Последнее обновление: 01/26/2025 06:09:50  Меню и поиск на этом сайте   ЗДЕСЬ  Дополнительная информация   ЗДЕСЬ!!
WMZ: Z191701361450
WMR: R209318204033


Без рекламы только Браузер Uran (скачать )
   Посещений:
CRISPR-cas9 генотерапия муковисцидоза



Зависимые от helper аденовирусные векторы

Potential of helper-dependent Adenoviral vectors in CRISPR-cas9-mediated lung gene therapy
• Ranmal Avinash Bandara, • Ziyan Rachel Chen & • Jim Hu
Cell & Bioscience volume 11, Article number: 145 (2021)

Муковисцидоз (МВ) - это аутосомно-моногенное рецессивное генетическое заболевание, которым страдают более 70 000 человек в США и Европе [1]. Мутации в гене Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) изменяют его функцию как циклического AMP-зависимого хлоридного анионного канала. Этот белок распределяется в основном в эпителиальных клетках различных систем органов, таких как дыхательная, пищеварительная и репродуктивная системы, и мутации в CFTR приводят к мультиорганному поражению у больных МВ. В эпителии дыхательных путей нарушение ионного транспорта приводит к снижению оттока жидкости из дыхательных путей, утолщению слоя слизи и нарушению очистки микроресничками, что вызывает закупорку слизью и воспаление дыхательных путей. В результате хронические легочные инфекции делают МВ угрожающим для жизни [2]. После открытия гена CFTR болезнь легких МВ рассматривалась в качестве модели для генной терапии легких [3].
Зарегистрировано более 2000 мутаций в гене CFTR [4], среди которых вызывающие заболевание делятся на 6 классов. Класс I - белок CFTR не вырабатывается из-за нонсенс или сплайс-мутаций. Класс II - белок CFTR не обрабатывается и не может сформировать правильную структуру или транспортироваться к апикальной мембране. Класс III - белки присутствуют на апикальной мембране, но канал остается закрытым. Класс IV - канал открыт, но движение ионов затруднено из-за измененной внутренней структуры белка. Класс V - вырабатывается недостаточно белков для поддержания нормальной функции. Класс VI - белки нестабильны. Различные мутации влияют на пациентов в разной степени; люди с одинаковым генотипом имеют разную степень проявления болезни, а также разную реакцию на лечение. Хотя традиционные методы лечения МВ включают в себя борьбу с воспалением и избыточной выработкой слизи в результате инфекции, эти методы лечения могут только уменьшить симптомы. Современные методы лечения МВ направлены на восстановление функции белка CFTR [5].
Препараты-модуляторы МВ, направленные на функцию канала CFTR, показали многообещающие результаты в улучшении здоровья большинства пациентов с МВ [5]. Сначала первый CFTR-модулятор, ивакафтор (ivacaftor), показал высокую эффективность лечения пациентов с мутацией класса III G551D [6], которая присутствует примерно у 5% пациентов с МВ. Позже комбинации ивакафтора с другими модуляторами показали эффективность у пациентов, имеющих по крайней мере одну из мутаций класса II - delta508F, которая присутствует у большинства пациентов с МВ [7]. Тем не менее, лечение пациентов с редкими мутациями CFTR класса I все еще ожидается. Кроме того, долгосрочные эффекты лечения этими новыми препаратами до конца не ясны.
Генотерапия, с другой стороны, может стать решением для всех генотипов и, следовательно, для всех пациентов. Генотерапия подразумевает доставку гена дикого типа в ядро для производства нормального белка, что позволяет решить проблему, лежащую в основе заболевания. Для доставки генов необходимы векторы или носители терапевтических генов. Эти векторы можно разделить на два класса: невирусные векторы, такие как липосомы и наночастицы, и вирусные векторы, такие как лентивирусные векторы, адено-ассоциированные вирусные (AAV) векторы и аденовирусные (Ad) векторы.
Липосомы представляют собой двухслойные фосфолипидные наноразмерные везикулы, и в зависимости от размера могут считаться наночастицами [8]. Успешная доставка ДНК (плазмида, с делецией мотива CpG, экспрессирующая кДНК CFTR человека) с помощью липосом в легкие пациентов с МВ была осуществлена [9], и это самое крупное исследование генной терапии МВ с использованием липосом для лечения МВ [9]. Побочных эффектов, характерных для лечения, не наблюдалось. Тем не менее, исследование пришло к выводу, что эффективность и постоянство ответа требуют улучшения [9].
Частицы размером менее 100 нм считаются наночастицами. К ним относятся липосомы, наночастицы оксида железа, полимерные мицеллы, дендримеры, нанооболочки, полимерные наносферы, нанобины и многое другое [10]. В настоящее время более 25 типов наночастиц одобрены Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) и Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA) [10]. Однако ни один носитель наночастиц не был одобрен для генной терапии МВ [10]. Было показано, что наночастицы диаметром менее 200 нм эффективно проникают через слизистую [11].
Лентивирусы имеют РНК-геном и могут заражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Было показано, что разработанные лентивирусные векторы могут трансдуцировать дыхательные пути хорьков, мышей и овец [12, 13]. Эти векторы могут интегрировать свой кДНК-геном в хромосомы хозяина. Однако необходимо доказать их безопасность и эффективность в генной терапии МВ легких.
AAV успешно прошел клинические испытания для лечения гемофилии B, дефицита липопротеиновой липазы и ночной слепоты [14, 15]. Основным недостатком AAV в генной терапии МВ является низкая ёмкость вектора переносить ДНК (5 кб), в то время как миниген CFTR составляет приблизительно 4,44 кб [14]. Несмотря на это затруднение, успешная экспрессия CFTR была достигнута у мышей с использованием более урезанной версии минигена CFTR, соединенной с небольшим промотором [15]. Несмотря на то, что испытания CF с использованием AAV были неудачными из-за низкой экспрессии CFTR [16], усилия по повышению эффективности доставки генов в дыхательные пути продолжаются.
Ad-векторы относятся к первым аденовирусным векторам, использованным для генотерапии МВ. Более чем в 400 испытаниях генной терапии использовались Ad-векторы человека [17, 18]. Однако обычные Ad-векторы не подходят для генотерапии МВ, поскольку эти векторы вызывают сильный иммунный ответ хозяина, и клетки, трансдуцированные этими векторами, уничтожаются через пару недель [19, 20]. Для преодоления проблем этих векторов были разработаны хелпер-зависимые аденовирусные (HD-Ad) векторы [19]. В этих векторах все вирусные кодирующие последовательности удалены. Благодаря отсутствию аденовирусных генов в геноме вектора, эти векторы менее токсичны и обладают гораздо большей способностью переносить ДНК [19, 21, 22]. Наша группа использовала HD-Ad векторы на основе аденовируса типа 5 для успешной трансдукции первичных клеток человека, и переноса их в дыхательные пути мыши и дыхательные пути свиньи [23]. Хотя HD-Ad векторы на основе другого серотипа были использованы для направленной интеграции гена γ-глобина у мышей для генотерапии гемопоэтических стволовых клеток [24], в данном обзоре мы сосредоточимся на обсуждении основных проблем и возможных решений для использования HD-Ad векторов для достижения устойчивой генной коррекции в легких пациентов с МВ.

Overcoming challenges of CRISPR/Cas9 delivery
Последние достижения в области разработки сайт-специфических эндонуклеаз, особенно системы Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) [25], сделали возможным устойчивое редактирование генов. CRISPR/Cas9, наиболее изученная система редактирования генов, увеличивает интеграцию вводимой ДНК путем создания DSBs (Double Stranded Breaks) и может также редактировать существующие мутировавшие последовательности гена CFTR или помогать регулировать экспрессию CFTR (26, 27). Когда новый инструмент, система CRISPR/Cas9, используется в генотерапии легких, возникают новые проблемы. Во-первых, для упаковки кассет экспрессии генов системы CRISPR/Cas9 и донорской ДНК с гомологичными плечами требуется вектор с большой емкостью переноса ДНК и высокой эффективностью доставки генов в дыхательные пути. Большинство распространенных векторов генотерапии, таких как AAV или лентивирусные векторы, используемые для доставки генов in vivo, не обладают такой емкостью. Наша группа показала, что вектор HD-Ad можно использовать для упаковки всех компонентов, необходимых для достижения высокоэффективной сайт-специфической интеграции генов [28, 29]. Хотя отдельные генетические компоненты могут быть перенесены и двумя векторами, большее количество векторов снизит эффективность трансдукции и вызовет более сильные иммунные реакции хозяина.
Будучи бактериальным белком, Cas9 создает еще одну потенциальную иммунную проблему. Charlesworth et al. в 2019 году обнаружили в сыворотке крови человека уже существующие антитела как против Staphylococcus aureus Cas9, так и против Streptococcus pyogenes Cas9 [30]. Предсуществующий иммунитет к Cas9 может быть потенциальной проблемой, но вряд ли это серьезная проблема для доставки генов, поскольку предсуществующие антитела к вирусным векторам не оказывают существенного влияния на перенос генов [31]. Кроме того, если Cas9 будет постоянно экспрессироваться из ген-модифицированных клеток, то иммунная система хозяина уничтожит эти клетки, что негативно скажется на эффективности генотерапии. Одним из решений этой проблемы является доставка белка Cas9 или мРНК таким образом, чтобы присутствие или экспрессия белка Cas9 были преходящими. Хотя этого можно достичь в культивируемых клетках, трудно добиться эффективной доставки in vivo. К счастью, HD-Ad векторы способны доставлять как систему CRISPR-Cas9, так и донорскую ДНК вместе, и после интеграции донорской ДНК целостность генома вектора нарушается, что приводит к деградации остаточного генома и устранению экспрессии Cas9. Таким образом, эта проблема может быть решена с помощью HD-Ad векторов [28, 29].
Эффекты вне мишени являются проблемой для всех инструментов редактирования генов. Специфичность системы CRISPR/Cas9 зависит от наличия единственной направляющей РНК (sgRNA) и протоспейсерного смежного мотива (PAM) рядом с сайтом мишенью. Однако это опасение часто преувеличивается, поскольку смысл использования CRISPR/Cas9 в генотерапии заключается в использовании преимуществ специфичности связывания последовательности. Положительные результаты безопасности и эффективности были получены при генотерапии пациентов с иммунодефицитом аденозиндезаминазы с использованием ретровирусных векторов, которые не обладают интеграционной специфичностью [32]. Этот пример показывает, что риск генетической интеграции в соматических клетках невелик. Тем не менее, существует множество стратегий для дальнейшего повышения специфичности. Эти стратегии включают оптимизацию последовательности sgRNA и уровня экспрессии [33, 34], модификацию белка Cas9 [35] или использование другого белка Cas [36]. Кроме того, система CRISPR может быть модифицирована для выполнения редактирования оснований, которое не требует разрыва двухцепочечной ДНК.
Еще одной серьезной проблемой CRISPR/Cas9-опосредованной генотерапии легких является эффективность редактирования (или интеграции) генов in vivo, поскольку доставка генов in vivo обычно не так эффективна, как в культивируемых клетках. Существует по крайней мере четыре стратегии для преодоления этой проблемы. Во-первых, можно использовать наиболее эффективные векторы генотерапии для доставки всех компонентов редактирования генов в одном векторе. Это было продемонстрировано с помощью вектора HD-Ad [28, 29, 37]. Во-вторых, для повышения эффективности интеграции генов можно использовать небольшие молекулы, такие как SCR7 [38]. Однако при использовании любых молекул для этой цели необходимо тщательно оценить их безопасность in vivo. Кроме того, было показано, что белковые факторы, участвующие в зависимой от гомологов репарации (HDR) ДНК , такие как CtIP [39] и ингибитор 53BP1 [40], усиливают редактирование генов. При использовании этих факторов их экспрессия должна быть преходящей, чтобы избежать потенциальной проблемы влияния на пролиферацию клеток. Наконец, если для коррекции генов используется кассета экспрессии генов, можно интегрировать эту кассету сайт-специфично в более чем одно место для достижения более высокой экспрессии трансгена.

Using CRISPR/Cas9-mediated gene correction to sustain therapeutic gene expression


Считается, что экспрессии функциональных белков CFTR в 5-15% эпителиальных клеток дыхательных путей у больных МВ достаточна для имитации уровня секреции хлоридов дикого типа in vitro [41,42,43], что позволяет устранить заболевание. Хотя это делает генную терапию легких привлекательным вариантом лечения, трудно добиться устойчивой терапевтической экспрессии генов в легких из-за текучести эпителиальных клеток дыхательных путей. Чтобы преодолеть эту проблему, необходимо добиться постоянной и сайт-специфической коррекции генов в эпителиальных стволовых клетках дыхательных путей. К счастью, группа Hogan обнаружила, что некоторые базальные клетки дыхательных путей проявляют свойства стволовых клеток и могут дифференцироваться во все другие типы эпителия [44, 45]; в отличие от мышиных легких, где нет базальных клеток, дыхательные пути человека содержат большую часть базальных клеток. Теперь мы знаем, что базальные клетки дыхательных путей гетерогенны и содержат как стволовые клетки дыхательных путей, так и клетки-предшественники. Базальные клетки расположены вблизи подкожной мембраны и, по-видимому, с трудом поддаются трансдукции. Впервые наша группа продемонстрировала успешную доставку HD-Ad векторов в базальные клетки дыхательных путей свиньи in vivo и базальные клетки человека от пациентов с МВ в воздушно-жидкостных культурах [23], хотя необходимы дальнейшие исследования в этой области [23].
Предполагается, что CRISPR/Cas9-опосредованная коррекция генов будет играть важную роль в будущей генной терапии легких. Ниже перечислены потенциальные способы использования системы CRISPR/Cas9 для коррекции генов (рис. 1).



Fig. 1 Schematic presentation of four strategies of Cas9-mediated permanent gene correction. Mutant alleles of the CFTR gene can be corrected by integration of a copy of the wild-type gene through homology directed repair or homology independent targeted integration and microhomology-mediated end joining as well as base editing

Site-specific gene integration


Сайт-специфическая вставка функциональной копии минигена CFTR (кДНК в кассете экспрессии) либо в локус CFTR, либо в геномную безопасную "гавань", такую как AAVS1, обеспечит длительную экспрессию CFTR, поскольку он затем реплицируется и передается дочерним клеткам. Вставка ДНК значительно увеличивается, если участок ДНК, предназначенный для интеграции в геном, расщеплен. У эукариот такие события разделения, как DSBs, могут быть завершены путем гомологичной или негомологичной рекомбинации [46]. Поскольку CRISPR/Cas9 создает DSBs, последовательности ДНК могут быть вставлены в определенные участки с помощью гомологичной рекомбинации (HR) или негомологичного соединения концов (NHEJ) [26, 47]. Таким образом, копия гена CFTR может быть интегрирована в ДНК после CRISPR-опосредованной индукции DSBs с помощью нескольких механизмов, использующих преимущества HR или NHEJ [26].

Homology directed repair (HDR)


Этот тип репарации приводит к отсутствию мутаций в месте разреза CRISPR/Cas9, поскольку DSBs восстанавливаются с использованием гомологичной матрицы [48]. CRISPR/Cas9 создает DSBs в определенных местах, позволяя встраивать функциональный ген с гомологичными плечами, комплиментарными сайту мишени, и эта техника показала успешную экспрессию CFTR в клетках свиньи [9]. Было показано, что при использовании HDR до 10 процентов клеток успешно интегрируют CFTR [29]. Более того, CRISPR/Cas9-опосредованный HDR может быть дополнительно усилен факторами, которые могут увеличить HDR по сравнению с NHEJ [48]. Недостатком этого пути является то, что неделящиеся клетки, как правило, не используют HDR, и HDR активен только на поздних стадиях S и G2 [49, 50]. Стволовые клетки являются основной мишенью для генотерапии, поскольку исправление стволовых клеток д. привести к исправлению мутации во всех ее дочерних клетках. Однако HDR не может осуществляться с высокой частотой из-за состояния покоя стволовых клеток [51]. Поэтому, как обсуждалось в предыдущем разделе, необходимы стратегии для повышения эффективности сайт-специфической интеграции генов.

Homology-independent targeted integration (HITI)


HITI использует путь NHEJ, который присутствует как в делящихся, так и в неделящихся клетках [49]. Метод основан на превосходной активности NHEJ во многих типах клеток по сравнению с HDR, который активен только на стадиях S/G2. Было показано, что HITI использует механизм репарации NHEJ, не подверженный ошибкам, для вставки ДНК [49]. Было показано, что интеграция ДНК с помощью HITI не приводит к образованию вставок или делеций в сайте мишени [19-22]. Однако анализ эффективности интеграции требует дальнейшего изучения.

Microhomology mediated end joining (MMEJ)


Эта техника использует 5-25 пар оснований микро-гомологичных последовательностей для вставки генов после нуклеазного расщепления ДНК минигена [50]. Необходимо провести дальнейшие исследования, чтобы продемонстрировать эффективность интеграции этой техники. MMEJ происходит во время G1 и ранней S фазы и поэтому может быть не очень хорошим методом для вставки генов в стволовые клетки, если только эффективность не будет повышена во время этих фаз клеточного цикла [50].

Base-editing


Коррекция мутировавших оснований с помощью CRISPR/Cas9 в сочетании с ДНК-модуляторами приводит к трансляции функционального белка CFTR [52]. Cas9 помогает в функционировании ДНК-модуляторов, вызывая образование одноцепочечной R-петли. Слияние цитидиндеаминазы с Cas9 позволяет редактировать основания цитидина на тимидин (CBE), а слияние гетеродимера TadA с Cas9 позволяет превращать основания аденина в гуанин (ABE) [53]. Основным преимуществом редактирования оснований является то, что оно не приводит к разрывам двух нитей ДНК, что позволяет избежать риска вставок вне мишени. Ограничение этого метода заключается в том, что привлечение ДНК-модуляторов, направляемых протоспейсером, может действовать как на основания в пределах сайта мишени, которые не мутировали, так и вызвать изменения оснований в сайтах вне мишени [54-56]. Однако, в отличие от редакторов цитидиновых оснований, при использовании редакторов адениновых оснований не было обнаружено мутаций вне мишени [52, 56]. Этот принцип был применен для редактирования оснований в органоидных культурах, полученных от пациентов с МВ, и было показано, что это приводит к экспрессии CFTR (52).

Physical and immune barriers to gene delivery in vivo


Помимо проблем, специфичных для доставки CRISPR/Cas9 в дыхательные пути, существуют и общие барьеры, которые необходимо преодолеть для проведения CRISPR/Cas9-опосредованной генотерапии in vivo. Первым барьером для доставки генов в дыхательные пути является слой слизи [57]. Инородные вещества, включая вирусы, которые прикрепляются к слою слизи, очищаются действием ворсинок[58-60]. У пациентов с МВ наблюдалось, что Ad и AAV векторы задерживаются слизью дыхательных путей [61]; чрезмерное скопление слизи затрудняет доступ векторов генной терапии к клеточным мембранам. В клинических условиях пациентов лечат муколитическими препаратами для разжижения слизи. Например, было показано, что Нацистелин улучшает доставку вирусов [62]. Кроме того, рекомбинантная человеческая ДНКза также использовалась для уменьшения ингибирования как AAV, так и опосредованного липосомами переноса генов [63].
Второй физический барьер - это доступность Coxsackie Adenoviral Receptors (CAR) для вирусов Ad2 и Ad5. CAR присутствуют только на базальной стороне, а плотные соединения между эпителиальными клетками закрывают проходы от просвета дыхательных путей. Чтобы обойти этот барьер, несколько химических веществ, которые временно открывают плотные соединения, показали эффект, позволяющий переносить гены. Этиленгликоль тетрауксусная кислота (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA)) - это хелатор кальция, который обратимо открывает плотные соединения [64, 65]. Кроме того, LipoPhosphatidylCholine (LPC) делает клеточные мембраны более проницаемыми [66, 67].
Врожденные и адаптивные иммунные реакции против HD-Ad векторов являются еще одной проблемой для доставки генов (рис. 2). Врожденный иммунитет - это универсальный и консервативный защитный механизм хозяина [68]. Важными участниками являются эпителиальные клетки дыхательных путей и фагоцитирующие клетки, такие как макрофаги, которые экспрессируют рецепторы распознавания паттернов (Pattern Recognition Receptors (PRR)), такие как Toll-подобные рецепторы (TLR), на своей клеточной поверхности [69]. PRR распознают и связывают консервативные несамостоятельные (non-self ) молекулы микробов, называемые Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMP)? которые



Fig. 2 Host immune responses to adenoviral vectors. (Left side) Innate immune responses. Innate immune responses to adenoviral vectors are triggered through the recognition of adenoviral pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), including viral capsid proteins and viral nucleic acids, by pattern recognition receptors (PRRs). PPRs involved in recognition of adenoviral PAMPS include Toll-like receptors (TLRs), such as TLR4 which interacts with viral capsid proteins at the cell surface and TLR9 which recognizes viral DNA in endosomes, and cytosolic retinoic acid-inducible gene I (RIG-I) receptor. TLR4 triggers an intracellular signaling pathway mediated by proteins including myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88), TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6), IL-1 receptor-associated kinase (IRAK). This activates nuclear factor-?B (NF-?B) through a kinase IKK (I-kB kinase) and interferon (IFN) regulatory factors, such as IRF3 and IRF7, resulting in expression of cytokines and chemokines, including type I IFNs. TLR9 recognizes viral dsDNA in the endosome converging the signal to the same pathway. RIG-I recognizes viral RNA 1 and 2 (VAI/II) transcribed by RNA polymerase III and channel the information to the same pathway through IKK. In addition, another class of PRRs, nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors (NLRs), NOD2 and NALP3, recognizes dsDNA in the cytosol and activates the inflammasome leading to the upregulation of the same pathways. Finally, the cyclic GMP-AMP synthase/ stimulator of IFN genes (cGAS/STING) pathway can also recognize cytosolic viral DNA also leading to the upregulation of the same pathway. As HD-Ad does not contain viral coding sequences, it will not produce viral RNAs. (Right side) Adaptive immune responses. T cells recognize antigen presented on major histocompatibility complex (MHC) by antigen presenting cells (APCs), commonly dendritic cells. CD4?+?T cells produce cytokines and activate CD8?+?T cells and B cells. CD8?+?T cells kill infected cells via ADCC. Some T cells become memory T cells, which can be quickly converted into a large number of effector T cells upon re-exposure to the same antigens. B cells recognize antigen via the B cell receptor (BCR) and can be activated with or without the help of T cells. Activated B cells differentiate into plasma cells which produce antibodies, and memory B cells which have a longer life span and help mount a rapid adaptive immune response. The part of the innate immune response is adapted from "Immunology of Adenoviral Vectors in Cancer Therapy. Molecular therapy" by Shaw AR, Suzuki M, 2019, Mol Ther Methods Clin 15:418-429 [68]

активируют различные пути, приводящие к выработке и высвобождению воспалительных цитокинов. Одним из наиболее изученных воспалительных путей является путь Nuclear Factor-κB (NFκB). NFκB - это группа транскрипционных факторов, которые при активации способствуют транскрипции провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, IL-6, IFNγ и TNFα [70, 71]. Повышенный уровень этих цитокинов наблюдался как у мышей дикого типа, так и у иммунодефицитных мышей при воздействии Ad-векторов, что свидетельствует о важной роли врожденного иммунитета [72]. Кроме того, у людей обычно обнаруживаются предсуществующие антитела против Ad-векторов, хотя нейтрализация доставленных вирусных векторов не является серьезной проблемой [73].
Проблемы иммунитета хозяина могут быть решены в двух направлениях, вектора и хозяина [74]. Модификация вектора - это первое направление. Например, HD-Ad был разработан для смягчения иммунных реакций хозяина путем удаления всех вирусных кодирующих последовательностей. Это не только уменьшает воспалительные реакции и повышает эффективность трансдукции, но и увеличивает емкость переноса ДНК до 30 кб [75]. Стоит отметить, что превосходство HD-Ad векторов над обычными Ad векторами не полностью признано сообществом генотерапии. Тем не менее, HD-Ad векторы по-прежнему содержат капсидные белки, которые могут быть обнаружены иммунной системой хозяина. Другим признанным подходом является маскировка антигенных эпитопов на вирусной капсиде синтетическими полимерами, такими как Polyethylene Glycol (PEG) [76, 77]. Кроме того, поскольку масштаб иммунной реакции зависит от дозы, простое снижение дозы вектора может уменьшить воспаление.
В отношении хозяина распространенной стратегией является преходящая иммуносупрессия [78]. Seregin et al. 2009 показали дозо-зависимое снижение высвобождения цитокинов при добавлении дексаметазона (DEX) [78]. DEX, глюкокортикоид, связывает глюкокортикоидные рецепторы (GR) на плазматических мембранах; это связывание вызывает транслокацию GR в ядро, где он блокирует транскрипцию способствующих воспалению генов. Циклофосфамид, алкилирующий агент, также может быть использован для подавления иммунных реакций [79]. Наша группа наблюдала значительное улучшение экспрессии трансгенов из повторно используемых векторов в дыхательных путях мышей благодаря предварительной обработке хозяина циклофосфамидом [80, 81]. Кроме того, селективные ингибиторы путей воспалительного ответа могут ослаблять иммунные реакции. Например, фенетиловый эфир кофейной кислоты (Caffeic Acid Phenethyl Ester (CAPE)) блокирует ядерную транслокацию NFκB [82]. Также сообщалось, что различные олигодезоксирибонуклеотиды (ODN) обладают ингибирующей активностью в отношении рецепторов TLR [83]. Помимо иммуно-супрессивных препаратов, неинвазивные методы доставки также могут минимизировать стресс у пациентов. Небулизация - доставка терапевтических векторов в виде вдыхаемого тумана - использовалась в клинических испытаниях генотерапии для вирусных и невирусных векторов [16, 84].

Summary


Недавние успехи в разработке инструментов редактирования генов дают новую надежду на генную терапию легких. Легкие являются иммуночувствительным органом, и маловероятно, что доставка генов в дыхательные пути может осуществляться многократно. CRISPR-опосредованная устойчивая генная коррекция стволовых клеток и клеток-предшественников дыхательных путей имеет большой потенциал, чтобы принести клиническую пользу пациентам (рис. 3). Однако, прежде чем реализовать потенциал этой технологии, необходимо преодолеть основные проблемы, о которых говорилось выше. Учитывая имеющиеся стратегии, обсуждаемые проблемы не являются непреодолимыми. Наши основные усилия должны быть направлены на практические критические области, а не на то, что кажется важным. В настоящее время мы считаем, что доставка in vivo и эффективность целенаправленного воздействия являются наиболее важными для продвижения вперед. Мы считаем, что HD-Ad векторы будут играть важную роль в клиническом успехе CRISPR-опосредованной генотерапии легких .



Fig. 3 Schematic illustration of permanent correction of CFTR mutations in CF airway epithelia. (Left panel) HD-Ad vector particles carrying the Cas9/sgRNA genes and donor DNA with homology arms are delivered into airway epithelial cells, including airway basal stem cells. (Middle panel) Following the vector genome reach the nuclei of target cells, the Cas9 and its corresponding sgRNA are expressed and they work together to generate a double-stranded DNA break at the target site where the donor DNA integrates through homologous DNA strand exchanges at both left and right homology arms. If the donor DNA integration does not happen in a cell, the break is repaired through non-homologous end joining. (Right panel) The donor DNA integration compromises the vector genome integrity, leading the degradation of the rest of the vector genome and thus eliminating the undesirable expression of the Cas9 protein. While the terminally differentiated epithelial cells are eventually replaced, the permanently gene-corrected basal stem cells will be differentiated into other epithelial cells, thus perpetuating the therapeutic effects of gene correction