Посещений:
РЕДАКТИРОВАНИЕ ПРАЙМЕРОВ



Новый подход к редактированию мутантных генов

Prime editing – an update on the field
• Janine Scholefield & • Patrick T. Harrison
Gene Therapy volume 28, pages396–401 (2021)



При генотерапии мы постоянно следим за развитием исследований, отмечая те технологии, которые продвигают цель переноса в клинику успехов в этой области. В одной из самых захватывающих публикаций по редактированию генов, "меняющих иголку", опубликованных в 2019 году, Дэвид Лю и др. (который был пионером редактирования оснований; BE [1]) разработали "Prime editing (PE) [2]", удалив несколько ограничений CRISPR, которые наталкивались на узкие места в этом терапевтическом и биотехнологическом подходе. Традиционные стратегии редактирования генов, управляющие конкретными изменениями в самой последовательности генома, в значительной степени удовлетворительны на общем этапе - создании двухцепочечных разрывов (DSB) для привлечения и использования механизма репарации ДНК для выполнения желаемого исправления. Эта необходимая "травма" клетки одновременно способствует возникновению многих проблем при переносе редактирования генов в клинику. Именно здесь BE, а теперь и PE, представляют собой технологические точки зрения на пути к продвижению лечения пациентов. Другими словами, прощайте DSBs и здравствуйте ники (nicks). Таким образом, благодаря повышенному потенциалу точности PE мы можем еще больше в большей степени ускорить клиническое редактирование генов.

Back to basics - the operational components of PE


Система PE сохраняет специфичность нацеливания CRISPR, но несет с собой дополнительный груз в виде матрицы РНК, содержащей исправления, как непосредственное продолжение направляющей РНК (известной как pegRNA), и обратную транскриптазу M-MLV (RT), слитую с С-концом никазы Cas9 (H840A). Использование никазы Cas9 позволяет избежать образования DSB, она просто вырезает из некомплементарной нити ДНК три основания выше сайта PAM. В результате этого подвергается воздействию участок (свободная створка) ДНК со стороны 3' OH-группы, которая соединяется с primer binding site (PBS) матричной РНК, и выступает в качестве праймера для обратной транскриптазы (RT), которая удлиняет 3' участок створки, редактируя последовательность pegRNA (рис. 1). Несмотря на то, что этот расширенный 3' болтающийся лоскут термодинамически менее склонен к гибридизации с неотредактированной комплементарной нитью по сравнению с неотредактированным 5' лоскутом, присущее эндогенной эндонуклеазе FEN1 предпочтение вырезать 5' лоскуты приводит к тому, что гибридизация отредактированного 3' лоскута становится более предпочтительной, что приводит к высокоэффективному редактированию оснований. И это стало PRIME версией 1.0.

Fig. 1: Prime editing in five steps.

Prime editing has just two components, a Cas9 nickase fused to a modified reverse-transcriptase (referred to as PE2) and a multifunctional prime editing guide RNA (pegRNA). 1 The Cas9-H840A/pegRNA complex binds to the desired target region and creates a nick 3' bp upstream of the PAM site. The nick must be upsteam of the first variant site (in this case a TGA stop codon) and occurs on the same strand as the PAM liberating a 3' flap. 2 This 3' flap forms a sequence-specific interaction with the 14-16 nt "primer binding site" located at the 3' end of the pegRNA. This RNA/DNA hybrid serves as the PRIMEr site for new DNA synthesis using the RNA "edit site" as a template; the modified RT polymerase copies the template thereby extending the 3' flap. 3 The edited 3' flap displaces the variant unedited 5' flap, which is removed by a cellular nuclease FEN1. 4 In this example, this leaves two MisMatches to be resolved, one in the edited codon (G≠T), and one in the modified PAM (C≠C) which can be introduced as an option to prevent further editing to the corrected sequence. 5 MisMatch Repair resolves the DNA resulting in either precisely edited DNA (with no indels), or the original variant sequence. In the latter case where the PAM sequence has not been modified, the Cas9-H840A/pegRNA complex can bind to the variant sequence again and have another attempt at PRIME editing. Key: Cas9-H40A nickase shown in Green, Reverse Transcriptase in yellow. The PAM site is highlighted in a grey box; the pegRNA in blue; the 3' edit site in red; the edited PAM site in bold; FEN1 in grey. For clarity, only part of the pegRNA is shown in step 1.

В результате серии искусственных преобразований изменения в последовательности RT (PE2) приобрели существенные улучшения в эффективности редактирования, при этом обнаруживались очень низкие уровни случайных insertions/deletions (indels). Финальной ступенью процесса редактирования становится устранение (resolution) короткого гетеродуплексного региона ДНК, который возникает как результат прямого редактирования только одной нити ДНК. Это может разрешаться естественным образом в пользу желательного процесса редактирования с приемлемой высокой эффективностью. Но авт. показали, что совместная трансфекция стандартной gRNA, нацеленной на комплементарную нить позволяет H840A Cas9 выщеплять (nick) из нередактируемой нити и это склоняет репарацию несовпадающих (mismatch) ДНК в пользу редактирования последовательности за счет использования редактируемой нити ДНК в качестве матрицы для завершения процесса. Единственным недостатком использования PE3 стратегии является легкое увеличение образования indel на обеих нитях ДНК, из которых вырезки (nicked) возникают приблизительно в одно и то же время. Чтобы решить этот вопрос, gRNA может быть создана для распознавания комплементарной нити ДНК, только когда произойдет PE3 редактирование. В небольшом количестве тестируемых случаев, эта исправленная стратегия (PE3b), может усиливать редактирование, но с образованием уменьшенного количества indel, особенно относительно уровня, наблюдаемого при PE2 редактировании.
Талантливая комбинация преобразованных компонентов молекулярной биологии приводит к ряду преимуществ, в дополнение к высокой эффективности редактирования путем использования замен одиночных оснований. В то время как их предыдущие стратегии BE предоставляли механизм для создания замен одиночных оснований для 4-х переходов (C>T; T>C; A>G; G>A), недавние исследования расширили это, включив ещё две трансверсии (C>G и G>C [3-5]), PE заключает все потенциальные 12 модификации, включая 8 трансверсий. Это обеспечивает значительно более быстрый процесс разработки терапевтического редактирования для любой болезни, вызываемой изменением одной пары оснований, также как и потенциал для исследователей, чтобы моделировать любой SNP in vitro. PE кроме того позволяет эффективную продукцию небольших делеций и инсерций, расширяя возможности этого инструмента, чтобы охватить почти 90% болезнь-вызывающих мутаций. В одном случае, PE3, как было установлено, вносил замены одиночных оснований вплоть до 34 bp ниже места nicking, вследствие чего NGG PAM могла оказаться расположенной на весьма близком расстоянии от сайта мишени. Это в дальнейшем позволило одиночной pegRNA корректировать разные мутации в регионе горячей точки гена. Терапевтическое значение того, что одна и та же pegRNA может быть использована для коррекции небольшого круга болезнь-вызывающих вариантов у разных пациентов. Напр., при cystic fibrosis, два из трех наиболее распространенных вариантов PTC, G542X и R553X (ни один из которых не может быть излечен сегодня с помощью доступных CFTR модуляторов) расположены на расстоянии 33 нуклеотидов в одном и том же экзоне, поэтому одиночная pegRNA может в принципе корректировать любой из вариантов.
Вторым главным преимуществом системы PE является то, что она снижает потребность в разрывах двойной нити (DSB) для аппарата репарации, который безусловно склонен к ошибкам . Liu et al. продемонстрировали, что indels становятся редким событием, достоверно превосходя количественно в точном редактировании, измеряемом как процент от общего sequencing считываний - что противоположно тому, что происходит при классической гомологически-направленной репарации Cas9 (HDR), где indels часто являются преобладающим результатом [6]. (Хотя indels все еще встречаются, их частота по крайней мере на один порядок меньше, чем при HDR). Более того, эффекты вне мишени, предполагаемые в предсказанных областях генома, практически не обнаруживались по сравнению с Cas9 DSB-зависимыми системами репарации. Эти результаты чрезвычайно интересны, т.к. нежелательные изменения в геноме (вызываемые как indels, так и эффектами вне мишени) имеют важное значение для терапевтического редактирования генов в клинике.
Кроме того, в оригинальном исследовании описан удивительный эксперимент, которые преодолел узкое горлышко в репарации пост-митотических клеток. До сих пор почти все стратегии точного репарирования обычно нуждались в матрице для репарации, они д. были использовать эндогенный аппарат репарации HDR, ограничивающийся делящимися клетками. это и было узким горлышком в терапевтических приложениях редактирования генов, особенно при многих нейрологических заболеваниях с мутациями, которые затрагивают пост-митотические нейроны. Однако, поскольку PE не нуждается в аппарате HDR, то точные геномные замены обнаруживаются (хотя и с низкой частотой) в первичных кортикальных нейронах мышей. При этом многие болезни обнаруживали в преклинических исследованиях положительные результаты благодаря преодолению уровней минимального порога клеточной репарации, а даже скромные уровни коррекции генов могут вызывать клиническое улучшение.
Когда эта блестящая работа была опубликована, то этот подход стали рассматривать как принципиально наиболее перспективный в области редактирования генов с момента открытия CRISPR [7]. Однако, поскольку исследователи во всем мире кинулись приобретать PE плазмиды, то вскоре дополнительные данные покажут, насколько подходит этот изысканный молекулярный инструмент в действительности для терапевтического продвинутого инженеринга генома, а также какие неотъемлемые трудности связаны с системой PE. Напр., даже в самой простейшей своей форме он высоко модульный - нуждается в оптимизации множественных компонентов. Кроме того, как и в случае со многими сиквенс-специфическими технологиями необходима существенная оптимизация pegRNA.
В ряде последних исследований решается вопрос, как PE может эффективно использоваться для репарации и у моделей с вариантами, вызывающими болезнь, в клетках, органоидах и мышиных эмбрионах, и ряд новых online инструментов был разработан, чтобы помочь видоизменять pegRNAs.

Editing mammalian cells and organoids


Efficiency of repair


Одной из ближайших целей каких-либо усовершенствований GE является эффективная репарация, как это диктуют стратегии доставки в своем стремлении к клинике, т.е. высокая эффективность репарации может быть обеспечена успехами in vivo систем доставки, пока же очень низкая эффективность неизбежно влечет за собой ex vivo подход. Поскольку PE не опирается на HDR, то эффективность коррекции аллелей является важным показателем, с помощью которого новые исследования могут предоставлять критическую информацию. Schene et al. оценивали PE3 редактирование в стволовых клетках людей в моделях болезней, моделях органоидных культур и установили, что эффективными являются целенаправленно вызванные делеции вблизи сайта PAM, а индукция специфических модификаций трансверсий (C > G) происходит в положении +26 [8]. Для двух исследованных локусов они наблюдали эффективность редактирования в 30-50%. они также продемонстрировали коррекцию болезнь-вызывающих in-frame делеций и сдвиг рамки считывания с последующим восстановлением нормальной функции в клетках, моделирующих болезнь Wilson's и дефицит DGAT1 с эффективностью более 20%.
Исследование Surun et al. продемонстрировало, что PE также работает эффективно (3-6%) в iPS клетках людей, превращая eGFP в CFP путем целенаправленного воздействия на последовательность ди-нуклеотдов [9]. Rousseau et al. сообщили, что использование BE цитозина для создания варианта Ala673Thr, вызывающего болезнь Альцгемера, в гене APP оказалось успешным, но сопровождалось многочисленными побочными модификациями C > T [10]. Напротив, PE позволило им в точности получать вариант Ala673Thr, хотя эффективность редактирования была намного ниже, чем при CBE. Потом они сообщили, что второй раунд PE может быть использован для повыщения эффективности редактирования. Guerts et al. сообщили в BioRxivs, что PE может корректировать большинство из широко распространенных мутаций, вызывающих CF, и более чем в 30-раз менее эффективно, чем использование HDR, selection-based метода скрининга [11]. Далее они осуществили head-to-head сравнение Adenine BE, Prime и HDR, используя Arg785X вызывающий CF вариант и показали, что ABE ~6-раз более эффективно, чем PE или HDR.

Ratios of correct editing to unwanted byproducts


'Цена' эффективного редактирования часто может измеряться частотой возникновения побочных продуктов, включая bystanders и indels. Schene et al. критически оценивали возникновение нежелательных продуктов при pegRNA или PE3 sgRNA в сайтах мишенях, возникающих с низкой частотой 1-4%, как в линиях стволовых клеток, так и просто клеток - порядок величин был ниже, чем желаемая эффективность редактирования [8]. При head-to-head сравнении исправлений, отношение корректирующего редактирования к формированию indel было в 30 раз выше при PE по сравнению с Cas9-HDR, сходные значения получили Anzalone et al. [2]. В своем сигнальном экземпляре, Kim et al. попытались корректировать G > A мутацию на 3' конце экзона 8 гена Fah, которая нарушает сплайсинг [12]. Были тестированы три разные комбинации ABE/gRNAs и bystander редактирование соседних A's, которое происходило на более высоком уровне, чем в мишени A. Напротив, PE корректировало мутацию с не обнаружимым bystander эффектом, несмотря на общую эффективность, более низкую, чем при ABE.

Off-target effects


Третьим (и вообще-то наиболее важным) фактором, действующим как узкое место в переносе технологии GE в клинику является предсказание и оценка эффектов вне мишени. Отсутствие образования DSB обещает важный достоверный слой безопасности для базирующейся на PE терапии. Schene et al. оказались неспособны обнаружить какие-либо редактирования вне мишени после анализа последовательностей по всему геному.
В целом эти исследования подтвердили, что там, где BE происходит без bystander эффектов, то BE всегда осуществляется лучше, чем PE - наблюдение впервые было отмечено Anzalone et al. Однако, если мишенью является сдвиг рамки считывания, и возникают indel или сайты с потенциальными bystander мишенями, то PE наиболее подходящим воздействием со значительно большим числом редактирования относительно indel, чем при HDR.

Editing in mice embryos


Оригинальные работы по PE продемонстрировали не только высокую эффективность исправлений во многих типах клеток, и одновременно выявили очень мало indel мутаций [2]. Это особенно важно для in vivo и было использовано Liu et al. , которые использовали PE3 систему для исправлений мутаций в гене Hoxd13 у мышиных одноклеточных эмбрионов, гомологичного клинически важному гену у людей [6]. Анализ отредактированных бластоцистов выявил редактирование в пределах 1-19%, в результате возникали детеныши с варьирующими уровнями редактирования в разных тканях, демонстрируя соматический мозаицизм.
В широком круге предварительных исследований PE на мышах, Aida et al. использовали PE3 редактирование, чтобы прицельно воздействовать на 6 разных локусов [13]. Пока они сообщили об эффективном редактировании, они описали высокую частоту нежелательных исходов, особенно делеций, соответствующих пространству между двумя nicks. После удаления вызывающей nicking sgRNA, PE2 подход устранял делеции, но вызывал и снижение редактирования. Работая внутри одного и того же локуса, на с разными сайтами, подход PE3b привел к эффективному редактированию, так что нежелательные indels более не обнаруживались в большинстве случаев.
Недавно Gao et al. сравнили HDR и PE2 при редактировании сайта связывания CArG box транскрипционного фактора у мышей [14]. Анализ мышей основателей выявил почти вдвое больше успешных редактирований у животных с HDR (20/37) в противовес PE2 (12/47). Однако, не обнаружено и следов редактирования вне мишени у PE2 животных, тогда как многие HDR основатели имели изменчивые уровни indels в мишенях. Кроме того, 5 из 11 HDR мышей основателей обнаруживали редактирование вне мишени, тогда как ни одного не отмечено PE2 животных.

Design and optimisation of pegRNAs


Оригинальное исследование Anzalone et al. подчеркнуло необходимость оптимизации pegRNA, в частности рекомендовалось тестирование разных pegRNAs с PBS и RTT разной длины. Несколько недавних сообщений описывают дальнейший анализ дизайна pegRNA и было сделано несколько сходных заключений о небольших улучшениях. Напр., в результате анализа оценки высокой производительности PE2 редактирования, Kim et al. рекомендовали следующие pegRNA: 13-nt PBS и 12-nt RTT, GC-богатый PBS и включающий G в качестве последнего nt в матрицу когда RTT уже содержт ~12-nt [15]. Они также подчеркнули важность, если можно, использование RTT для разрушения PAM, и предложили подход уже используемый в нескольких исследованиях, описанных выше. Однако, считается, что длина PBS , скорее всего, зависит от контекста последовательности, т.к. некоторые исследования продемонстрировали, что длина PBS в 10-12 наиболее эффективна [8, 9].
Так, инструмент преобразования, такой как multicrispr, который совместим с PE и потенциально в будущем станет новым инструментом редактирования магистрали, такой как Cas9-transposases, уже доступен [16]. Один из опубликованных web-инструментов включает обнаруживающий peg, который выбирает места и предоставляет последовательности из олигонуклеотидов для клонирования [17].
Два исследования описывают автоматизированную разработку pegRNAs с перекрестными ссылками на ClinVar базу данных, как откорректированных вариантов, вызывающих болезнь, для терапевтического использования, так и для создания их для моделирования болезни [18, 19]. Кроме того, Hsu et al. показали, что PrimeDesign может быть использован для геномного и насыщающего скрининга мутагенеза. PrimeDesign позволяет пользователям разрабатывать PE3b nicking guideRNAs (ngRNAs), которые разрушают или засевают последовательности из ngRNA spacer, или разрушают non-seed последовательности из ngRNA spacer. Авт. полагают, что PE3b seed ngRNAs могут обладать более высокой специфичностью в формировании вырезок (nicking) из не отредактированной нити после образования (resolution) редактированной створки нити и могут тем самым оказаться более подходящими, чем PE3b non-seed ngRNAs.

Engineered Cas9-RT with increased PAM flexibility


Модулярная природа PE может рассматриваться как обоюдно-острый меч, в котором ряд компонентов может быть оптимизирован, специфические участки могут быть 'swapped out' (устранены), чтобы гарантировать приспособляемость. Чтобы повысить пользу от PE2 редактирования, Kweon et al. замещали разные варианты Cas9 с измененной PAM специфичностью и оценивали их влияние на PE2 редактирование в пределах разных геномных сайтов [20]. Они сообщили об успешном редактировании с вариантами, обозначенными как PE2-SpG, PE2-NG и PE-SpRY, тем самым расширили покрытие пригодных для воздействия патогенных вариантов в ClinVar базе данных, которые теперь могут быть prime edited до 94.4%.

Conclusions


Whilst the seminal paper by Anzalone et al. describing PE garnered a great deal of excitement for those of us in the gene therapy field, it was acknowledged that the multiple components necessary to execute PE required significant optimisation. What is clear from our perspective is that in just over a year a plethora of studies is advancing this tool by producing user-friendly design tools, which will enable researchers to harness this method. Encouragingly, we see data emerging that PE works in multiple cell types, organoids and mice embryos. Interestingly, there are also indications that editing in embryos may employ slight differences in DNA repair pathways. PE has also had a significant impact on the bioengineering of plants, where prime-editing efficiency appears linked to optimising pegRNA expression, but these are discussed elsewhere [19].
Despite perhaps being the second choice to BE in a few scenarios, with its ability to target >90% of pathogenic variants in the ClinVar database, it seems inevitable that PE is destined for clinical implementation in the not too distant future. As with the exciting appearance of CRISPR Cas transposases [21] advancements in PE will be continue to be monitored by Gene Therapy with great anticipation.