Посещений:
МЫШЕЧНЫЕ ДИСТРОФИИ



Терапевтические подходы

Gene-editing, immunological and iPSCs based therapeutics for muscular dystrophy
Shagun Singh,Tejpal Singh, Chaitanya Kunja et al.a1
European Journal of Pharmacology Volume 912, 5 December 2021, 174568



1. Introduction: muscular dystrophy and dystrophin


Первое толкование muscular dystrophy (MD), заболевания, вызывающего прогрессирующую слабость у мальчиков, было дано сэром Чарльзом Беллом в 1830 году. Позже, в 1836 году, Конте и Джоджа сообщили о генерализованной слабости и поражении мышц у двух братьев (Conte and Gioja, 1836). Позже, в 1860 году, французский невролог Гийом Бенджамин Аманд Дюшен впервые описал наиболее распространенную и тяжелую форму дистрофии, известную как мышечная дистрофия Дюшена (DMD). Это генетически наследуемое Х-сцепленное заболевание с дефицитом дистрофина приводит к мышечной слабости (проградации), истощению и дегенерации, что делает его самым смертельным педиатрическим заболеванием. К распространенным известным мышечным дистрофиям относятся также; мышечная дистрофия Дюшенна и Беккера (DMD, BMD), миотоническая дистрофия (DM), Limb-Girdle Muscular Dystrophy (LGMD), facioscapulohumeral Muscular Dystrophy (FSHD), врожденная мышечная дистрофия (CMD), дистальная (DD), окулофарингеальная мышечная дистрофия (OPMD) и мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса (EDMD). Эти дистрофии различаются по возрасту начала заболевания, тяжести состояния и характеру поражения мышц. В конце 20 века Эмери сообщил, что DMD ежегодно поражает 1 из 3500-6000 детей мужского пола, а BMD - 1 из 18 518 родившихся детей мужского пола (Emery, 1991); редкие генетические заболевания, такие как BMD являются более легкими, чем другие формы DMD.
При обоих вышеупомянутых заболеваниях происходит мутация в гене дистрофина, который является самым большим геном в геноме человека и расположен в локусе Xp21. Он состоит из 79 экзонов с 7 различными промоторами, которые необходимы для экспрессии тканеспецифических изоформ дистрофина различной длины, таких как транскрипт первых трех промоторов: 1) Dp427 приводит к изоформе дистрофина полной длины для мышц, мозга и нейронов Пуркинье; 2) Dp260 для изоформы сетчатки; и 3) Dp140 для изоформы мозга и почек, Dp116 для изоформы периферических нервов, Dp7bh является вездесущим - это постепенно укорачивающиеся изоформы от N-конца (Doorenweerd et al., 2017; Upadhyay et al., 2020). Ген дистрофина кодирует белок дистрофин, который необходим для поддержания целостности мышечной мембраны. Он имеет четыре домена: актин-связывающий домен-1 (ABD1), стержневой домен, богатый цистеином домен и карбоксильный кончик (рис. 1). Дистрофин связан с другими белковыми комплексами, такими как саркоплазматические белки (синтрофины, дистробревин и нейрональная синтаза оксида азота), трансмембранные белки (дистрогликан, саркогликаны, саркоспан и кавеолин-3) и различные внеклеточные белки. Они образуют дистрофин-ассоциированный белковый комплекс (DAPC) или дистрофин-гликопротеиновый комплекс (DGC) (рис. 1). Во время мышечного сокращения DAPC играет важную роль в механической стабилизации сарколеммы (Straub and Campbell, 1997), которая в дальнейшем участвует во внутриклеточной передаче сигналов (Constantin, 2014).



Fig. 1. The diagram represents that after particular exonic deletion corresponds to a specific region of dystrophin protein. Analysis of missing region is done by "DMD open access variant explore". Deletion of exon 2-19 which is proximal hot spot region results in missing of N-terminal which contains ABD1, H1, H2 (proline-rich region) and R1-R4 central rod domain. Deletion in distal hot spot region results in the missing of R16-R22 and H3 region. Two largest exonic deletions 19-51 and 8-43 will lack the R4-R20 with H3 and some part of ABD-1(N-terminal) to R16 with H1-2 respectively. Single exonic deletion of exon 78 will lack the CT domain of protein. Mutation in DAG1 which encodes ?-DG and GMPPB, TRAPPC gene which has role in glycosylation of ?-DG will result in various types of muscular dystrophy. Mutation in sarcoglycan encoding gene SGCA also results in different types of muscular dystrophy. Figure adapted from (Fairclough et al., 2011; Iyombe-Engembe and Tremblay, 2017; Jones, 2019).

Сарколемма стабилизируется с помощью α-, β-, γ- и δ-саркогликанов , которые защищают мышечные волокна от чрезмерного повреждения во время мышечного сокращения. Саркоспан (Sarcospan) является важнейшим компонентом комплексов DGC, который непосредственно взаимодействует и стабилизирует саркогликаны. У пациентов с DMD снижена экспрессия гена SSPN, который является ключевым регулятором сигнальных путей Akt. Регенерация мышц значительно затрудняется при недостаточности саркоспана, которая зависит от активации Akt (Vander Heide, 2015). Дистрогликан - рецепторный белок внеклеточного матрикса, связанный с адгезией, служит трансмембранной связью между внеклеточным матриксом и цитоскелетом в скелетных мышцах. Дистрофин взаимодействует с β-дистрогликаном для поддержания мембранной локализации в комплексе DAP. Затем β-дистрогликан связывается с α-дистрогликаном, который всегда действует как рецептор для лиганда внеклеточного матрикса и помогает связываться с базальной пластинкой (basal lamina), что необходимо для соединения мышечных клеток с базальной пластинкой и поддержания стабильности (Ervasti and Campbell, 1991). Саркогликаны (α, β, γ, δ) создают сложные молекулярные связи с эндогенными компонентами DGC, которые включают дистробревин, синтрофин, nNOS, саркоспан и дистрогликан. Считается, что субъединицы саркогликанов α и γ связываются с α-дистрогликаном через белок бигликан (Rafii et al., 2006). Цитозольные выпячивания из αи δ саркогликанов взаимодействуют с С-концом дистрофина (Chen et al., 2006). С-концевой домен дистрофина образует сигнальный каскад с дистробревином, синтрофином и nNOS. Саркоспан - интегральный белок, который непосредственно взаимодействует с саркогликанами и регулирует их работу. Модификация отдельных остатков субъединицы саркогликана может привести к образованию неправильной формы белка. При DMD недостаток дистрофина вызывает непостоянство комплекса, что приводит к значительному уменьшению саркогликанов. Изменения в этих белках существенно влияют на целостность мембран и приводят к прогрессирующей дегенерации мышц.
Поскольку известно, что дистрофин и связанные с ним белки обеспечивают стабильность сарколеммы во время сокращения мышц, дефицит дистрофина и связанных с ним белков ослабляет сарколемму и, как следствие, повреждает ее при регулярном сокращении и расслаблении мышц (Petrof et al., 1993). Это повреждение, в свою очередь, приводит к нарушению работы различных структурных и регуляторных генов в мышцах (Ge et al., 2004). Эти изменения в конечном итоге приводят к гибели мышечного волокна, что сопровождается воспалением. В ответ на повреждение мышц организм стимулирует различные воспалительные цитокины и иммунные клетки и усиливает тяжесть мышечной патологии. В это время мышечные клетки-сателлиты помогают в регенерации мышц, которая происходит в три фазы. Первая фаза - это фаза воспаления, когда цитокины и факторы роста рекрутируют клетки-сателлиты, которые дифференцируются в миобласты. Во второй фазе нервы и кровеносные сосуды проникают в область заживления, которая называется фазой восстановления. Последняя фаза называется фазой ремоделирования, во время которой происходит перестройка миофибрилл для создания полностью функциональной мышцы (Turner and Badylak, 2012). Этот процесс регенерации оказывается неэффективным, поскольку при мышечной дистрофии происходит непрерывное сокращение мышц, что вызывает микроразрывы сарколеммы. Увеличение числа истощенных клеток-сателлитов в конечном итоге приводит к замещению мышц жировой и соединительной тканью. В долгосрочной перспективе это способствует прогрессирующей мышечной слабости и истощению.
Эффективного лечения против этих ухудшающих состояние мышц не существует. Понимание мутаций дистрофина и DAPC, безусловно, приведет к разработке более эффективных персонализированных методов лечения. Существуют новые методы в сочетании с редактированием генов и терапией на основе стволовых клеток. iPSC (индуцированные плюрипотентные стволовые клетки), полученные из миобластов, могут оказаться эффективными в восстановлении экспрессии дистрофина для преодоления прогрессирующей мышечной слабости.
2. Mutation pattern in dystrophin


Наиболее распространенными мутациями в гене дистрофина являются делеции экзонов, на долю которых приходится 81,2% случаев DMD. В то время как дупликации и малые мутации составляют 5,4% и 11,5% случаев DMD (Polavarapu et al., 2019). Этот ген содержит "горячие точки", которые более подвержены делециям, чем другие. Два основных региона делеций включают дистальный регион, который охватывает экзоны 44-55 и на который приходится 85,7% делеций. Делеции в этой области удаляют центральную часть rod-домена белка дистрофина, а делеции в проксимальной области др. "горячей точки", которая присутствует между экзонами 2-19, составляет 14,3% (Basumatary et al., 2013). Такие делеции удаляют часть ABD1 и стержневой домен белка дистрофина. Большинство делеций может быть обнаружено путем скрининга этих "горячих точек". Для дупликации и малых мутаций таких горячих точек нет. Статистические отчеты фиксируют возникновение делеций одного экзона у 38,7% пациентов с DMD, в то время как у остальных 61,3% пациентов наблюдаются делеции в нескольких экзонах (Basumatary et al., 2013). Самые крупные делеции экзонов часто происходят между экзонами 8-43 и 19-51 (Basumatary et al., 2013; Anuradh Sharma et al., 2017a). Такая картина делеций встречается у индийских пациентов с DMD и может отличаться в разных регионах мира (рис. 1).
Делеции одного экзона (например, делеция экзона 5) приводят к тяжелой двигательной дисфункции, в то время как делеции нескольких экзонов (например, делеции экзонов 45-55) приводят к легкой двигательной дисфункции (Miyazaki et al., 2009). Тяжесть DMD и BMD зависит от правила рамки считывания, которое гласит, что out-of-frame делеция приводит к тяжелым фенотипам, а in-frame делеция - к более легким. Вероятность out-of-frame делеций на 91,6% выше, чем in-frame делеций (Polavarapu et al., 2019). Иногда это правило рамки считывания не соблюдается при немногих экзонных делециях, например, при in-frame делеции экзона 5 (рис. 1), который имеет решающее значение для кодирования ABD1 для белка дистрофина, что приводит к BMD с тяжелыми фенотипами (Fraidenraich et al., 2016). Другим зарегистрированным исключением из этого правила является out-of-frame делеция экзона 78 (рис. 1). При более легком фенотипе изменения экзона 79 приводят к образованию белка дистрофина длиной 3703 аминокислоты вместо нормального белка длиной 3685 аминокислот (Traverso et al., 2018).
2.1. Mutation in dystrophin associated protein complex (DAPC)


Мутации в DAPC прямо или косвенно влияют на функцию дистрофина. В DAPC, α-дистрогликан (α-DG) тесно связан с β-дистрогликаном, который далее связывает дистрофин. α-DG также действует как рецептор для внеклеточного лиганда, такого как ламинин, важной молекулы для прикрепления мышечных клеток к базальной пластинке для стабильности. Связывание α-DG с ламинином требует гликозилирования α-DG во время его посттрансляционной модификации для поддержания нормальной функции. Гипогликозилирование α-DG приводит к нестабильности сарколеммы, что в дальнейшем приводит к дегенерации мышечных клеток. Мутации в α-DG, кодирующего дистрофин-ассоциированный гликопротеин-1 (DAG1), кодирующий гликозилирующие ферменты, такие как like-acetyl-glucose-aminyl-transferase (LARGE) и гуанозин-дифосфат-манноза-пирофосфорилаза-B (GMPPB). Это играет роль в переносе гликозильной половинки на α-DG для его гликозилирования, однако гипогликозилированное состояние приводит к нарушению функции α-DG. Точечная мутация T192M (треонин в метионин) в DAG1 приводит к изменению взаимодействия между гликозилирующим ферментом LARGE и α-DG. За этим следует гипогликозилирование α-DG со структурными изменениями, которые влияют на взаимодействие ламинина-1 с α-DG; и приводят к возникновению LGMD (MD дистрогликанопатия типа C9; MDDGC9) (Bhattacharya et al., 2016). Однако мутация в гене GMPPB приводит к более легкому началу LGMD у взрослых (Balcin et al., 2017). Помимо этих мутаций, изменение транспорта α-DG из эндоплазматического ретикулума в комплекс Гольджи (антероградный транспорт) во время посттрансляционной модификации также вызывает гипогликозилирование α-DG. Одним из таких примеров является мутация в комплексе частиц белка-переносчика 11 (TRAPPC11). Комплекс субъединиц TRAPP необходим для антероградного мембранного транспорта во время посттрансляционной модификации и приводит к гипогликозилированию α-DG (Munot et al., 2020). Мутации в α-, β-, γ-, δ-саркогликане, кодируемом геном sarcogyl, также может нарушать стабильность DAPC и вызывать LGMD. Делеция 11 п.н. в экзоне 4 гена саркогликана альфа (SGCA) на нуклеотиде 2075 приводит к мутации со сдвигом рамки считывания путем удаления трех аминокислот из кодонов 107-109. Это также образует преждевременный стоп-кодон после 4-го аминокислотного остатка, что приводит к LGMD-типа 2D (Mojbafan et al., 2016). А миссенс-мутация c.218C > T (цитозин - тимин) в SGCA приводит к LGMD2D. Эта мутация также приводит к снижению/отсутствию трех других β, γ и δ-саркогликановых белков (Lu et al., 2019). В заключение, мутации в белках DAPC приводят к нарушению внутриклеточного актина (цитоскелета) и связывания ECM, что делает сарколемму нестабильной и вызывает мышечную дистрофию.
Мутации генов, кодирующих белки эмерин, кальпаин и телетонин, косвенно влияет на функцию дистрофина, что в свою очередь приводит к нестабильности сарколеммы, вызывая различные мышечные дистрофии, такие как мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса (EDMD), LGMD2A и LGMD2G. Белки эмерина присутствуют во внутренней ядерной мембране скелетных, сердечных, гладких мышц и других тканей, образуя комплексы ядерных белков эмерина с ламином A/C и ядерным актином (Ziat et al., 2016). Дефект в формировании этого комплекса ядерных белков эмерина вследствие мутаций в генах, кодирующих эмерин и ламин A/C, также приводит к EDMD. Кроме того, мутации в гене, кодирующем эмерин (X-EMD), приводят к Х-сцепленному EDMD, в то время как мутация в гене LMNA (lamin A/C) приводит к аутосомно-доминантному EDMD. Экзон 2 гена X-EMD считается "горячей точкой" мутаций из-за высокого содержания GC, что делает его уязвимым для мутаций (Brown et al., 2011). Мутация CAPN-3 (кальпаин, член семейства кальций-активируемых протеаз) также приводит к LGMD2A. Кальпаин играет важную роль в регуляции экспрессии специфических для мышц транскрипционных факторов для дифференцировки мышц (Pantoja-Melendez et al., 2017). Мутации в генах, кодирующих саркомерные белки (поддерживают стабильность сарколеммы), также приводят к мышечным дистрофиям; например, саркомерный белок телетонин, кодируемый геном Titin-cap (TCAP), приводит к LGMD2G (Olive et al., 2008). Таким образом, мутации в генах, которые либо поддерживают стабильность сарколеммы, либо в комплексе с DAPC, приводят к различным легким и тяжелым типам мышечных дистрофий. Таким образом, существует очевидная корреляция между генотипом и фенотипом, которые изменяются из-за мутаций в гене дистрофина, приводящих к аномальным фенотипам. Более подробная информация о типах мышечной дистрофии, их распространенности в общей популяции и белках, ответственных за фенотип заболевания, приведена в таблице 1.

Table 1. Types of muscular dystrophy with their prevalence in general population along with the protein involved in diseased phenotype.
2.2. Gene editing as a possible therapeutical approach for severe cases of muscular dystrophy


У пациентов с DMD наблюдаются тяжелые проявления болезни из-за делеций, нарушающих рамки считывания ORF, в результате чего вырабатываются нефункциональные белки. В настоящее время CRISPR-Cas9 и антисмысловые олигонуклеотиды (AONs) используются для восстановления нарушенной рамки считывания у пациентов с DMD путем преобразования out-of-frame последовательностей в in-frame путем отрезания или пропуска определенного участка гена. CRISPR-Cas9 и AONs могут эффективно преобразовать DMD в BMD путем производства небольшого, но функционального количества белка дистрофина. Редактирование CRISPR-Cas9 направлено не только на восстановление рамки считывания, но и на сохранение важных spectrin like regions (SLRs, необходимых для связывания с другими белками). SLRs, такие как SLR16 и SLR17, важны для связывания нейрональной синтазы оксида азота (nNOS) при образовании DAPC. CRISPR-SaCas9 система (Streptococcus aureus Cas9) была использована для делеции экзона 51 в 293T-клетках, где она трансфицируется с помощью AAV, содержащего sgRNA (small guide RNA), которая связывается с сайтом, создавая гибрид экзонов, что приводит к двунитевым разрывам и восстановлению рамки считывания (Таблица 2. S.No. 1) (Duchtne et al., 2018). В клетках мыши и человека CRISPR-SpCas9 (Streptococcus pyogenes Cas9) также использовался для восстановления рамки считывания экзона 45, и эффективность коррекции гена повышалась при увеличении соотношения AAV-sgRNA и AAV-Cas9 (Таблица 2. S. No. 2) (Min et al., 2019). Это показывает потенциал SaCas9 и SpCas9, используемых для редактирования генов дистрофина, безусловно, может быть модифицирован в дальнейшем для терапевтического применения при DMD.

Table 2 Major experiments conducted for restoration of dystrophin expression using CRISPR-Cas method.

Не только расщепление экзона с помощью CRISPR-Cas9, но и пропуск экзона также показывает эффективные результаты в преобразовании DMD в BMD. Модуляция регуляторов сплайсинга предоставляет основную идею пропуска экзонов, как, например, в случае делеции экзона 44. Эта модуляция носит out-of-frame характер. Отсутствие фактора сплайсинга Celf2a приводит к естественному пропуску экзона 45, поэтому проявляются легкие фенотипы болезни (Таблица 2. S. № 3) (Martone et al., 2016). Нонсенс-мутации экзонов могут приводить к пропуску самих себя в гене, изменяя последовательность энхансера сплайсинга экзонов в элемент сайленсера (замалчивания). Это действует как регулятор сплайсинга, как напр., нонсенс-мутация c.3340A > T (аденин -> тимин) в экзоне 25. Пациенты с более легким фенотипом будут наблюдаться потому, что эта нонсенс-мутация приводит к пропуску экзона 25 путем преобразования последовательности энхансера сплайсинга экзонов в элемент сайленсера (Zhu et al., 2019). Однократное внутривенное введение AAV-CRISPR новорожденным мышам показало восстановление дистрофина (Таблица 2. С. № 4) (Nelson et al., 2019). Одноцепочечные и самокомплементарные AAV, упакованные нуклеазой Cas9, и CRISPR single guide RNAs с системными введениями соотв. доз также восстанавливают дистрофин в мышиной модели DMD (Таблица 2. S. No. 5) (Zhang et al., 2020). Эти подходы полезны для перевода DMD в более легкую форму (BMD).
Однако основным ограничением, которое необходимо устранить до внедрения лечения в клинику с помощью CRISPR/Cas9, является степень воздействия вне мишени. Возможность воздействия вне мишени должна быть минимизирована с помощью соответствующих in-silico инструментов по преобразованию gRNA. Необходимо улучшить как эффективность, так и специфичность. Наряду с этим иммунный ответ против Cas9 может привести к уничтожению Cas9-содержащих клеток. Кроме того, вирусные векторы, используемые для доставки, могут служить мощным иммуногеном и, таким образом, вызывать иммунный ответ против себя. Оба этих иммуногенных ответа могут сделать терапию неэффективной.
AONs (синтетические молекулярные соединения) играют важную роль в переводе тяжелой формы DMD в легкую путем пропуска экзона, который нарушает рамку считывания. AONs обеспечивают пропуск экзона 53, что может быть полезно при делеции экзонов 45-52, 47-52, 48-52, 49-52, 50-52 или только экзона 52 у пациента. Эта стратегия используется для лечения примерно 10,1% пациентов с DMD (Bladen et al., 2015). Использование NS-065/NCNP-01 (Vitolarsen), phosphorodiamidate morpholino oligomer (PMO) в клетках рабдомиосаркомы человека (RD) и клетках, полученных от пациента с DMD (пропуск экзона 53), восстановило уровень дистрофина (Watanabe et al., 2018). Витоларсен комплементарен последовательности между 36 и 56 экзону 53 (Watanabe et al., 2018). О безопасности и эффективности витоларсена, PMO для лечения пациентов с DMD в настоящее время проходит 2-ю фазу клинических испытаний (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT02740972). В этом исследовании показано, что лекарство вызывает выработку дистрофина у всех пациентов без каких-либо серьезных или побочных эффектов (Clemens et al., 2020). Иногда in-frame делеции также могут приводить к фенотипам DMD. Out-of-frame и in-frame делеции в экзонах 45-55 можно лечить путем восстановления рамки считывания, пропуская несколько экзонов, или путем получения улучшенного функционального белка. Пропуск нескольких экзонов может быть осуществлен с помощью коктейля AONs на основе PMO.
3. Muscular dystrophy and immunological therapeutics


Иммунная система поддерживает патогенез мышечной дистрофии посредством различных цитокинов и реакций иммунных клеток. В основном это включает накопление иммунных клеток и воспаление скелетных мышц (Arahata and Engel, 1984; Spencer and Tidball, 2001). Белок с нарушенной функцией дистрофин увеличивает проницаемость мембраны для ионов и приводит к хрупкости клеточной мембраны. Хрупкость мембраны мышечной клетки увеличивает приток ионов Ca2+ и отток креатинкиназы. Повышенный уровень Ca2+ способствует повреждению мышечной мембраны и выработке ROS (реактивных форм кислорода) (Allen and Whitehead, 2011). Чтобы восстановить повреждение мышц, организм стимулирует воспалительные цитокины и иммунные клетки, такие как Т-лимфоциты (CD4+, CD8+) и моноциты, что приводит к усилению тяжести мышечной патологии. Исследования на мышах Mdx показали, что Т-клетки ответственны за развитие мионекроза и дегенерации мышц (Spencer and Tidball, 2001). При этом истощение лимфоцитов в дистрофических мышцах привело к уменьшению лизиса мышц (Spencer et al., 2001). Цитокины, такие как INFγ, выделяемые NK-клетками и Т-лимфоцитами, активируют макрофаги. INFγ вызывает повреждение мышц у мышей mdx, индуцируя цитолитические макрофаги M1 и вызывая апоптоз (S. A. Villalta et al., 2011). Подавление INFγ уменьшает тяжесть повреждения мышц и улучшает двигательную функцию. Фиброз и экспрессия TGF- β1 были значительно снижены у мышей mdx/SCID (Severe combined immuno-deficient mice), когда мышей mdx скрещивали с мышами SCID. Однако, по сравнению с мышами mdx, дегенерация и некроз мышц наблюдались только у мышей mdx. Это позволяет предположить, что уменьшение мышечного фиброза происходило за счет снижения количества Т- и В-лимфоцитов и экспрессии TGF- β1 (Farini et al., 2007; S Villalta et al., 2011).
Иммунная регуляция при мышечной дистрофии играет двойную роль, способствуя восстановлению тканей и развитию дегенеративных механизмов. Мышечная дегенерация индуцируется цитотоксической активностью макрофагов М1, в то время как восстановление мышц стимулируется макрофагами М2 путем подавления активности макрофагов М1 (Laskin, 2009). Высвобождение провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-1 β и IL-6 макрофагами М1 способствует лизису клеток и фагоцитозу поврежденных мышц и освобождает пространство для восстановления мышц (рис. 2). В то время как макрофаги М2 начинают выделять противовоспалительные цитокины, такие как IL-4, IL-10 и TNF- β для ослабления иммунного ответа и восстановления тканей. Макрофаги М2 состоят из трех подтипов - М2а, М2b и М2с (Mantovani et al., 2004). Макрофаги М2а подавляют лизис мышц макрофагов М1 с помощью фермента аргиназы. Происходит высвобождение противовоспалительных цитокинов макрофагами M2b для прекращения иммунного ответа, после чего восстановление тканей завершается макрофагами M2c. IL-10 макрофагов способствует пролиферации клеток мышечных сателлитов для регенерации тканей. Подавление макрофагов M1 также связано со снижением экспрессии iNOS (синтазы оксида азота) и IL-6 (Villalta et al., 2008; Woodman et al., 2016).



Fig. 2. Activation of NF?B. Active IKK complex consists of three subunits. The activated IKK kinase complex can phosphorylate IκB protein which is bond to NF-κB dimer. Once IκB is phosphorylated by IKK complex IκB is detached from NF-κB dimer and leads to activation of NF-κB (Braun et al., 2006).
В раннем возрасте пациентов с DMD экспрессия TGF- β меньше, но с возрастом его экспрессия увеличивается, что приводит к хроническому воспалению. Кроме того, более высокая экспрессия TGF- β наблюдается при DMD по сравнению с BMD (Bernasconi et al., 1995). Начальные стадии хронического воспаления в модели mdx похожи на острое воспаление, при этом происходит привлечение нейтрофилов. При хроническом воспалении в состоянии мышечной дистрофии макрофаги M1 и M2 активируются одновременно и прерывают активность друг друга, что приводит к повреждению мышц. Воспалительные цитокины, TNFα и IFNγ активируют провоспалительные макрофаги M1 и вызывают деградацию тканей (рис. 2). Деструкция тканей происходит под действием оксида азота (NO), опосредующего цитотоксическую активность макрофагов M1. Макрофаги М2 также подавляют NO-опосредованный лизис клеток и способствуют повреждению мышц, активируя Т-клетки. У мышей mdx лизис клеток макрофагами М2 происходит за счет выработки аргиназы (Woodman et al., 2016). IL-6 является провоспалительным цитокином, его экспрессия хронически повышена при DMD (Stephenson et al., 2020). IL-6 обладает двойной природой; он усиливает миогенез, стимулируя опосредованный клетками-сателлитами гипертрофический рост мышц. Избыточная экспрессия IL-6 способствует атрофии и разрушению мышц у мышей mdx, однако блокирование IL-6 с помощью нейтрализующего антитела привело к уменьшению некроза миофибрилл и воспаления мышц, но без функционального улучшения работы мышц у мышей mdx (Mammen and Sartorelli, 2015). Это говорит о провоспалительных и противовоспалительных свойствах IL-6. Таким образом, иммунная система играет двойную роль при мышечной дистрофии, способствуя как разрушению тканей, так и их восстановлению.

3.1. Role of ROS generation and NF-κB in immune response elicited by muscular dystrophy


Для поддержания окислительно-восстановительного гомеостаза скелетные мышцы постоянно вырабатывают ROS, которые поглощаются антиоксидантами. Окислительный стресс изменяет баланс между производством ROS в процессе клеточного метаболизма и изменяет гомеостаз. Повышенный окислительный стресс и повышенное производство ROS наблюдаются у пациентов с DMD. При DMD деполяризация мембраны вызывает генерацию ROS в результате аномального притока внеклеточного Ca2+ в мышечные клетки. Перегрузка Ca2+ в митохондриях вызывает дисфункцию митохондрий, которая увеличивает активность фагоцитарной NADPH-оксидазы (NOX). Здесь ROS связаны с повреждением клеток и увеличением экспрессии iNOS (индуцибельной синтазы оксида азота) (Prosser et al., 2013). NOX имеет решающее значение для генерации ROS в мышцах, в присутствующих поперечных канальцах. Она включает p47phox, p67phox, p40phox, регуляторные цитозольные субъединицы GTPase (rac-1, -2) и каталитические связанные с мембраной субъединицы gp91phox(NOX2), p22phox (Sumimoto, 2008). Повышение активности NOX2 усиливает продукцию ROS и играет важную роль в патофизиологии дистрофии у мышей mdx. Однако снижение экспрессии NOX2 значительно улучшает функцию мышц, что обеспечивает устойчивость к повреждению тканей (Babior and Kipnes, 1977).
Не только NOX, но и митохондриальный фермент моноаминоксидаза (МАО) является еще одним источником выработки ROX. МАО существует в двух изоформах во внешней мембране митохондрий и отвечает за окислительное дезаминирование нейротрансмиттеров и аминов с образованием аммиака, альдегидов и перекиси водорода (Youdim et al., 2006). В скелетных мышцах МАО способствует катаболизму катехоламинов. Изменения в метаболизме катехоламинов могут быть связаны с тяжестью состояния заболевания (Dalmaz et al., 1979). Исследование, проведенное Menazza et al., выявило повышение уровня МАО, а также его ферментативной активности у мышей mdx (Menazza et al., 2012). Более того, увеличение окислительного стресса можно обнаружить даже у 3-недельных мышей mdx, когда другие симптомы повреждения мышц, такие как некроз и воспаление, отсутствуют (Disatnik et al., 1998). Комплекс I и III электронно-транспортной цепи митохондрий также приводит к образованию супероксидных ионов и перекиси водорода (Nelson et al., 2006). Вследствие окислительного стресса комплекс II еще больше повышает уровень оксидантов и усугубляет состояние (Zhang et al., 1998). Ксантиноксидаза - еще один источник ROS, особенно в скелетных мышцах крыс. Однако очень низкий уровень ксантиноксидазы в скелетных мышцах человека соответствует образованию ROS в условиях нарушения в мышечного дистрофина. Ксантиндегидрогеназа - другой продукт ксантиноксидоредуктазы (один из них - ксантиноксидаза), превращающийся в ксантиноксидазу в патологических условиях и выделяющийся в кровь (Borges et al., 2002). Он отвечает за образование супероксид-ионов и перекиси водорода и тем самым вызывает окислительное повреждение скелетных мышц (Borges et al., 2002; Saugstad, 1996).
Существует множество источников оксидантов, одним из которых является оксид азота (NO), образующий reactive nitrogen species (RNS). Фермент синтаза оксида азота (NOS) приводит к преобразованию L-аргинина в L-цитруллин с высвобождением NO. В клетках млекопитающих NOS в основном представлена четырьмя изоформами: 1) нейрональная NOS (nNOS), 2) индуцибельная NOS (iNOS), 3) эндотелиальная NOS (eNOS) и 4) митохондриальная NOS (mtNOS) (Ghafourifar and Cadenas, 2005; Stamler and Meissner, 2001). В скелетных мышцах преобладает nNOS, которая подвергается пост-транскрипционной модификации и образует nNOSµ, связанную с комплексом дистрофина (Silvagno et al., 1996). При DMD уровень nNOS значительно снижается, что приводит к окислительному стрессу, так как не будет NO для регулирования уровня антиоксидантов (Wink et al., 1995). Кроме того, производство NO из других источников может негативно влиять на скелетные мышцы, так как NO, образующийся из iNOS и обладающий цитотоксическими свойствами против опухолей, может повреждать и здоровые мышечные клетки (MacMicking et al., 1997).
Кроме того, макрофаги во внеклеточной области также выделяют провоспалительные цитокины. Как ROS, так и макрофаги могут активировать сигналы NF-κB (ядерный фактор каппа -B) в мышечной клетке. Активированные цитокины, высвобождаемые NF-κB, приводят к мионекрозу (Whitehead et al., 2010). NF-κB и подсемейство транскрипционных факторов, которые связываются с определенной последовательностью ДНК, могут контролировать транскрипцию и регулировать иммунный ответ. В клетках млекопитающих существует пять семейств NF-κB: RelA (p65), RelB, cRel, (p50/p105), (p52/p100). За исключением RelB, все они могут образовывать гомодимеры и гетеродимеры друг с другом. Наиболее распространенной формой гетеродимера при DMD является p50/p65 (Mourkioti and Rosenthal, 2008). Образование димера NF-κB необходимо для связывания ДНК. N-концевая область димера белка связывается с ДНК, в то время как C-концевая область является высоко консервативной и отвечает за димеризацию и неспецифический контакт с фосфатом ДНК. NF-κB является основным сигнальным путем для активации провоспалительных сигнальных молекул. Его димерная молекула находится в цитоплазме клетки в инактивированной форме. Ингибиторный белок Iκ-B прикрепляется к димерам NF-κB, чтобы поддерживать их в инактивированном состоянии. Существует пять ингибиторных белков - IκBα, IκB β, IκBγ, IκB ε, и Bcl-3. Белки-ингибиторы связываются со специфическими димерами NF-κB, например, IκBα связывается с гетеродимером p50/p65 и инактивирует его, тогда как Bcl-3 связывается с гомодимерами.

3.1.1. Activation of NF-κB in muscular dystrophy


NF-κB играет важную роль в воспалительной реакции и дегенерации мышц, поскольку является ключевым транскрипционным фактором для макрофагов M1, которые отвечают за разрушение мышц. NF-κB более активирован у пациентов с DMD (Monici et al., 2003). С двух лет у лиц с дефицитом дистрофина наблюдается увеличение связывания NF-κB с ДНК (Messina et al., 2011). Он активируется внеклеточными сигнальными молекулами, такими как TNF-α и IL-1, которые связываются со специфическими рецепторами на клеточной мембране. Далее TNF-α связывается с рецепторами TNF и рекрутирует адаптерную молекулу TRADD (TNFR1-associated death domain), после чего TRADD действует вместе с TRAF2 (TNFR-ассоциированный фактор 2) через N-конец TRAF2-связывающего домена (Pobezinskaya and Liu, 2012). Другая сигнальная молекула IL-1 связывается с рецептором TLR и активирует трансдуктор сигнала TRAF-6 путем связывания с миелоидным фактором дифференцировки 88 и IRAK (Interleukin IL-1 receptor-associated kinase) (рис. 2). Впоследствии фосфорилированный IRAK взаимодействует с TRAF-6 (Messina et al., 2011). TRAF-2 и TRAF-6 в С-концевой области рецептора активируют неактивный NF-κB через TAK1 (TGF- β-активируемая киназа) путем активации киназного комплекса IKK. Активированный киназный комплекс с каталитическими субъединицами IKKα, IKK β, фосфорилирует ингибитор IκB, а регуляторная субъединица IKKγ (NEMO) необходима для активации комплекса IKK. Здесь ингибитор IκB, присоединенный к гетеродимеру p50/p65, фосфорилируется и оставляет p50/p65 свободным и активированным. После активации он транслоцируется в ядро и связывается со специфическими последовательностями κB в ДНК (рис. 2). Домен P65 состоит из домена трансактивации (TAD), который регулирует транскрипцию и кодирует способствующие воспалению гены (Hsu et al., 1996; Yamaoka et al., 1998).
Ингибиторы этого пути, участвуют в регуляции димеров NF-κB (как показано на рис. 2). Для активации Nf-κB необходим комплекс IKK. Комплекс IKK состоит из трех субъединиц, IKK α, β (Chen et al., 1996; DiDonato et al., 1997), (каталитические) и IKKγ (регуляторная) (Mercurio et al., 1997). Активированный киназный комплекс IKK может фосфорилировать белок IκB (ингибитор κB), который связан с димером NF-κB. Как только IκB фосфорилируется комплексом IKK, IκB отсоединяется от димера NF-κB и приводит к активации NF-κB. Активированный NF-κB регулирует воспалительные гены и цитокины, TNFα, IL-6, INFγ, IL-1 β, что способствует лизису клеток и фагоцитозу поврежденных мышц (C. Henriquez-Olguin et al., 2015; Mercurio et al., 1997).

3.1.2. ROS inhibitors as therapeutical approach for muscular dystrophy


Дистрофические мышцы генерируют ROS за счет притока Ca2+ к мышечной мембране, вызывая избыток Ca2+ в митохондриях. Это приводит к дефициту энергии и повышению активности NADPH-оксидазы, что приводит к генерации свободных радикалов (ROS). Генерация ROS приводит к активации пути NF-κB, основного регулятора воспалительных молекул, таких как цитокины и TNF-α, что приводит к некрозу мышц. Ингибирование ROS может быть использовано в качестве подходящего терапевтического подхода у пациентов с DMD. Антиоксиданты, используемые в качестве ингибиторов ROS, могут подавлять окислительный стресс и нейтрализовать ROS, отдавая электроны свободным радикалам (CarloHenr?quez-Olgu?n et al., 2015). Здесь мы перечислили антиоксиданты, назначаемые при MD.
Антиоксидант NAC (N-ацетил цистеин): Внутрибрюшинное введение в течение 14 дней мышам mdx показало значительное снижение уровня TNF-α, воспаления и мионекроза (de Senzi Moraes Pinto et al., 2013). Другое исследование NAC показало побочные эффекты в виде снижения прироста массы тела, уменьшения массы мышц и печени (Pinniger et al., 2017). У восьминедельных мышей mdx (n = 20) с нарушением работы дыхательных мышц, которых лечили антиоксидантом NAC в течение 14 дней, наряду с мышами дикого типа (n = 10) наблюдалось ремоделирование мышц диафрагмы и усиление фиброза мышц из-за воспаления иммунных клеток. Лечение NAC улучшило состояние диафрагмы мышей mdx, а также наблюдалось противовоспалительное действие (Burns et al., 2019).
Мелатонин как антиоксидант: Мелатонин обладает как антиоксидантными, так и противовоспалительными свойствами. Основываясь на этих свойствах, мелатонин был протестирован на пациентах с DMD. Пациенты в возрасте ~12 лет получали мелатонин в запланированной дозе и в определенное время. Каждые 3, 6 и 9 месяцев проводился мониторинг уровня перекисного окисления липидов, IL-6, IL-1, IL-2 и NOX в плазме крови. У пациентов с DMD отмечалось повышение уровней LPO, NOX и цитокинов, тогда как лечение мелатонином показало снижение их уровня. Также наблюдалось значительное снижение креатинкиназы (50%), лактатдегидрогеназы (28%), аспартат-аминотрансферазы (28%), аланин-аминотрансферазы (20%) и миоглобина (13%). Эти эксперименты ясно показывают, что прием мелатонина способствует снижению мышечных повреждений, гипер-окисления и воспаления (Chahbouni et al., 2010).
Антиоксидант EGCg (epigallocatechin-gallaate): Эпигаллокатехин-галлат является основным источником полифенолов, которые обнаруживают нейротрофический эффект и являются наиболее распространенным антиоксидантом в экстракте зеленого чая. Когда EGCg вводили в модельным мышам mdx, он вызывал уменьшение мионекроза. Поэтому клинические испытания были направлены на пациентов с мышечной дистрофией и другими заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера и Хантингтона. Исследование, проведенное с участием 33 пациентов с DMD, плацебо-контролируемые рандомизированные клинические испытания с использованием EGCg в дозировке до 10 мг/кг массы тела с первичными показателями показали безопасность и переносимость в течение 12 месяцев. Вторичные результаты показали безопасность, переносимость, эффективность (изменение способов и улучшение двигательных движений) клинического исследования, https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/results/NCT01183767.

3.1.3. Химические лекарственные ингибиторы NF-κB (мышечная дистрофия)


Ингибирование фосфорилирования специфических ингибиторов в пути NF-κB с помощью химических препаратов может быть подходящим подходом для подавления регуляции воспалительных цитокинов и уменьшения мионекроза. Некоторые из широко используемых ингибиторов включают преднизон (глюкокортикоид), который является неспецифическим противовоспалительным препаратом, используемым для подавления иммунной системы и уменьшения воспаления. Пациентам с DMD в возрасте 2-4 лет назначают низкую дозировку. После 55 месяцев лечения 5 пациентов показали значительное улучшение мышечной функции и силы, в то время как у людей, получавших лечение преднизоном, наблюдались значительные побочные эффекты, такие как снижение скорости роста и неконтролируемое увеличение веса. Для минимизации побочных эффектов и эффективного лечения рекомендуются низкие дозы преднизона (Merlini et al., 2003). Кортикостероидный противовоспалительный препарат Vamorolone используется для лечения DMD. Ваморолон воздействует на duel ядерные рецепторы (N770/N564) и подавляет транскрипцию провоспалительных генов, кодирующих TNF-α, интерлейкин-6, интерлейкин-1 β. Результаты 18-месячного лечения ваморолоном показали улучшение двигательных функций по сравнению с чувствительностью к кортикостероидам у людей с такими побочными эффектами, как неконтролируемое увеличение веса. С другой стороны, лечение ваморолоном не привело к снижению роста, что наблюдается при лечении преднизоном. Клинические испытания фазы 1 на взрослых пациентах с DMD показывают многообещающие результаты. Клинические испытания фазы 2a на детях с DMD показывают лучшие результаты в двигательной функции. В настоящее время проводятся испытания фазы 3 для дальнейшего изучения ваморолона у пациентов с DMD (Smith и др., 2020). Лечение ваморолоном пациентов с DMD привело к улучшению двигательной функции и не выявило побочных эффектов. Испытания PHASE IIa, в которых пациенты получали ваморолон 2,0-6,0 мг/кг, благоприятно сказались на безопасности. Проводятся клинические испытания фазы 3 https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02760264, https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02760277, https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03038399. Remicade - анти-TNF-α; блокирует биоактивность рецепторов TNF-α и воспаление у мышей mdx. Лечение мышей mdx показало блокирование TNF-α, уменьшение разрушения мышц при дистрофии и отсутствие побочных эффектов. Кроме того, препарат продемонстрировал высокоспецифичную противовоспалительную активность (Grounds and Torrisi, 2004). Etanercent, противовоспалительный препарат, также ингибирует функцию TNF-α; он способствует уменьшению повреждения мышц при мышечной дистрофии. Гипотеза, проверенная Стюартом Ходжеттсом и др., показала, что лечение мышей mdx этанерцентом привело к снижению иммунных клеток хозяина. Наблюдалось значительное снижение количества нейтрофилов, что в свою очередь привело к уменьшению повреждения скелетных мышц и дальнейшему блокированию активации TNF-α, тем самым повышая защиту от иммунных реакций (Hodgetts et al., 2006). Edasalonexent состоит из салициловой кислоты и докозагексаеновой кислоты (DHA); салициловая кислота предотвращает атрофию мышц, связанную с NF-κB, а DHA подавляет воспаление, опосредованное NF-κB, и метаболизирует противовоспалительные эйкозаноиды, что приводит к улучшению регенерации мышечных волокон. 72 недели лечения эдасалонексентом в фазе 1/2 показали снижение экспрессии генов пути NF-κB и замедление прогрессирования заболевания по сравнению с контрольным периодом без лечения. Результаты фазы 2 также показали значительное снижение мышечного фермента и частоты сердечных сокращений, что подтверждает потенциальные преимущества в отношении кардиологического эффекта, а также здорового роста веса и роста. В фазе 3a было проведено 12-месячное рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование, в котором приняли участие 125 мальчиков в возрастной группе 4-7 лет до их 8-го дня рождения, не принимавших кортикостероиды в течение как минимум 6 месяцев. При рандомизации 2:1 67% мальчиков получали препарат изначально, и все мальчики будут получать препарат через 12 месяцев. Мониторинг клинических испытаний проводится каждые 3 месяца. Оценка включает различные параметры, такие как время стояния, подъем по 4 ступенькам, ходьба или бег на 10 м. Клиническое исследование 3-й фазы доступно на сайте https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03703882?term=edasalonexent.

4. iPSCs as cell therapy for muscular dystrophy


После открытия гена дистрофина в 1987 году появилась надежда на генотерапию как метод лечения мышечной дистрофии. Генотерапия предполагает доставку гена дистрофина во все мышцы тела. Однако основным препятствием является большой размер гена дистрофина, который составляет 2,2 Мб. Для этого было разработано множество мини- и микродистрофинов с консервативной рамкой считывания и отсутствием большей части стержневого домена и С-концевого домена, которые не являются существенными для функции дистрофина, чтобы поместить их в вирусные векторы. Но эти мини- и микроконструкции дистрофина подходят для лечения только легких случаев DMD (Sienkiewicz et al., 2015). Кроме того, у пациентов с полным отсутствием гена дистрофина может возникнуть иммунный ответ (Mendell et al., 2010). Параллельно с генотерапией клеточная терапия привлекает внимание как мощный инструмент лечения мышечной дистрофии. Клеточная терапия предполагает пересадку здоровых клеток, способных к интенсивной регенерации. Миобласты были первым выбором для клеточной терапии благодаря простоте их выделения и культивирования. Первые эксперименты Partridge et al. показали, что нормальные миобласты при введении мышам mdx экспрессируют дистрофин (Partridge et al., 1989). Однако для значительной экспрессии дистрофина требуется большее количество инъекций миобластов, поскольку миобласты показали низкую выживаемость и ограниченную миграцию in-vivo (Skuk et al., 2007). Это привело к поиску альтернативных вариантов клеточной терапии. В качестве возможной замены миобластов были использованы сателлитные клетки. Различные эксперименты показали, что сателлитные клетки могут восстанавливать более высокую экспрессию дистрофина по сравнению с миобластами (Cerletti et al., 2008). Однако сателлитные клетки не могут перемещаться на большие расстояния, поэтому их применение ограничено локальными инъекциями (Price et al., 2007). Другие стволовые клетки, такие как стволовые клетки, полученные из костного мозга, в частности мезенхимные стволовые клетки, могут быть использованы для лечения мышечной дистрофии. Мезенхимные стволовые клетки являются мульти-потентными и могут дифференцироваться в миобласты. Кроме того, их можно вводить системным путем, поскольку они обладают иммунной привилегированностью (Niederkorn, 2006). Однако полный миогенный потенциал мезенхимных стволовых клеток практически неизвестен (Markert et al., 2009). Необходимо провести дальнейшие исследования in-vitro и in-vivo, чтобы изучить способность мезенхимных стволовых клеток лечить мышечную дистрофию. Несомненно, терапия стволовыми клетками обладает возможностями для лечения мышечной дистрофии, но пересаженные клетки, полученные из существующих клеточных линий человека, всегда могут вызвать реакцию отторжения. Для устранения этих недостатков iPSCs могут стать эффективным выбором для лечения мышечной дистрофии.
iPSCs - это генетически реорганизованные соматические клетки, которые имеют черты эмбриональных стволовых клеток. Первыми перепрограммированными взрослыми клетками были мышиные взрослые фибробласты. Они были перепрограммированы с помощью 4 транскрипционных факторов, также известных как факторы Яманаки - Oct.3, Sox2, Klf4 и c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006). iPSC обладают неограниченной пролиферативной способностью и в то же время могут быть дифференцированы в любой тип клеток. Эти свойства стволовых клеток делают iPSC лучшим выбором для лечения дегенеративных заболеваний, таких как мышечная дистрофия, в частности DMD и BMD. Лечение мышечной дистрофии с помощью iPSC - это недавний терапевтический подход, основным преимуществом которого является использование крови в качестве источника клеток, так как это менее инвазивно. Один из таких методов получения iPSC из крови представлен на рис. 3a. Кроме того, это может быть персонализированный метод лечения, поскольку соматические клетки были получены от пациента. Это может быть использовано для создания iPSC, называемых DMD/BMD-специфичными iPSC, поскольку используются соматические клетки самого пациента, поэтому вероятность иммунного отторжения при применении in-vivo будет меньше или вообще отсутствовать (M. Xiang et al., 2019).



Fig. 3a. iPSC generation from blood cells. Since the generation of first iPSC in 2006 from mice fibroblast to the generation of first human iPSC in 2007, there is possibility of every somatic cell to be converted in iPSC now, since blood is the most invasive source so here we have described a protocol of iPSC generation from blood. Adopted from (Danisovic et al., 2018).
Существует два подхода для получения iPSCs; интегрирующая система, которая включает опосредованное вирусами перепрограммирование с использованием ретровирусов (Takahashi and Yamanaka, 2006), лентивирусов (Yu et al., 2007) и свиных бактранспозонов (Chen et al., 2011). Это связано с тем недостатком, что может происходить активация эндогенных генов, независимо от того, какой тип мы используем. Наряду с этим общим ограничением, существуют и некоторые специфические ограничения, например, экспрессия ретровирусов ограничена делящимися клетками (Takahashi and Yamanaka, 2006), лентивирусы демонстрируют отсутствие сайленсинга в плюрипотентном состоянии (Blelloch et al., 2007; Brambrink et al., 2008; Yu et al., 2007). Однако лентивирусный вектор 3-го поколения является сравнительно более безопасным и в настоящее время используется в клинических испытаниях генотерапии (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01745120), (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01896102), (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01515462). Бактранспозоны Piggy вводят голую ДНК в организм хозяина, стабильно интегрируются в геном хозяина и, следовательно, являются более безопасной альтернативой вирусному методу (Woltjen et al., 2011).
Другой метод - это не интегрирующая система, которая предполагает перепрограммирование с помощью аденовирусов (Stadtfeld et al., 2008; Zhou and Freed, 2009), вируса Сендай (Seki et al., 2010; Stadtfeld et al., 2008), плазмид (Ban et al., 2011), эписомальных векторов (Miyoshi et al., 2011), мРНК (Warren et al., 2010), миРНК (Goudenege et al., 2012), белков и малых молекул (Baranek et al., 2016; Shi et al., 2008). Среди них аденовирусы демонстрируют меньшую геномную интеграцию, но требуют повторной инфекции в определенных клетках, а также дают некоторое тетраплоидное поколение (Stadtfeld et al., 2008). Эписомьные векторы предлагают простой и удобный подход к генерации iPSC, но они доставляют транскрипционные факторы индивидуально путем нуклеофекции, поэтому экспрессия генов в каждой клетке может быть разной (Bang et al., 2018). Малые молекулы (такие как SAHA-PIPδ, RG108 и CHIR) помогают заменить определенные транскрипционные факторы и повысить скорость и эффективность перепрограммирования, но существует конкуренция между токсичностью и эффективностью. Кроме того, они могут оказывать неспецифическое действие, а белковая трансдукция позволяет напрямую доставлять транскрипционные факторы. Однако их короткий срок жизни делает их не очень пригодными для создания iPSCs (Maherali and Hochedlinger, 2008). miRNA - это тип малых некодирующих РНК, состоящих примерно из 19-25 нуклеотидов, которые вызывают репрессию трансляции (Chu and Rana, 2007). Экспрессия miR302/miR367 индуцирует перепрограммирование в дифференцированных клетках в формирующиеся iPSCs (Chang and Gregory, 2010). Из этих методов чаще всего используется вирус Сендай, поскольку он является РНК-вирусом и не проникает в ядро, поэтому не интегрируется в геном хозяина. Он также показывает 0,1% эффективность PBMC для перепрограммирования, что намного выше по сравнению с другими методами. Поэтому, благодаря своей эффективности и удобству, вирус Сендай оказывается наиболее подходящим выбором для перепрограммирования соматических клеток (Huang et al., 2019). Perepelina et al. генерировали специфические для пациента iPSCs из PBMC, перепрограммированных с помощью вируса Сендай, для EDMD с генетическим вариантом LMNAp.Arg527Pro (Perepelina et al., 2020).

4.1. iPSCs as skeletal muscle progenitors


После получения iPSCs, генерация миогенных предшественников действительно является основным шагом в их терапевтическом использовании для лечения мышечной дистрофии. Существует два способа: трансгенный метод и нетрансгенный метод. Трансгенный метод предполагает прямое перепрограммирование специфических для мышц транскрипционных факторов, таких как MYF5, MRF4 и MYOD, под руководством транскрипционных факторов PAX3 и PAX7, которые способствуют росту мышц и поддержанию пролиферативного пула клеток. Это высокоэффективный способ генерации миогенных предшественников, но он может быть сопряжен с генотоксичностью. Без использования трансгенов метод включает поэтапную индукцию клеток скелетных мышц с помощью определенных молекул и цитокинов, которые помогают в ингибировании или активации специфических для миогенеза сигнальных путей. К мощным индукторам миогенеза относятся ингибиторы GSK3, активирующие сигналы wnt, ингибиторы кальпаина, bFGF, активирующий тирозинкиназу рецептора FGF, и форсколин, влияющий на сигналы cAMP (Xu et al., 2013). Другие цитокины включают FGF, который увеличивает количество Pax7+ предшественников, EGF (Hosoyama et al., 2014) и IGF-1 (Abujarour et al., 2014). Этот метод менее эффективен, но более безопасен. Как только клетки приобретают свойство миогенных предшественников, они пролиферируют, образуя миобласты, которые затем сливаются и формируют миотрубки, которые созревают и выстраиваются в миофибриллы (рис. 3B). Любая из процедур, применяемых для дифференциации миогенных предшественников из iPSCs, должна соответствовать требованиям надлежащей производственной практики для обеспечения клинической совместимости (Carpenter and Rao, 2015). Благодаря последним достижениям в области трехмерных (3D) методов тканевой инженерии с помощью iPSCs были созданы искусственные скелетные мышцы для DMD и CMD (Maffioletti et al., 2018). Наряду с iPSCs клетки, полученные из перицитов, обладают потенциалом дифференцировки в мышечные клетки. AP + перициты мышиных скелетных мышц способствуют формированию мышечных волокон в мышиной модели LGMD2D (Moyle et al., 2019). Здесь основным препятствием является низкий уровень приживления клеток. Исследование Cossu et al. на 5 мальчиках с DMD показало, что внутриартериальная трансплантация аллогенных мезоангиобластов, полученных из перицитов, была относительно безопасной, но обнаруживала ограниченную продукцию дистрофина, что объясняется низким уровнем приживления клеток (Berry et al., 2007; Cossu and Sampaolesi, 2007). Эта альтернатива стволовых клеток может стать благом для будущих терапевтических средств после оптимизации методологии.



Fig. 3b. Generation of iPSCs for muscular dystrophy. Muscular dystrophy specific iPSC can be generated using transgene and transgene-free methods. In transgene method, there is direct reprogramming of iPSCs using specific myogenic markers like MYF5, MRF4, MYOD, PAX3, and PAX7 is achieved. While in transgene free method growth factors like FGF, EGF, IGF-1, BFGF, Forskolin, and inhibitors like GSK-3? inhibitor, calpain inhibitors are used to induce step-wise myogenesis. Using the conditional expression of Pax7 expanded in growth medium having dox and bFGF, Darabi and colleagues reported the successful derivation of myogenic progenitors from iPSCs for the first time (Darabi et al., 2012). Abujarour and colleagues exploited the ability of MyoD to induce myogenesis and introduced the transgene method of induction (Abujarour et al., 2014).

4.2. Route of iPSCs administration in-vivo


Теоретически, поскольку iPSC являются разновидностью стволовых клеток, способ их введения не должен сильно отличаться от стволовых клеток. Пути введения включают внутримышечный путь, интратекальный путь и системный путь. При внутримышечном способе стволовые клетки вводятся непосредственно в пораженные мышцы (Alok Sharma et al., 2017). Основным недостатком этого метода является его трудоемкость, так как клетки вводятся на очень маленькое расстояние и, следовательно, требуется больше инъекций, чтобы поразить больше областей, что оказывается очень болезненной процедурой для пациентов. Интратекальный способ введения предполагает трансплантацию стволовых клеток в спинномозговую жидкость (Dodou, 2012). Этот метод показывает значительное восстановление нервов и укрепляет нервно-мышечные соединения, которые повреждаются из-за отсутствия или наличия дефектного дистрофина и способствуют мышечной слабости (Alok Sharma et al., 2017). Самый простой способ введения стволовых клеток - внутривенная инъекция. Однако существует вероятность того, что с внутривенной инъекцией клетки попадают в другие органы, а не в орган-мишень.
Практический подход к введению iPSCs имеет различные препятствия, которые необходимо преодолеть до их применения in-vivo. Модели in-vitro показали, что введение iPSCs внутрисосудистым или фигуральным (tropical) способом вызывает образование тератом. Однако недавнее исследование показало, что образования тератомы можно избежать путем рассеивания клеток. Исследование in vivo показало, что внутривенно распространяемые iPSCs не образовывали тератомы и перемещались в поврежденные ткани при введении ксеногенным и аллогенным иммунодефицитным и сингенным мышам (Xiang et al., 2019). При введении iPSCs следует соблюдать особую осторожность, чтобы избежать любой контаминации дифференцированными и недифференцированными iPSCs. В исследованиях, проведенных in-vivo, использовалась внутримышечная трансплантация у мышей. Поскольку при мышечной дистрофии поражаются различные скелетные мышцы, внутримышечный путь не является практичным (Beauchamp et al., 1999; Skuk et al., 2003). Возможным вариантом является только внутрисосудистый способ доставки, включая внутривенный и внутриартериальный способы доставки (Verma et al., 2010). Но проблема здесь в том, что, как и другие соматические клетки (за исключением иммунных, воспалительных и раковых), дифференцированные соматические клетки iPSCs не способны пересекать стенки сосудов и поэтому не могут быть введены внутрисосудисто. Следовательно, внутриартериальный путь считается наиболее подходящим вариантом в случае мышечной дистрофии. В настоящее время не существует доказательств внутриартериального введения миогенных предшественников, полученных из iPSCs. Трансплантация генетически исправленного миобласта, полученного из iPSCs от пациентов с LGMD, мышам с иммунодефицитом α-sarcoglycan-null показала регенерацию мышечных волокон с α-sarcoglycan (Tedesco et al., 2012). Другим существенным недостатком введения соматических клеток, полученных из iPSCs, in-vivo является то, что они не могут приспособиться к микроокружению так же легко, как iPSCs. Следовательно, применение iPSCs in-vivo не заменимо (Tedesco et al., 2012). Текущие клинические испытания iPSC-зависимых клеток для различных заболеваний, таких как наследственные сердечные аритмии (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02413450), макулярная дегенерация (UMIN000011929) (Mandai et al., 2017), болезнь Паркинсона (UMIN000033564) (Kikuchi et al., 2017), откроют путь и к терапевтическим препаратам на основе iPSC для лечения мышечной дистрофии.
5. Concluding remarks


У пациентов с DMD и BMD наиболее распространенными мутациями являются делеции, и различные варианты делеций в разных экзонах, которые могут приводить к различной тяжести заболевания. В большинстве случаев тяжесть мышечной дистрофии зависит от того, является ли делеция вне рамки или в рамке считывания. Эти недавно обнаруженные делеции экзонов могут быть направлены на восстановление рамки считывания путем конструирования для них AONs. Мутации в других генах, кодирующих белки (саркогликан, дистрогликан) DAPC, также могут приводить к различным типам мышечных дистрофий, нарушая связывание цитоскелета с сарколеммой. Мутации в генах, кодирующих такие белки, как Emerin, Calpain и Telethonin, которые прямо или косвенно играют важную роль в поддержании стабильности сарколеммы, также могут вызывать различные типы мышечных дистрофий с разной степенью тяжести. В будущем эти мутационные гены, которые вовлекают различные мышечные дистрофии, могут стать целью на исправление их дефектов. Из-за дефицита дистрофина при DMD пациенты более подвержены сердечно-сосудистым и респираторным проблемам, влияющим на качество и продолжительность жизни. Хроническое воспаление также приводит к повреждению и нарушению функции мышц, вызванному производством ROS и активацией NF-kB, которые могут быть наиболее подходящими терапевтическими мишенями для лечения. Терапевтические средства с противовоспалительными и антиоксидантными свойствами показывают лучшие результаты, в то время как стероиды, такие как глюкокортикоиды, показывают лучшие результаты в развитии и функционировании мышц, но имеют серьезные побочные эффекты. Препараты, направленные на подавление воспаления и обладающие меньшими побочными эффектами, могут увеличить продолжительность жизни людей с дефицитом дистрофина. Кроме того, iPSCs в лечении мышечной дистрофии дают многообещающий прогноз для клинических испытаний, но в настоящее время они еще нигде не применяются на практике. Основными проблемами, препятствующими его развитию, являются успешное введение миогенных предшественников, полученных из iPSCs, и сохранение достаточного количества жизнеспособных клеток при введении. Эти клетки должны физически интегрироваться в конкретную ткань хозяина для выполнения своей функции, и не должно быть иммунного ответа против введенных клеток. Выживание клеток в организме хозяина после определенного способа доставки клеток устанавливает предел использования миогенных предшественников, полученных из iPSCs, in-vivo. Изменение среды и воспаление во время доставки разрушает значительное количество клеток, что снижает количество жизнеспособных клеток сразу после имплантации. Этого можно избежать, поместив клетки в физический каркас (Bhang et al., 2007). Такие какркасы выполняют две основные функции: удерживают клетки вместе в месте инфекции, а также дают клеткам время для адаптации к новой среде, сохраняя при этом жизнеспособность, но необходима разработка каркаса (одобрение FDA остается серьезной проблемой). Исследования in-vivo на мышах mdx показали, что миогенные предшественники после приживления в миофибриллах хозяина способны к регенерации мышц, а также к восстановлению дистрофина (He et al., 2020). Это исследование открывает дверь для будущего применения клеточной терапии у человека. На данный момент DMD может быть преобразован в BMD путем пропуска экзонов или путем разделения экзона, который в основном отвечает за делецию, нарушающую рамку считывания. Подходы CRISPR-Cas9 и AONs показали эффективные результаты в восстановлении рамки считывания белка, что делает их потенциальным подходом к лечению DMD путем преобразования DMD в BMD.