 2015). Эта генотерапия на основе вектора показала перспективность в снижении отторжения роговичного аллотрансплантата и дефектов эндотелия роговицы. Другой невирусный вектор, катионная липосома, при использовании различных составов успешно доставлял плазмидную ДНК в эндотелиальные клетки роговицы с низкой цитотоксичностью (Klebe et al., 2001; Pleyer et al., 2001).

Золото, благородный металл, использовалось для борьбы со многими недугами в различных формах на протяжении всей истории цивилизации. Его первое применение в медицине можно проследить до 2500 года до н.э. в китайской медицине (Pricker, 1996). Благодаря инертной природе, биосовместимости, пластичности до любого размера и сродству к ДНК, золото используется для синтеза множества металлических и гибридных (металл-полимерных) NPs для доставки генотерапии. Наша лаборатория оптимизировала конъюгированные с полиэтиленимином золотые NPs (PEI2-GNPs) размером 2-12 нМ для доставки генов в роговицу человека in vitro и роговицу кролика in vivo с низкой токсичностью (Sharma et al., 2011). Впоследствии мы изучили ответ на различные виды генотерапии, осуществляемой с помощью вектора PEI2-GNP и генов (BMP7, HGF, декорин, Smads и другие), используя хорошо зарекомендовавшую себя доклиническую модель кролика in vivo и модели заболеваний роговицы человека, лошади и собаки in vitro (Bosiack et al., 2012b; Buss et al., 2010; Chaudhary et al., 2014; Donnelly et al., 2014; Gupta et al., 2018; Mohan et al., 2011a, Mohan et al., 2011b, Mohan et al., 2011c, Mohan et al., 2011d; Sharma et al., 2011; Tandon et al., 2013). Эффекты испытанных моно- и двойной генотерапии в управлении заживлением ран роговицы, фиброзом, неоваскуляризацией и прозрачностью обсуждаются в последующих разделах.