Вмешательство в развитие плода заключается в расширенном репертуаре стратегий воздействия, включая хирургию плода, fetoscopic вмешательство, трансплантации стволовых клеток и in utero gene therapy (IUGT). Хирургия плода и рассматривание плода (fetoscopic) с целью коррекции анатомических дефектов и хотя эти техники также использованы для IUGT, они остаются вне пределов рассмотрения. Кроме того, in utero трансплантации стволовых клеток, особенно трансплантации hematopoietic stem cell (HSC) являются хорошо изученными терапевтическими приемами, но здесь не будут обсуждаться основательно. Целью обзора будет генотерапия болезней in utero.

Успехи в области Молекулярной Биологии и Медицины Материнского Плода привели к улучшению характеристик и выявлению болезней, вызываемых мутациями, их пренатальной детекции и диагностике. Сегодня клиницисты обладают несколькими диагностическими техниками с целью пренатальной диагностики, включая chorionic villous sampling (CVS), amniocentesis и детекцию неклеточной ДНК плода в сыворотке матери. Стал возможен первоначально скрининг, CVS или амниоцентез, при беременности с повышенным риском генетических нарушений плода; однако, оба эти теста рассматривались как инвазивные и несли риск потери беременности приблизительно 1 на 455 - 900 беременностей (1). В то время как для детекции анеуплоидии первоначально прибегали к кариотипированию, разработка анализа хромосомного микромассива (microarray) повысила разрешение и количество болезней, способных быть выявленными пренатально (2). При прямом сравнении анализа хромосомного микромассива дало 6% увеличение результатов диагностики по сравнению с кариотипированием в случае плодных аномалий, выявляемых с помощью ультразвука (3). С 2011, скрининг внеклеточной ДНК стал комерчески доступен и снизил использование диагностических процедур. До 10% циркулирующей в крови матери ДНК, происходит из плаценты плода, поэтому скрининг внеклеточной ДНК использует амплификацию и анализирует последовательности мишени (4). Профессиональное сообщество предостерегает, однако, что скрининг внеклеточной ДНК остается инструментом скрининга и не должен замещать подтверждающее диагностическое тестирование (5). С появлением секвенирования генома наша способность обнаруживать болезни in utero повысилась по скорости и чувствительности (4,6). Однако, секвенирование всего экзома затруднено в клинической практике в случает отсутствия специфических показаний перед секвенированием или из-за ложно-положительных находок, низкого диагностического результата, высокой цены и выявления вариаций неизвестного значения (7).

Сегодня, когда генетические болезни могут быть диагностированы у плода, IUGT становится рациональной терапевтической стратегией для моногенных болезней. Под прикрытием IUGT оказываются технологии, которые замещают или репарируют болезни, вызываемые мутациями, чтобы обеспечить развитии плода с помощью функционального генного продукта. Примером болезней кандидатов являются lysosomal storage disorders (LSD), hemoglobinopathies, spinal muscular atrophy (SMA), синдром Дауна и кистозный фиброз.

LSD составляют большую группу болезней, которые затрагивают метаболизм лизосом (8). Каждая отдельная болезнь редкая, но в целом они дают распространенность от 1 на 7700 до 1 на 5000 родов (8,9). Поскольку каждая LSD является результатом уникальной мутации в разных генах, н токсических метаболитов в лизосомах клеток. Обусловленные этими болезнями воздействия на развивающийся головной мозг побуждают к рациональному использованию терапии прежде, чем возникнет устойчивое неврологическое повреждение. Замещение отсутствующих ферментов при таких болезненных процессах может быть ограничено за счет иммунных реакций после рождения. Поэтому IUGT предоставляет уникальную возможность лечения таких индивидов in utero , чтобы развить толерантность к отсутствующему энзиму.

Гемоглобинопатии (серповидно-клеточная болезнь и талассемия) представляют собой спектр вызывающих анемию нарушений, пригодных для IUGT благодаря их распространенности и болезненных проявлений. Серповидно-клеточная болезнь наиболее распространенное генетическое заболевание в США и затрагивает миллионы во всем мире, приводя к снижению продолжительности жизни и дисфункции многих систем органов в результате в результате vaso-occlusive кризов (10). Талассемия вызывается мутациями, которые менее распространены в США чем за границей и может обнаруживаться как вариант до 5% в мировой популяции, затрагивая клинически до 70000 детей ежегодно (11). Кульминацией является анемия плода, а в наиболее тяжелых случаях многоводие (fetal hydrops), опасное для жизни плода. Alpha thalassemia major часто является фатальной in utero в отсутствие лечения переливаниями крови (12). Beta thalassemia проявляется в виде спектра тяжести минимальной, промежуточной и максимальной. Сотни мутаций были идентифицированы в гене β-globin, которые вызывают потерю им функции. Эти болезни окзывают вредные эффекты на рост и развитие плода, которые могут быть необратимыми. Пациенты с серповидно-клеточной болезнью, alpha и beta талассемией, которые доживают до рождения, обычно требуют лечения в течение всей жизни и обнаруживают осложнения, такие как избыток железа и реакции на переливания (13). Проводится клиническое испытание с использованием in utero трансплантаций стволовых клеток для alpha-thalassemia, т.к. это может устранить повреждения, вызываемые болезнью in utero и вызвать толерантность к постнатальному введению стволовых клеток, однако, ниша в виде костного мозга плода остается очень конкурентноспособной и трудно получать адекватные уровни приживления (14). IUGT для гемоглобинопатий является привлекательной, поскольку мутантные гены в HSCs могут быть откорректированы in situ без необходимости конкуренции за нишу для клеток костного мозга. В частности, ген BCL11A выступает в качестве единственной мишени для генотерапии, чтобы в принципе улучшить состояние пациентов, страдающих от гемоглобинопатий, он затрагивает beta субъединицу гемоглобина (15). Используя эту стратегию, исследователи оказались способны подавить экспрессию BCL11A с тем, чтобы активировать экспрессию плодного гемоглобина у модельных животных, предоставив тем самым доказательства существование возможности переноса в клинику (16). Следует отметить, что alpha талассемия обычно вызывается крупной генетической делецией и наиболее подходящая для клеточной терапии, чем для IUGT. Однако, серповидно-клеточная болезнь и большинство вариантов beta талассемии, которые обычно обусловлены одиночными точковыми мутациями, подходят для IUGT , как это было продемонстрировано на преклинических исследованиях животных, где редактирование генов in utero привело к достоверной постнатальной коррекции анемии.

SMA это болезнь, которая характеризуется дегенерацией alpha двигательных нейронов, в результате чего возникает прогрессирующая слабость, паралич и в конечном итоге смерть из-за дыхательной недостаточности. Идентифицирован одно из основных нарушений при этой болезни - это белок SMN, кодируемый геном SMN (17). Благодаря своим вредным эффектам на пациентов после рождения, промежуток времени, подходящий для терапии, приходится на ранний период постнатальной жизни с потенциальным расширением на пренатальный период жизни. Несколько терапевтических подходов разрабатываются, включая доставку генотерапии посредством вирусных векторов на мышиных моделях SMA. IUGT оказывается привлекательным способом для дальнейших исследований (18-20).

Синдром Дауна или Trisomy 21, наиболее распространенная трисомия, возникающая у детей с распространенностью 6.7 на 10000 индивидов. Дети, рождающиеся с синдромом Дауна страдают от спектра нарушений с варьирующей степенью нарушений нейрального развития, сердечно-сосудистых и скелетно-мышечных нарушений (21). Эти эффекты возникают в раннем развитии и вызывают болезненность в течение всей жизни, что делает привлекательной IUGT. Мышиные модели синдрома Дауна позволили исследователям выявить гены, такие как DYRK1A и их роль для нервного развития (22). Исследователи целенаправленно воздействовали на DYRK1A in utero, используя аденовирусные векторы, чтобы подавить экспрессию гена, это позволило частично восстановить нервное развитие у мышей. Хотя эти результаты многообещающие, но клинические испытания с синдромом Дауна были сконцентрированы на изменении среды нейротрансмиттеров в головном мозге с помощью фармакологических средств.

Муковисцидоз (Cystic fibrosis) является моногенным нарушением, которое проявляется в виде мультисистемной болезни в результате мутаций в гене cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Мутации в гене CFTR, который кодирует хлористый канал, приводят к накоплению густой, обезвоженной слизи и закупорке проводящих дыхательных путей легких, просвета кишечника, протоков поджелудочной железы. Принимая во внимание почти 20% долю кишечной непроходимости при рождении в виде меконевой непроходимости кишечника и почти 80% долю поджелудочной недостаточности при рождении, предупреждение этих нарушений in utero кажется логичным и желательным подходом (23). В отличие от гемоглобинопатий, где HSCs, вводимые системно, прицельно занимали ниши в костном мозге , при муковисцидозе лечение таким способом невозможно, поскольку одиночные откорректированные HSCs не интегрировались и не функционировали в легких, кишечнике и поджелудочной железе. Системные IUGT являются привлекательными, поскольку могут корректировать мутации, вызывающие болезнь, в соотв. тканях in situ до появления повреждений у плода.

Генотерапия может быть грубо подразделена на стратегию замещения гена и редактирования генов. Замещение генов концентрируется на замещении дефектной или отсутствующей копии гена обычно с использованием вирусных векторов. Эти вирусные векторы могут оставаться эписомными для временной экспрессии генов или интегрироваться в геном хозяина, обеспечивая устойчивую терапию (Figure 1) (24). Использование вирусных векторов при постнатальном лечении ограничено вторичными иммунологическими реакциями. Редактирование генов концентрируется на доставке корректной ДНК матрицы и использовании эндогенных или экзогенных клеточных систем для репарации неправильных копий гена, чтобы восстановить функцию. Этот подход пригоден для делеций короткого сегмента, инсерций и мутаций в виде полиморфизма одиночного нуклеотида.

Figure 1 Lentiviral transduction of cells resulting in either episomal expression or integration into the host genome.

По сравнению с постнатальной генотерапией время IUGT обладает несколькими четкими преимуществами в отношении целенаправленно действующих онтогенетических компонентов на болезненные процессы, это состояние пониженного иммунитета плода и доступ к популяциям стволовых клеток. Для болезней с онтогенетическими компонентами прежде фенотипического проявления болезни (как описано выше для LSD, некоторых гемоглобинопатий и муковисцидоза), генная терапия и коррекция д. оказывать эффект до начала необратимых повреждений развивающегося плода (25). Гипо-иммунное состояние плода важно при использовании аденовирусных векторов и adeno-associated viral (AAV) векторов для постнатального лечения мышечной дистрофии Дюшена, обнаруживающей токсичность, связанную с иммунной реакцией (26). Первые постнатальные клинические испытания на людях AAV векторов также отметили возникновение реакций как врожденного, так и благоприобретенного иммунитета (27,28). Были разработаны некоторые стратегии для ослабления подобной иммунной реакции. Изменения состава капсид, негативной селекции и способов доставки повышали эффективность AAV векторов, несмотря на иммунную систему хозяина (29). Однако, сдвиг графика воздействия in utero может обходить необходимость в этих стратегиях, как подтверждают доказательства в зарождающейся иммунной системе плода возникает толерантность к трансдуцирующим материалам (25,30-34). Мышиные модели подтверждают это утверждение наблюдаемым увеличением приживляемости HSC у иммуно-дефицитных мышей (25,35,36).

Ещё одним преимуществом IUGT является возможность доступа к специальным популяциям клеточно-специфических стволовых клеток, которые часто зарождаются до или недоступны постнатально (37). Чтобы осуществить устойчивую экспрессию, IUGT делает возможным доступ к популяциям стволовых клеток в развивающемся плоде, которые обычно недоступны во время постнатальной жизни. Потомство этих стволовых клеток быстро делится in utero и делает возможной генотерапию, обеспечивая долговременный положительный результат. Один из аспектов, который контролирует специфичность IUGT, - это состав и химия вектора. Разные векторы обладают разным тропизмом к определенным клеточным популяциям и тканям (25). Благодаря анатомическим свойствам и массивной миграции и пролиферации популяций стволовых клеток плода, эти клетки оказываются более чувствительными к IUGT, чего довольно затруднительно достичь после родов (38,39). Преимуществом IUGT также является малый размер плода, так что можно воздействовать эффективными дозами на каждую из стволовых клеток, что драматически улучшает эффективность (40).

Доставка реагентов (компонентов) генотерапии в плод возможна с технической точки зрения как у животных моделей, так и в клинике. Параллельно с нашей способностью обнаруживать генетические аномалии, продвинулась и наша способность осуществлять воздействия in utero. С появлением высокого качества ультразвуковой и технической экспертизы, доставка IUGT стала более точной (25,40). Endo et al. описали введение в амнион в качестве приемлемого способа доставки генотерапии, целенаправленного воздействия на популяции стволовых клеток в глазах и коже мышей и крупных животных (41,42). Прямые внутримышечные и внутрибрюшинные инъекции также продемонстрировали эффективность доставки IUGT с долговременной экспрессией трансгена (43,44). Напротив, внутрисосудистые инъекции в маточные сосуды, портальные сосуды или сосуды желточного мешка также продемонстрировали эффективность системной доставки вирусных векторов и реагентов редактирования генов на животных моделях (30,32,40,45). При переходе на людей под контролем ультразвука стал возможен доступ к пупочной вене, такая трансфузия плода облегчила системный доступ к IUGT (46).

Мы предоставили следующие статьи в соответствии со списком Narrative Review (available at http://dx.doi.org/10.21037/tp-20-89).