CRISPR оказала огромное влияние на биомедицинские исследования, особенно в области генотерапии. Спустя 8 лет после публикации важной статьи относительно CRISPR-обеспечиваемого редактирования генов лауреатами Нобелевской премии по химии в 2020 Drs. Jennifer Doudna и Emmanuelle Charpentier, она оказала основательное влияние.¹

Одним из основных уроков открытия CRISPR открытия стал подход по использованию мощных прокариотических молекулярных инструментов для достижения терапевтических генетических изменений в клетках человека. После этого примера исследователи генотерапии искусственно разработали множество эффективных и разносторонних версий CRISPR технологий.

Прежде всего обратим внимание на обзор Dr. David Liu из Harvard Medical School, чрезвычайно творческого пионера в этой области, который открыл две совершенно новых подобласти в редактировании генов, редактирование оснований и prime редактирование (See page 237). Используя преобразование белков он осуществил слияние энзимов cytosine deaminase и adenine deaminase с измененной версией Cas9. Это слияние комбинирует специфичность нацеленной на РНК последовательности ДНК Cas9 со способностью энзима деаминазы превращать C-в-T или G-в-A в геноме хозяина. Не останавливаясь на достигнутом, доктор Лю расширил это изобретение еще более универсальным изобретением - слиянием Cas9 с обратной транскриптазой, такая комбинация которая позволяет эффективно переписывать любую последовательность в геноме хозяина. Его обзор дает невероятно проницательный взгляд на эти разработки, а также на будущее этой отрасли.

Т. наз. CRISPR-транс-активаторы (CRISPRa) и CRISPR-ингибиторы (CRISPRi) представляют собой смелые новые достижения базирующихся на Cas РНК-управляющие энзимами, меняющими гены. Обзор Lek et al. описывает эти изобретательно разработанные энзимы.² Оригинальную CRISPRa технологию они описывают как содержащую Streptococcus pyogenes Cas9 RuvC и HNH домены с точечными мутациями, чтобы деактивировать активность эндонуклеазы, слитой или с транс-активатором транскрипции (в случае CRISPRa) или репрессором транскрипции (в случае CRIPSRi). Согласно их описанию имеется множество вариантов этих мультидоменовых слияний, использующих др. домены RNA guidance, которые непосредственно или активируют, или репрессируют гены, или домены, которые обеспечивают эпигеномные модификации. Как показывает обзор Lek, CRISPRa подход успешно используется в качестве инструмента для исследования путем скрининга генома и в качестве потенциального терапевтического подхода. Особенно интересным является использование CRISPRa для лечения нарушений одиночных генов, вызывающих гаплонедостаточность, таких как синдром Dravet.²

Фокусом этих двух обзоров данного номера является непосредственное редактирование генов in vivo. Как отмечается в обзоре Dasgupta et al. манипуляции аутологичными клетками ex vivo путем редактирования генов, безусловно, является мощной технологией, но прямая доставка инструментов редактирования генов в органы-мишени in situ может соответствовать гораздо более широкому спектру потенциальных использований.³ По крайней мере, некоторые уровни осуществимости были продемонстрированы для этого подхода в нескольких разных системах органов у животных моделей, напр., с доставкой базирующегося на recombinant adeno-associated virus (rAAV) аппарата для редактирования генов в печень и мышцы. Способность продвигать редактирование генов in vivo для типов клеток, которые не являются хорошими кандидатами для долгосрочной традиционной генной терапии rAAV in vivo, такие как гемопоэтические стволовые и клетки предшественники, может сформировать важную нишу для передового использования CRISPR в будущем.

Наиболее успешные программы для редактирования генов in vivo использованы при болезнях сетчатки, которым посвящен обзор Quinn et al.⁴ Как показано в этом обзоре, глаза представляют собой идеальную мишень, для редактирования генов in vivo, поскольку это небольшая, доступная и самодостаточная мишень. Они также довольно иммунно привилегированы, поэтому избегают иммунной реакции на происходящие из бактерий Cas9 белки.⁴ Прирожденные преимущества глаз в редактировании генов in vivo отражаются тем фактом, что они всё больше вызывают предпочтения перед др. подходами к редактирования генов, достигая клинических стадий испытаний, напр., в EDIT-101 испытании от Editas Medicine. Авторы также указывают на условия, при которых может потребоваться prime редактирование в качестве процесса CRISPR следующего поколения для лечения заболеваний сетчатки, вызванных гаплоинфекцией.

В статье Zhang et al. из Oregon Health Sciences Center изучали ряд переменных, которые могут влиять на редактирования генов in vivo, используя мышиную модель наследственной tyrosinemia type 1, модель, для которой возможность редактирования генов in vivo была уже продемонстрирована.⁵ Их окончательное заключение показывает, что подход с двойными rAAV, обеспечивающими Cas9, sgRNA и гомологичную матрицу может обеспечивать коррекцию у 7-20% новорожденных мышей и у меньшего количества взрослых мышей.

Статья Li et al. из Wenzou Medical University и его nationally leading Wenzhou Eye Hospital описывает новую систему оптимизации условий для homology-directed repair (HDR) с помощью разных энзимов редактирования. Они использовали стратегию мутантного green fluorescent protein (GFP) репортера, при этом только точное HDR редактирование мутантного GFP (внедренного в клетки хозяина в сайт AAVS1) должно восстанавливать экспрессию GFP.⁶ Это делает возможным прямое сравнение эффективности HDR в клетках с разными Cas энзимами и оптимизирует условия для HDR.

В этом номера рассматриваются более мощные инструменты для генотерапии. Оригинальная концепция CRISPR-Cas9-обеспечивающей целенаправленное редактирования генов коротких гид (guide) РНК, чтобы вызывать сиквенс-специфические разрывы двойной нити ДНК, чтобы вызывать нокаут генов посредством nonhomologous end joining или репарировать их с помощью HDR. CRISPR технологии следующего поколения, представленные здесь, расширяют свой репертуар, включая base editing, prime editing, CRISPRa иd CRISPRi. Теперь они используются как in vivo, так и ex vivo. В будущем представляется неизбежным, что эти инструменты и подходы будут составлять все возрастающую долю испытаний генной терапии человека и, таким образом, откроют двери для успешной терапии пациентов, чьи болезни в противном случае могли бы никогда не поддаваться лечению.