Митохондрии, как своего рода полуавтономные органеллы, широко распространены в эукариотических клетках, которые являются основным местом аэробного дыхания. Они обеспечивают энергию для жизнедеятельности клетки через электронно-транспортную цепь и систему окислительного фосфорилирования. Между тем, митохондрии участвуют в цикле Кребса, окислении, синтезе липидов и холестерина и других важных метаболических путях [1]. Они также участвуют в апоптозе и производстве свободных радикалов кислорода [2-4].

Митохондрии имеют свой независимый геном, отличный от ядерного генома, который в значительной степени похож на геном бактерий. Митохондриальная ДНК (мтДНК) является важной частью генома [5]. Секвенирование митохондриальной ДНК показало, что две нити мтДНК человека разделены на тяжелую и легкую цепи, которые содержат 16 569 пар оснований, кодирующих 2 рРНК, 22 тРНК и 13 белковых субъединиц [5-8]. Митохондриальные белки (кодируемые митохондриальной ДНК) различаются у разных видов и тканей. Транскрипция и трансляция мтДНК полностью контролируются кодируемыми факторами ядерной ДНК посредством связывания с уникальной некодирующей областью (в 1 кб D-петлёй) митохондриального генома [7]. Пептиды, синтезируемые 13 генами мтДНК, взаимодействуют с более чем 60 кодируемыми в ядре пептидами, образуя митохондриальную дыхательную цепь, которая необходима для аэробного метаболизма клетки [9]. Таким образом, функция митохондрий зависит от взаимодействия ядерных и митохондриальных генов. Любая аномалия ядерного или митохондриального генома может привести к митохондриальным заболеваниям.

Наследственные митохондриальные заболевания характеризуются дефектами окислительного фосфорилирования, которые вызваны мутациями в генах nuclear DNA (nDNA) и мтДНК, кодирующих структурные митохондриальные белки или белки, участвующие в функции митохондрий [4], [10], [11]. Это наиболее распространенные генетические нарушения обмена веществ и одна из самых распространенных форм генетических нервных нарушений [12]. Хотя митохондриальный геном невелик, мтДНК является существенной причиной генетических заболеваний. Когда гетероплазмия, то есть сосуществование мутантной мтДНК и мтДНК дикого типа, достигает порогового уровня, появляются определенные митохондриальные заболевания [13]. В последние годы, с дальнейшим изучением мтДНК, было установлено, что митохондриальные гены тесно связаны с некоторыми заболеваниями человека, такими как синдром Лея (Leigh ) [14-16], NARP syndrome (Neuron, Ataxia, and Retinitis Pigmentosa) [17], [18] и LHON (Leber Hereditary Optic Neuropathy) [19], [20]. В настоящее время достигнут значительный прогресс в понимании основ митохондриальной генетики и связи между мутациями генов и фенотипами заболеваний, а также в выявлении приобретенных мутаций мтДНК при старении и раке (табл. 1). На сегодняшний день некоторые мутации митохондриальных генов и связанные с ними митохондриальные заболевания все еще не имеют реальных и эффективных методов лечения. С развитием технологий редактирования генов появляется перспектива устранения



Table 1. Mitochondrial DNA Base Substitution Diseases: Coding and Control Region Point Mutations with confirmed Status (https://www.mitomap.org/foswiki/bin/view/MITOMAP/MutationsCodingControlCfrm).

Митохондрии, имеющие бислойную структуру мембраны, включают в себя два компартмента - межмембранное пространство (IMS) и матрикс [21]. Их функционирование зависит от сборки около 1000 резидентных белков, 99% которых синтезируются в цитоплазме в виде белков-предшественников и переносятся в четыре различных участка митохондрий с помощью транслокационных комплексов [22]. К настоящему времени проведено много исследований механизма проникновения белков через митохондриальную мембрану. Белки-предшественники сначала синтезируются в цитоплазме с информацией о цели их действия, они могут быть распознаны специфическим рецепторным белком на внешней мембране митохондрий [23]. Около 60% этих белков несут расщепляемые сигналы целенаправленного действия, которые после введения удаляются пептидазой митохондриального процессинга [23]. Другие митохондриальные белки содержат различные типы неудаляемых сигналов целенаправленного действия, например, нацеленные на трансмембранные сегменты [23]. Процесс проникновения предшественников в матрикс через двуслойную мембрану включает три внутренних белковых комплекса, которые обеспечивают мембранную транслокацию и сортировку белков-предшественников [24]. Общая входная пора внешней мембраны формируется комплексом TOM, который отвечает за первоначальную транслокацию более 90% белков-предшественников митохондрий из цитоплазмы в мембранное пространство [25]. TOM40 является стержневым белком, который формирует центр канала. Другие белки TOM, такие как TOM20 и TOM70, помогают в распознавании сигналов нацеливания [25], [26], [27]. Различные белки TOM взаимодействуют друг с другом для поддержания стабильности и функции комплекса TOM [25], [26]. Тем не менее, механизм, лежащий в основе его посредничества, до сих пор неясен, а структура канала до конца не определена [25]. Кроме того, было доказано, что многочисленные цитоплазматические шапероны, такие как белок теплового шока 70 (HSP70), неспецифически соединяют митохондриальные белки-предшественники для предотвращения неправильной укладки и агрегации перед транслокацией [21], [23], [27]. Сообщается, что большое количество цитоплазматических факторов также способствуют транспорту белков-предшественников в митохондрии, что является ключом к целенаправленной доставке митохондриальных белков-предшественников [21], [23], [27]. Комплекс TIM, в основном опосредованный TIM23, принимает участие в транспорте белков в матрикс [21], [23], [27]. Недавнее исследование выявило новый путь целенаправленного воздействия, названный ER-SURF, обнаружив, что поверхность эндоплазматического ретикулума (ER) также играет важную и положительную роль в нацеливании рибосом на митохондрии. Однако детали этого пути еще предстоит выяснить [21], [23].

Трансплантация в митохондрии, новое терапевтическое вмешательство для лечения митохондриальных заболеваний, является простым и быстрым [28]. Однако для поддержания долгосрочного терапевтического эффекта трансплантацию митохондрий необходимо проводить многократно, а методы выделения митохондрий, источники митохондрий, способ введения и дозы влияют на эффективность трансплантации митохондрий [29]. В ряде исследований был сделан вывод, что после трансплантации митохондрий возникает иммунный ответ, поэтому создание метода, позволяющего хранить митохондрии в течение длительного времени, является жизненно важным вопросом [29]. Кроме того, учитывая, что возникновение митохондриальных заболеваний в основном связано с мутациями мтДНК до определенного уровня, что приводит к функциональным нарушениям, технология редактирования генов, направленная конкретно на митохондриальные гены, станет потенциальным подходом к лечению митохондриальных заболеваний. Этот метод может уменьшить долю мутантной мтДНК путем модификации мутировавшего митохондриального гена, что поможет решить проблему митохондриальных заболеваний (рис. 1). В долгосрочной перспективе, по сравнению с трансплантацией митохондрий, технология редактирования митохондриального гена имеет значительные перспективы применения. В настоящее время основными методами редактирования митохондриальных генов являются следующие (технология restriction endonucleases (RE), технология нуклеазы цинковых пальцев (ZFN), технология нуклеазы транскрипционного активатора типа эффектора (ALEN) и система CRISPR/Cas9) (рис. 2A,B,C, табл. 2, табл. 3).



Fig. 1. Graphical summary of gene editing system delivery into the mitochondria. Protein or RNA component can be imported through lentivirus transfection and nuclear genome expression while modified by MTS or RP-Loop. DNA component can be imported through liposome transfection or other methods. The blue-color mitochondria stand for mitochondria containing mutated mtDNA (target site of gene editing system) while the yellow-color mitochondria stand for wild-type mitochondria. (RE:Restriction endonuclease; ZFN:Zinc Finger Nuclease; TALEN:Transcription Activator-Like Effectors Nuclease; CRISPR:Clustered regularly interspaced short palindromic repeats; pAgo:prokaryotic Argonaute proteins). (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)



Fig. 2. Several methods of gene editing. (A) Graphical abstract of the mechanism of ZFN. (B) Graphical abstract of the mechanism of TALEN. (C) Graphical abstract of the mechanism of CRISPR/Cas9 and CRISPR/Cas12 system. (D) Graphic abstract of the mechanism of pAgo-based system, taking TtAgo(DNA-guide) and RsAgo(RNA-guide) as examples.

Table 2. Comparison of several gene editing methods.

Restriction endonuclease (RE) предназначена для распознавания и присоединения к специфическим последовательностям нуклеотидов ДНК, а затем разрезания фосфодиэфирной связи на определенном участке каждой нити ДНК. Преимуществами RE являются высокая точность распознавания, высокая эффективность разрезания и способность разрезать определенные участки. Однако она также имеет некоторые ограничения. Например, она может идентифицировать только ограниченное число последовательностей нуклеиновых кислот и не может быть создана искусственно [30].

Преимуществом RE является простой процесс работы, и она впервые была применена для редактирования митохондриального гена [31]. Рестрикционная эндонуклеаза SmaI, модифицированная дополнительными mitochondrial targeting signals (MTS), может быть перенесена в митохондрии после экспрессии в ядре, значительно снижая долю мутировавшей мтДНК. Кроме того, рестрикционная эндонуклеаза ApaLI, модифицированная по MTS и по 5' и 3' UTR последовательностям ATP5b, веденная в ооциты и одноклеточные эмбрионы также существенно снижала долю мтДНК BALB [32].Эти результаты показывают, что доставка искусственно созданного гена эндонуклеазы соответствующему пациенту является перспективной в снижении доли мутаций мтДНК в зависимости от распознавания RE. Однако RE распознает только ограниченные последовательности и не может удовлетворить потребности в восстановлении огромных мутаций митохондриальных генов, что сдерживает применение этой технологии редактирования генов в митохондриях.

ZFN состоит из двух частей: ДНК-связывающего домена с цинковыми пальчиками, который отвечает за распознавание специфической последовательности ДНК, и домена рестрикционной нуклеазы FokI, которая обеспечивает разрезание ДНК и производит вставку фрагментов или мутации со сдвигом рамки считывания в ген-мишень посредством механизм репарации повреждений ДНК. ДНК-связывающий домен цинковые пальчики состоит из трех групп цинк-пальцевых белков, каждая из которых включает около 30 аминокислот, соединенных с одним атомом цинка и связанных с 3 п.н. ДНК. Следует отметить, что домен разрезания является неспецифическим и выполняет свою функцию только тогда, когда существует в виде димера, что требует конструирования как 5' в 3' так и 3' в 5' домены [33]. Технология ZFN для ДНК регулярно используется для конструирования ядерных геномов с целью добавления, изменения или уничтожения генов [34], [35].

До настоящего времени технология ZFN применялась для редактирования митохондриальных генов. MTS и nuclear export signal (NES) используются для того, чтобы помочь белку ZFN нацелиться на митохондрии, в некоторой степени снижая цитотоксичность, вызванную повреждением ядерных генов [36-39], и сконструирована пара мономеров, нацеленных на мтДНК - один из которых связывается с последовательностью дикого типа, а другая связывающая последовательность содержит сайт мутации. Гомологичные димеры из нуклеиновых кислот фермента FokI могут разрезать мтДНК и производить линейную ДНК. Из-за отсутствия пути восстановления посредством негомологичного соединения концов (NHEJ) при двухцепочечных разрывах ДНК в митохондриях, поврежденная ДНК деградирует [40]. Однако этот метод менее эффективен и легко может действовать вне мишени. Впоследствии был разработан одноцепочечный белок ZFN с двойным FokI, который обладает более высокой точностью и эффективностью, упрощая процесс. Однако дальнейшие исследования показали, что одноцепочечный белок ZFN с двойным FokI также имеет различные ограничения, такие как невозможность выявления мутаций с делецией длинных фрагментов, таких как широко распространенные делеции (CD). Между тем, отсутствие рестрикционного димера позволяет этому одноцепочечному белку ZFN сохранять активированную нуклеазную активность, которая может обладать потенциальной цитотоксичностью [38]. Gammage et al. попытались усовершенствовать традиционный димерный ZFN [38]. Они использовали гетерологичные, а не гомологичные димеры, чтобы уменьшить вероятность смещения мишени, и изменили порядок расположения NES, белка-метки и ДНК-связывающих белков, чтобы уменьшить взаимные помехи между различными компонентами и тем самым повысить стабильность. Этот метод действительно успешно увеличил долю мтДНК дикого типа в пять раз, что выше, чем эффективность одиночного белка ZFN с двойным редактированием FokI (доля мтДНК дикого типа увеличилась в два раза). Это также позволяет инструменту определять CD - два мономера, предназначенные для идентификации последовательностей дикого типа с каждой стороны делеционной последовательности. Когда происходят делеционные мутации, гетеродимер FokI находится достаточно близко, чтобы осуществлять нуклеазную активность.

Из-за чрезвычайно высокой потребности в митохондриях в мышцах, клетках мозга и специфических симптомов, появляющихся при достижении определенной доли мутации митохондриальных генов, таких как двигательные расстройства, пигментный ретинит, для дальнейших экспериментов выбираются клеточные модели, содержащие мутации митохондрий, связанные с этими заболеваниями [36]. После нокаута с помощью mtZFN доля мутировавших генов в митохондриях значительно уменьшилась, что дало надежду на генотерапию митохондриальных заболеваний. Однако, в то же время, количество нормальных генов, а не мутировавших митохондриальных генов, также частично уменьшилось. Кроме того, использование mtZFN в клетках с высоким уровнем мутации митохондриальных генов может привести к значительному уменьшению количества митохондрий, что может вызвать гибель клетки [41]. Поэтому они попытались снизить эффективность нокаута и использовать повторяющиеся стратегии нокаута. Они также пытались использовать рибозимы в форме головки молотка (HHR) для контроля уровня экспрессии mtZFN. Помимо доказательства на генетическом уровне, нокаут мутантного гена был также проверен на уровне органелл и клеток, прт этом производительность АТФ и энергетический заряд были улучшены в определенной степени после модификации mtZFN. Количество лимонной кислоты и аконитовой кислоты, которые являются двумя важными продуктами митохондриального метаболизма, также увеличилось, что еще раз подтверждает эффективность mtZFN [42].

Для того чтобы еще раз убедиться в целесообразности применения mtZFN, были проведены исследования in vivo [36]. Для эксперимента была выбрана модель мышей с мутантными сердечными миоцитами по m.5024C>T тРНК (Ala) [36]. После внутривенного введения в хвост ассоциированного вируса в клетках сердца была подтверждена экспрессия mtZFN, уровень пировиноградной и аспаргиновой кислот повысился, а уровень молочной кислоты снизился [36]. Это показало, что соотношение продукции митохондриальной дыхательной энергии увеличилось в энергообеспечении клеток, в то время как вклад гликолитического пути уменьшился, тем самым доказав действенность mtZFN in vivo [36].

Однако mtZFN имеет довольно низкую эффективность редактирования, а итеративная стратегия редактирования занимает много времени, так что на однократное проведение mtZFN может уйти около недели. Кроме того, каждый из белков группы цинковых пальцев, включает около 30 аминокислот, соединенных с одним атомом цинка, связывается с 3 п.н. ДНК, что может вызвать потенциальную неточность.

TALEN - это метод целенаправленного манипулирования генами, происходит из патогенных бактерий растений. Аминокислотная последовательность ДНК-связывающего домена в белке TAL, полученном из растительной бактерии Xanthomonas sp, имеет сильное соответствие с последовательностью нуклеиновыъх кислот сайта мишени [43]. Один модуль распознает одно основание [44], что является простым и высокоспецифичным. Комбинируя различные модули, можно осуществлять целенаправленный нокаут или регуляцию экспрессии эндогенных генов на любой последовательности нуклеотидов [44]. На сегодняшний день этот метод успешно применяется у многих видов, таких как человек, крыса, мышь, свинья, овца, рыки данио, арабидопсис и дрожжи [43]. Его основной принцип примерно такой же, как у ZFN, он также состоит из распознающего домена и расщепляющего домена [44]. Домен расщепления также состоит из неспецифической нуклеазы FokI, которая влияет только на образование димеров [43]. Однако домен распознавания ДНК отличается, он состоит из последовательно расположенных белков TAL (обычно около 20) [44]. Каждый белок TAL распознает и связывается с соответствующим основанием, что обеспечивает его более высокую специфичность [45].

Технология TALEN также использовалась для редактирования митохондриальных генов [46]. MTS супероксиддисмутазы (SOD) модифицирован на N-конце мономерного белка TALEN, так что связанные с TALEN белки могут быть отправлены в митохондрии для осуществления своего действия [46]. Поскольку фермент нуклеиновых кислот FokI оказывает свое действие только в виде димера, поэтому эта группа сфокусировалась на фрагменте, лишенном мутации в мтДНК. Они создали участки идентификации ДНК TALEN по обе стороны от отсутствующего фрагмента, так что когда происходит потеря фрагмента, FokI может быть достаточно близко, чтобы образовать димеры и оказывать режущий эффект нуклеазы. Это приводило к деградации мутировавшей мтДНК и трансформации в гетероплазмию c мтДНК дикого типа. Кроме того, мономерная белковая цепь TALEN предназначена для распознавания мутации m.5024C>T для достижения цели нокаута [47]. Кроме того, в последнем исследовании сообщалось, что два вида белков в TALEN могут быть заменены одним белком - компактным TALEN (cTALEN) [48]. Кроме того, мито-TALEN применяется для блокирования передачи митохондриальных заболеваний из поколения в поколение [32]. Мито-TALEN также используется для снижения уровня мутировавшей мтДНК человека, ответственной за LHON и NARP в ооцитах млекопитающих. Из-за особенностей наследования по материнской линии митохондрий и невозможности размножения на ранней стадии развития эмбриона, количество митохондрий в ооцитах значительно снижено, что влияет на имплантацию в матку. Таким образом, мито-TALEN дает новое представление о блокировании передачи митохондриальных заболеваний из поколения в поколение, избегая операционных сложностей и этических проблем, связанных с феноменом "ребенка от трех родителей" [49].

На основе технологии TALE, DddA (токсин А деаминазы двухцепочечной ДНК), который может катализировать превращение цитозина (C) в урацил (U) на двойной нити ДНК, но является токсичным для клеток млекопитающих, был разделен на две неактивные половины, названные split-DddA [50]. Они соединили split-DddA с белком TALE и ингибиторами урациловой гликозилазы, чтобы собрать свободный от РНК редактор цитозиновых оснований DddA (DdCBE), который катализирует превращение C-G в T-A в мтДНК человека, и доказали его высокую специфичность и точность редактирования [50]. Только когда два белка TALE соединяются с мтДНК, две расщепленные полумолекулы DddA вновь собираются вместе, восстанавливая активность каталитического редактирования оснований [50]. Примечательно, что использование UGI может защитить U от действия гликозилазы, так что он не будет распознан механизмом репарации повреждений ДНК, что приведет к его вырезанию из ДНК и замене на С [51]. Установлено, что добавление UGI повышает эффективность редактирования примерно в 8 раз [50]. Самое интересное, что система с MTS также может осуществлять точное редактирование мтДНК, предоставляя беспрецедентный инструмент для изучения митохондриальных генетических заболеваний [50], [52]. Кроме того, модель мутаций митохондриальной ДНК, связанных с заболеваниями в клетках человека, может быть успешно сконструирована с помощью этой системы [50]. Однако система DdCBE, основанная на DddA, может эффективно редактировать только основание C рядом с T в геноме, что вызывает большие ограничения [50].

ДНК-связывающий домен в белке TAL имеет соответствие один к одному с последовательностью нуклеиновой кислоты участка мишени, что обеспечивает высокую точность. Однако это также приводит к чрезмерному молекулярному весу мито-TALEN, что создает сильный барьер для упаковки вирусом, импорта в клетки и митохондрии.

Система Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)protein была первоначально обнаружена у бактерий и архей. Она представляет собой иммунную защитную систему, сформировавшуюся в ходе длительной эволюции для противостояния вторгающимся вирусам и другим вторжениям чужеродной ДНК [53], [54]. CRISPR состоит из множества коротких и консервативных областей повторяющихся последовательностей (повторов) и спейсерных областей (спейсеров) [45]. Повторы содержат палиндромную последовательность, которая может образовывать шпилечную структуру, а спейсеры являются особыми для захвата бактериями, чужеродные последовательности ДНК [54], [55]. Вышестоящая лидирующая последовательность считается промоторной последовательностью CRISPR [54], [55]. В верхней части последовательности существует полиморфное семейство генов Cas [54], [55]. При вторжении чужеродной ДНК белок Cas разрезает ее на короткие последовательности, а затем вставляет в качестве спейсеров между консервативными повторяющимися последовательностями, содержащими палиндромные последовательности, которые могут образовывать шпилечные структуры [54], [55]. Когда та же чужеродная ДНК вторгается снова, спейсер будет использоваться в качестве шаблона для транскрипции CRISPR РНК (crRNA), которая объединяется с трансактивирующей crRNA (tracrRNA), направляя Cas для разрезания вторгающейся чужеродной ДНК [45]. Следует отметить, что для идентификации конкретной последовательности и опосредованного расщепления также необходимо наличие протоспейсерного смежного мотива (PAM) после гомологичной последовательности, что ограничивает сайты, доступные для редактирования. Фактически, как инструмент редактирования генов, система CRISPR/CAS сама вызывает только двухцепочечные разрывы ДНК (DSB), а последующая репарация клеточной ДНК завершает редактирование генов в определенных местах, что включает негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологично направленную репарацию (HDR). NHEJ добавляет или удаляет несколько оснований в месте DSB во время репарации, тем самым вызывая в гене мутации со сдвигом рамки считывания, достигая цели нокаута гена, в то время как HDR обеспечивает безошибочную ДНК при наличии гомологичной донорской ДНК в качестве матрицы для репарации и вставки чужеродных фрагментов.

В соответствии с последовательностью и структурой белка Cas, система CRISPR/Cas подразделяется на три типа: I, II и III. Среди них наиболее широко используется система CRISPR/Cas второго типа, для которой требуется только один белок Cas, Cas9, благодаря способности Cas9 к совместному связыванию РНК, ДНК и огромному потенциалу трансформации [56]. В реальном использовании направляющая гид РНК (gRNA), которая включает необходимые структурные компоненты crRNA и tracrRNA, является более удобной и эффективной. Система CRISPR/Cas показала большой потенциал во многих областях применения, таких как редактирование генома, регуляция транскрипции, обнаружение вирусов и т.д. Было доказано, что система CRISPR/Cas9 может редактировать геномы млекопитающих, рыбок данио, мышей, плодовых мушек и других животных. Кроме того, каталитически дефектный Cas9 (dCas9) может связываться с доменом белка, который активирует или ингибирует транскрипцию, и может осуществлять точный и стабильный транскрипционный контроль генов мишеней под руководством gRNA [57]. Кроме того, технология SHERLOCK на основе CRISPR/Cas13 может эффективно обнаружить вирус и подходит для обнаружения нового коронавируса 2020 года [58].

Быстрый прогресс был достигнут при использовании системы CRISPR в редактировании ядерных генов. Однако для относительно небольших объектов, таких как мтДНК, работать с системой CRISPR Cas9 сложно. Более того, митохондрии не обладают способностью импортировать РНК, что не позволяет комплексу gRNA-Cas9 распознать целевую последовательность. Как ввести эту РНК в митохондрии и как обеспечить успешную ориентацию на мутировавший ген после конструирования gRNA? Все эти проблемы ограничивают возможность и эффективность применения системы CRISPR cas9 для редактирования митохондриальных генов.

В целом, TALEN превосходит ZFN, поскольку ему больше не нужно распознавать последовательности ДНК через триплеты оснований, а biunique распознавание обеспечивает более высокую специфичность и свободу в выборе целевых последовательностей. Кроме того, TALEN имеет преимущества благодаря более простым операциям и более короткому циклу. Наиболее важной частью редактирования генов является связывание ДНК. ZFN и TALEN используют белок в качестве проводника для достижения целевого редактирования, что требует сложного и трудоемкого преобразования белка, в то время как система CRISPR-Cas управляется gRNA, которая относительно дешева и проста в разработке и производстве. В области редактирования митохондриальных генов следует учитывать способность РНК и белка проникать через мембрану митохондрий, размер занимаемого пространства и возможность транспортировки в мембрану митохондрий.

Недавно был открыт новый тип системы CRISPR, система CRISPR-Cpf1 [59], которая была определена как второе поколение технологии редактирования генов [59]. Она заменяет белок Cas9 белком Cpf1, который не только обладает такой же эффективностью редактирования генома, как Cas9 [60], но и имеет больше преимуществ, чем Cas9. Для редактирования генов системе Cpf1 требуется всего одна РНК [59], и она может самостоятельно обрабатывать предшествующую precursor CRISPR-derived RNA (pre-crRNA), а затем целенаправленно находить и расщеплять ДНК с помощью преобразованной crRNA [61]. Фермент Cpf1 также меньше стандартного Cas9 и легче переносится в клетки и ткани [59]. При разрезании ДНК система Cpf1 образует липкий конец вместо плоского, что обеспечивает большую точность и меньший эффект вне мишени, хотя определенный эффект вне мишени в этой системе все же присутствует [60]. Кроме того, разрез Cpf1 находится далеко от сайта распознавания, что означает, что он все еще может оказывать влияние даже на изменение гена-мишени в месте расщепления, предоставляя множество возможностей для завершения редактирования [61]. Cpf1 может направлять РНК для одновременного редактирования нескольких генов или нескольких участков одного гена, повышая эффективность нокаута генов, что способствует одновременному редактированию многих белков при комбинированном скрининге [62]. Он еще больше расширяет диапазон выбора целевых сайтов редактирования генов, используя простую транспортную систему для управления эффекторный белок CRISPR и направляющую гид РНК [61], и её рассматривают как обладающую большим потенциалом для применения в генотерапии.

Хотя Cpf1 превосходит Cas9, он обладает меньшей активностью, а из-за относительной фиксации последовательности PAM выбор мишени ограничен [63]. Еще предстоит изучить, как повысить активность и расширить диапазон мишеней, чтобы добиться более широкого эффекта редактирования генов. Как новая технология редактирования генов, работа системы CRISPR-Cpf1 является более простой и точной, что также может обеспечить более эффективное редактирование небольших митохондриальных генов, но о применении этой технологии для редактирования митохондриальных генов пока не сообщалось. В будущем система CRISPR-Cpf1 может стать эффективным способом редактирования митохондриальных генов.

Впервые о том, что система CRISPR/cas9 успешно применяется для редактирования митохондриальных генов, было сообщено в 2015 году [70]. Однако полученные результаты оказались спорными и были поставлены под сомнение другой группой [71].

Во-первых, механизм внедрения gRNA в митохондрии остается неуловимым. Серия из 20 рибонуклеотидов stem ring, происходящих из РНК H1 (компонент РНК фермента РНКазы Р) [72], которая присоединяется к введенной цитоплазматической РНК, может успешно нацеливать РНК на митохондрии. Этот метод эффективен как для некодирующих РНК, таких как тРНК, так и для мРНК, кодирующих белки, что проливает свет на импорт gRNA в митохондрии в системе CRISPR /Cas9. Gammage et al. обобщили существующую теорию импорта РНК и опровергли ее [71]. Они отрицали существование компонентов РНК в мтРНКзе Р и считали, что РНКаза Р и РНКаза MRP в основном играют роль в ядре. Они также подвергли сомнению роль митохондриальных рибосом в содействии rRNA и PNPase в цитоплазматическом транспорте РНК [56]. Также сообщалось, что два домена дрожжевой цитоплазматической tRNA^Lys(CUU), F-арм и D-hairpin [73], а также некоторые домены 5S РНК, могут также способствовать РНК проникать в митохондрии [74].

Из-за отсутствия в митохондриях пути репарации NHEJ при существовании пути репарации гомологичной рекомбинации (HR) [75], в митохондриях человека и рыбок данио [69], митохондриях дрожжей и хлоропластах арабидопсиса [70] была предпринята и успешно осуществлена вставка последовательности ДНК в мтДНК с использованием системы CRISPR- Cas9 для создания двухцепочечных разрывов (DSB) и внесения экзогенной ДНК для поддержания гомологичных фрагментов. В прошлом проникновение ДНК в митохондрии сталкивалось с большими трудностями из-за мембранного потенциала, рН и фагоцитоза бактериофагов [76]. Однако чужеродная ДНК была успешно введена в митохондрии дрожжей путем биолитической бомбардировки клеток покрытыми ДНК частицами вольфрама, электропортации, комплексами DQAsome и TAT [76]. В другом исследовании MTS использовали для модификации капсида VP2 аденоассоциированного вируса и добились успеха в переносе гена ND4 в митохондрии, что открывает новый метод митохондриальной доставки последовательности ДНК [75]. Другие системы доставки лекарств или белков в митохондрии разработаны на основе металл-органического каркаса (MOF) или triphenylphosphonium (TPP) и cell-penetrating poly(disulfide)s (CPD), модифицированных биоразлагаемых наночастиц диоксида кремния (BS-NPs), которые являются потенциальными средствами доставки в митохондрии экзогенного компонента ДНК или РНК [77], [78].

В исследовании Bian et al. модифицировали Cas9 с помощью MTS и транскрибировали его in vitro, затем микроинъецировали gRNA и продукт транскрипции in-vitro в цитоплазму. Они также ввели экзогенный ДНК-вектор, содержащий гомологичное плечо, путем трансфекции ViaFect [69]. Удивительно, но экзогенная ssDNA с коротким гомологичным плечом точно встраивалась в целевые локусы, и этот мутагенез мог устойчиво передаваться F1 поколению рыбок данио, это указывает на то, что ssDNA и gRNA могут быть перенесены в митохондрии без модификации и это согласуется с недавним отчетом, опубликованным другими [79]. Затем белок mito-Cas9 может специфически нацеливаться на мтДНК и уменьшать число копий мтДНК как в клетках человека, так и у рыбок данио [69].

Другая группа исследователей вводит "Edit Plasmids", содержащие ген Cas9, экспрессирующие последовательность gRNA и гомологичную последовательность, в митохондрии дрожжей и хлоропласты Chlamydomonas методом микропроекционной трансформации [70]. Результат показывает вставку донорской ДНК в сайты мишени, что облегчалось гомологичной рекомбинацией, это было сходно с работой на рыбках данио [69].

Однако вопрос о существование эндогенного механизма импорта нуклеиновых кислот в митохондрии млекопитающих, необходимого для митохондриального редактирования генов CRISPR/Cas9, остается спорным [71].

Белки Argonaute были впервые идентифицированы в эукариотах, но гомологичные прокариотические белки Argonaute (pAgos) также были обнаружены в археях и бактериях [80]. Argonaute белки представляют собой очень разнообразное семейство белков, управляемых нуклеиновыми кислотами, и обладают потенциалом редактирования генома [81]. Эукариотические белки Argonaute опосредуют РНК-направляемую РНК-интерференцию, в то время как pAgos обычно используют направляющие ДНК для целенаправленного воздействия на комплементарные последовательностей ДНК для защиты своих хозяев от вторжения ДНК [82], [83]. Например, у цианобактерий Synechococcus elongates SeAgo является ДНК-направляемой нуклеазой, преимущественно действующей на одноцепочечные ДНК-мишени, при этом у двухцепочечных субстратов наблюдается неспецифическая гид-независимая активность [84]. Clostridium butyricum (CbAgo) нацеливается на многокопийные генетические элементы, вызывает интерференцию ДНК между гомологичными последовательностями и запускает деградацию ДНК. Загрузка CbAgo небольшими ДНК-проводниками зависит как от присущей ему эндонуклеазной активности, так и от механизма репарации двунитевых разрывов [85]. Интересно, что и Methanocaldococcus jannaschii (MjAgo), и Thermus thermophilus (TtAgo) обладают двумя режимами действия: канонической эндонуклеазной активностью, зависящей от направляющих, и ненаправляемой эндонуклеазной активностью ДНК [86-91]. Кроме того, CbAgo и Limnothrix rosea (LrAgo) могут действовать как ДНК-направленные ДНК-нуклеазы при физиологических температурах, что расширяет их потенциальное использование в качестве инструмента в геномных приложениях [92], [93]. В частности, некоторые pAgos, такие как Rhodobacter sphaeroides (RsAgo), получают направляющие способности от мРНК плазмиды, чтобы вмешиваться в ДНК плазмиды, снижая транскрипцию репортерных генов и содержание плазмиды [81], [83], [94].

Недавно было выявлено несколько pAgos, которые усиливают процесс положительной селекции RecA-опосредованного обмена нитями ДНК посредством взаимодействия своего домена PIWI и рекомбиназы A (RecA), которая направляет гомологичную рекомбинацию последовательностей мишени [82,95]. В связи с тем, что митохондриальная ДНК поддерживает обновление и репликацию, целесообразно ввести гомологичные плечи pAgos для нацеливания на мутационные последовательности в митохондриях. Гомологичное плечо должно быть сконструировано как нормальная последовательность мтДНК определенной длины, чтобы направлять трансформацию мутировавшей последовательности ДНК в нормальную ДНК в новом раунде процесса репликации. Пока мутировавшая ДНК трансформируется в нормальную ДНК, поврежденные митохондрии могут быть спасены и восстановлены. Однако использование системы на основе pAgo для редактирования митохондриальной ДНК требует дальнейшего изучения (рис. 2D).

Выводы, полученные в результате проведенных исследований по методам редактирования митохондриальных генов. К настоящему времени, хотя традиционные методы редактирования генов, такие как RE, ZFN и TALEN, достигли определенного прогресса в редактировании митохондриальных генов, полная, специфическая и систематическая технология редактирования митохондриальных генов еще не создана. Использование модифицированной системы CRISPR/Cas9 частично решило проблему ориентации генов, но и здесь есть определенные недостатки. До сих пор нет достаточных и обоснованных экспериментальных данных, подтверждающих этот вывод. Однако, основываясь на этих исследованиях, ученые могут попытаться усовершенствовать CRISPR/Cas9 и другие методы редактирования генов, например, систему на основе pAgo, для редактирования конкретных митохондриальных генов. Независимо от того, будут ли аномальные митохондрии очищены после того, как адаптированная система CRISPR/Cas9 разрушит мтДНК, или мутантные фрагменты мтДНК будут восстановлены непосредственно с помощью методов редактирования генов на основе pAgo для восстановления нормальной функции митохондрий, дисфункция митохондрий будет успешно устранена. Если удастся решить проблемы пока неэффективной доставки направляющей гид РНК и ферментных комплексов Cas9 в митохондрии и низкой специфичности редактирования. Адаптированная система CRISPR/Cas9 и система редактирования генов на основе pAgo могут стать наиболее перспективными способами редактирования митохондриальных генов. В будущем они, несомненно, позволят найти новые подходы к диагностике и лечению наследственных митохондриальных расстройств.