Редактирование генов для коррекции наследственных заболеваний печени открывает перспективы для будущего терапевтического вмешательства, однако отсутствие эффективной и безопасной доставки механизма редактирования генов в гепатоциты затрудняет его клиническое применение. В двух исследованиях сообщается об эффективной доставке генов в печень не человеко-образных приматов, это подтверждает концепцию нового метода лечения наследственной гиперхолестеринемии. ( Rothgangl, T. et al. In vivo adenine base editing of PCSK9 in macaques reduces LDL cholesterol levels. Nat. Biotechnol. https://doi.org/10.1038/s41587-021-00933-4 (2021) | Musunuru, K. et al. In vivo CRISPR base editing of PCSK9 durably lowers cholesterol in primates. Nature 593, 429-434 (2021)).

CRISPR-Cas - это революционная технология редактирования ДНК, имеющая широкое применение в биомедицинских исследованиях, сельском хозяйстве и пищевой промышленности и обладающая большим потенциалом для терапевтического применения¹. Редактирование генома с помощью CRISPR основано на целенаправленном воздействии рибонуклеопротеинового комплекса, который содержит молекулу направляющей гид РНК (guide RNA ) для нацеливания на интересующий геномный регион и бактериальный белок Cas. Cas дикого типа вызывает разрывы двойной нити ДНК (DSB) в регионе мишени, который в соматических клетках будет восстановлен в основном путем эффективного, но подверженного ошибкам негомологичного соединения концов разрывов. Совместная доставка и донорской матрицы, гомологичной региону мишени, способствует точной направленной на гомолог репарации, но с низкой эффективностью. Присущий риск образования DSBs, например, активация p53 и потенциальные хромосомные транслокации, делает менее "инвазивным" редактирование генома, например, с использованием никазы Cas (Cas^nickase), которая вызывает разрыв одной нити ДНК, и более безопасным вариантом для генотерапии in vivo. В двух упомянутых выше работах использован этот последний подход генотерапии и сообщается о нацеливании Cas9^nickase на ген DNA adenine deaminase (ABE), фермента, катализирующего превращение аденина в гуанидин, для внесения точечной мутации в первый донорный сайт сплайсинга гена proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) именно в гепатоцитах с высокой эффективностью^2,3.

У макак однократное введение lipid nanoparticle (LNP), содержащей как гид РНК, направленную на PCSK9, так и мРНК ABE-Cas9^nick, привело к редактированию сайта сплайсинга, что вызвало аберрантный сплайсинг и потерю экспрессии активного PCSK9, белка плазмы, вырабатываемого гепатоцитами, который регулирует количество рецепторов LDL receptor (LDLR) в печени и поджелудочной железе^2,3 (рис. 1). Rothgangl et al.² получили базовую частоту редактирования 26% в печени, что привело к снижению уровня PCSK9 и LDL cholesterol в плазме на 32% и 14% соотв.; повторное воздействие оказалось неэффективным вследствие иммунного ответа на ABE и белок Cas9. Musunuru et al.³ установили эффективность редактирования оснований в печени на уровне 63%, что совпало со средним снижением уровня PCSK9 и LDL cholesterol в плазме на 81% и 65% соотв., причем все эти показатели оставались стабильными в течение 8 месяцев. Более высокая эффективность в последнем исследовании, возможно, объясняется использованием другой формулы ABE и LNP. Предыдущие исследования продемонстрировали перспективность нацеленного на Cas редактирования оснований для лечения моногенных заболеваний печени с использованием адено-ассоциированной вирусной (AAV) доставки в мышиных моделях^4,5. Однако большой размер конструкции, кодирующей CAS^nickase-ABE, требовал доставки двумя векторами AAV, которые только при совместной трансфекции гепатоцита могли вызвать редактирование оснований^4,5. Настоящие исследования^2,3 представляют собой большой шаг вперед, демонстрируя, что преходящая экспрессия ABEs с помощью доставки LNP в печень не только очень эффективна для нокаута гена, но и кажется очень безопасной, по крайней мере, на животных, что указывает на пригодность этого метода для лечения семейных форм гиперхолестеринемии, а также потенциально других тяжелых моногенных заболеваний печени.



Fig. 1: Therapeutic base editing in the liver of macaques upon delivery by lipid nanoparticles.

Two groups, Rothgangl et al.2 and Musunuru et al.3, demonstrate that a Casnickase-ABE construct targeting the PCSK9 exon1-intron1 boundary can be delivered efficiently to the liver of macaques via the systemic circulation to effectively reduce plasma LDL cholesterol levels. gRNA, guide RNA.

При рассмотрении тяжелых моногенных заболеваний печени в качестве кандидатов для генотерапии, заболевания печени, связанные с накоплением токсичного метаболита, можно лечить путем постоянного снижения содержания субстрата. Примером может служить наследственная тирозинаемия типа 1 (OMIM 276700), при которой накопление токсичного сукцинилацетона можно предотвратить, прервав путь деградации тирозина путем нокаута экспрессии 4-гидроксифенилпирувата у мышей⁶. Первичная гипероксалурия типа 1 (OMIM 259900) кажется еще одним кандидатом. Нокаут глиоксилат-оксидазы в соответствующей мышиной модели предотвращает образование глиоксилата, предшественника оксалата, вызывающего повреждение почек у пациентов с гипероксалурией^{7. Такие заболевания можно лечить с помощью CRISPR-направленной инактивации генов в качестве альтернативы пожизненному фармакологическому вмешательству.}

Большинство наследственных заболеваний печени не поддаются лечению путем инактивации генов, а требуют коррекции мутации, вызывающей заболевание. Хотя некоторые мутации-основатели встречаются чаще, большинство наследственных заболеваний печени являются редкими заболеваниями и имеют гетерогенную картину мутаций. Учитывая количество мутаций, вызывающих заболевания, выявленных при большинстве заболеваний печени, разработка и тщательный анализ направляющих гид РНК, специфичных для каждой мутации, представляет собой серьезную проблему. Клинические испытания генотерапии при заболеваниях печени основаны на доставке терапевтической конструкции, содержащей правильную копию гена, расположенную за специфическим для печени промотором. Основным преимуществом такой генной терапии является то, что одна конструкция может быть использована для лечения всех пациентов, независимо от мутации. Было показано, что AAV-опосредованная терапия с добавлением генов для лечения заболеваний печени без каких-либо повреждений печени безопасна и обеспечивает долгосрочную коррекцию у взрослых. Дефицит фактора IX, вызывающий гемофилию B, был первым заболеванием, успешно вылеченным с помощью этого подхода у 14 пациентов (NCT00979238)⁸. В настоящее время эта стратегия тестируется на небольших группах пациентов с различными заболеваниями печени, такими как гемофилия А (NCT02396342), накопление аммиака (дефицит ОТК: NCT02991144) и гипербилирубинемия (дефицит UGT1A1: NCT03466463). Однако, поскольку AAV не интегрируется в геном хозяина, такая терапия будет менее эффективной для лечения заболеваний печени у новорожденных и у пациентов с продолжительным поражением печени. В этих ситуациях AAV-опосредованное добавление или коррекция генов затруднены из-за пролиферации гепатоцитов с последующей потерей терапевтического вектора. Поэтому для успешного добавления генов при таких заболеваниях печени требуется интеграция терапевтической конструкции в геном хозяина. Однако случайная интеграция трансгена в геном может вызвать генотоксичность, в то время как целенаправленная доставка в безопасный локус требует гомологичной репарации, которая неэффективна в соматических клетках¹. Таким образом, редактирование оснований in vivo может стать превосходной альтернативой как не интегрирующей, так и интегрирующей генотерапии для лечения тяжелых наследственных заболеваний печени, обеспечивая более безопасный вариант пожизненной коррекции.

Быстрый прогресс в области инструментов редактирования генов расширяет геномные последовательности, на которые можно воздействовать, и сужает окно модифицирования редакторов оснований, что снижает риск воздействия вне мишени, и в ближайшем будущем этот подход, действительно, может быть применим почти к 90% всех мутаций, вызывающих заболевания⁹. Существующие правила и дизайн клинических испытаний делают специфическое для мутаций и, следовательно, в конечном итоге персонализированное лечение практически невозможным. Для того чтобы редактирование генома с учетом особенностей пациента стало реальной терапевтической возможностью, потребуются доступные методы определения безопасности и эффективности на нескольких пациентах. Клинический потенциал редактирования генов также потребует разработки новых решений для правового регулирования и возмещения расходов. Сделать эти меняющие жизнь вмешательства доступными для пациентов в ближайшем будущем - задача для регулирующих органов, медицинских страховых компаний и правительств¹⁰. Учитывая темпы этих захватывающих технических разработок, будет непросто поспевать за ними.