Advances in gene therapy and their application to skin diseases: A review
 Journal of Dermatological Science Volume 103, Issue 1, July 2021, Pages 2-9 | |
|---|---|
|
αGLA
α-galactosidase A
AAV
adeno-associated virus
ASO
antisense oligonucleotide
COL7A1
collagen type VII ?-1 chain
CBCL
cutaneous B-cell lymphoma
CR
complete response
CRISPR/Cas9
clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9
CTCL
cutaneous T cell lymphoma
DEB
dystrophic epidermolysis bullosa
DSB
double-strand break
EB
epidermolysis bullosa
EBGraft
gene-corrected autologous skin-equivalent grafts (EB patients)
gRNA
guide RNA
HIV
human immunodeficiency virus
HR
homologous recombination
HSV
herpes simplex virus
IL2RG
interleukin 2 receptor subunit ?
JEB
junctional epidermolysis bullosa
LAMB3
laminin subunit ?3
LTR
long terminal repeat
MLV
Moloney murine leukaemia virus
NHEJ
non-homologous end joining
NS
Netherton syndrome
PR
partial response
RDEB
autosomal recessive dystrophic epidermolysis bullosa
SCID
severe combined immunodeficiency
SIN
self-inactivating
SPINK5
serine peptidase inhibitor Kazal-type 5
T-VEC
talimogene laherparepvec
TALEN
transcription activator-like effector nuclease
ZFN
zinc finger nuclease
|
В 1990-х годах было проведено первое клиническое испытание генотерапии на пациенте с аденозиндезаминазным тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) [1]. В 2000 году были проведены испытания генотерапии Х-сцепленного SCID, вызванного мутациями субъединицы рецептора интерлейкина 2 γ (IL2RG) были проведены с использованием гамма-ретровирусного вектора, содержащего кДНК IL2RG в гематопоэтических стволовых клетках [2]. Впоследствии были обнаружены Т- и естественные клетки киллеры, экспрессирующие IL2RG, однако, сообщалось о неблагоприятных случаях лейкемии, вызванных инсерционным мутагенезом [3]. Более того, в 1999 году был зарегистрирован первый случай смерти, связанный с генотерапией, у пациента с дефицитом орнитин-транскарбамилазы, который умер от синдрома системного воспалительного ответа, вызванного сильной активацией врожденной иммунной системы в результате системного введения аденовирусных векторов [4]. После этих неблагоприятных событий клинические исследования в области генотерапии застопорились; однако исследователи продолжали разрабатывать более безопасные и эффективные трансгенные векторы. В последнее время генотерапия вновь привлекла к себе повышенное внимание, и клинические испытания проводятся по всему миру. В дерматологической области клинические испытания генотерапии также проводились при различных заболеваниях кожи, поскольку она легкодоступна, что делает ее привлекательной тканью для генотерапии. Однако разнообразие заболеваний, которые были исследованы, затрудняет определение текущего состояния использования этого метода в дерматологии. Поэтому данный обзор посвящен отдельным методам переноса генов и описывает текущий статус генотерапии в дерматологии в соответствии с каждой технологией. 2. Gene-transfer techniques Помимо терапевтических стратегий ex vivo и in vivo, генотерапия требует учета типа клеток-мишеней, размера вводимого гена, необходимости стабильной экспрессии гена (даже после деления клеток), а также выбора более безопасных и эффективных систем доставки генов. Для устранения этих ограничений были разработаны различные технологии переноса генов, среди которых широкое применение в генотерапии получили вирусные векторы. 2.1. Ретровирусные (гамма-ретровирусные и лентивирусные) векторы Ретровирусы делятся на три основных типа: онко-ретровирусы, спумавирусы и лентивирусы [например, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)]. Онко-ретровирусы подразделяются на пять подтипов, включая гамма-ретровирусы [например, вирус мышиного лейкоза Молони (MLV)] (рис. 1A) [5,6]. Основной характеристикой ретровирусов является то, что вирусные гены интегрируются в геном хозяина, что приводит к стабильной экспрессии генов, трансдуцированных ретровирусными векторами, во всех дочерних клетках [7]. Другой особенностью ретровирусов является относительно большой размер генов, загружаемых в векторы (~9 kb), что позволяет вводить самые разнообразные гены. Гамма-ретровирусы могут быть трансдуцированы только в делящиеся клетки, что делает гамма-ретровирусы благоприятными для терапии только ex vivo из-за низкой частоты митозов в популяции эпидермальных стволовых клеток in vivo, необходимых для долгосрочной экспрессии трансгенов в восстановленной ткани кожи [5].
Fig. 1. Structures and construction of gammaretroviral, lentiviral, and adeno-associated viral vectors (A) Структуры ретровирусного вектора (гамма-ретровирусного вектора). Показаны вирус лейкемии человека (MLV) и ретровирусный вектор. Геном гаммаретровируса состоит из трех кодирующих доменов (gag, pol и env), фланкированных 5' и 3' длинными терминальными повторами (LTR). Праймер-связывающий сайт (PBS) и упаковочная сигнальная последовательность (Ψ) необходимы для инициации обратной транскрипции и интеграции генома вирусной РНК в белок сердцевины вируса, соотв. Эти элементы, необходимые для репликации вируса дикого типа, кодируются в вирусах на одном и том же геноме. Для предотвращения производства репликационно-компетентного вируса базовые ретровирусные векторы в основном были разработаны для экспрессии терапевтических генов, за исключением вирусных генов (gag, pol и env), которые поставляются в транс положении вместе с клетками для упаковки трансгена, полученными из соотв. клеточных линий. Структуры лентивирусного вектора. Показаны структуры вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и лентивирусного вектора. В дополнение к компонентам, необходимым для гаммавирусного вектора, последовательности лентивирусного вектора включают элемент ответа rev (RRE) и центральный полипуриновый тракт (cPPT). Производство лентивирусов обычно включает транзиторную трансфекцию Т-клеток HEK293 четырьмя плазмидами, отдельно экспрессирующими gag-pol, env, rev и интересующий ген. Поскольку вектор ВИЧ-1 инфицирует клетки по тому же механизму, что и ВИЧ, его можно специфически трансфицировать в CD4+ клетки человека. Поэтому псевдотипирование с использованием гена оболочки другого вируса может быть проведено для увеличения типов клеток-хозяев, которые могут быть инфицированы вектором ВИЧ-1. Белок G вируса везикулярного стоматита (VSV-G), который связывается с фосфолипидами и рецепторами липопротеинов низкой плотности, экспрессированными на поверхности большинства клеток млекопитающих, широко используется для опосредованного переноса вирусного вектора ВИЧ-1 в различные клетки. (С) Структуры AAV. AAV - это хелпер-зависимый вирус, который не может размножаться без одновременной инфекции аденовирусом в качестве вируса-хелпера. AAV имеет геномные структуры, включая Rep и Cap, которые фланкированы двумя инвертированными терминальными повторами (ITR). Репликация AAV зависит от функции помощи аденовируса: гены E1A/B, E2A, E4 и VA аденовируса имеют решающее значение. Векторы AAV получают путем трансфекции клеток HEK293 векторными плазмидами, заменяющими ген мишень между ITR, упаковочными плазмидами, экспрессирующими Rep и Cap, и хелперными плазмидами, полученными из аденовируса. 2.1.1. Gammaretroviral gene therapy for epidermolysis bullosa (EB) Клинические исследования с использованием ретровирусных векторов были проведены для лечения EB, которая является наследственным заболеванием, характеризующимся появлением пузырей на коже и слизистых оболочках под воздействием механического стресса [8]. EB классифицируется на четыре основных типа, а именно: простой EB, функциональный EB (JEB), дистрофический EB (DEB) и EB Киндлера, каждый из которых вызван генетической аномалией в одном гене, кодирующем белок, участвующий в зоне адгезии эпидермальной базальной мембранной зоны.
Первым клиническим случаем генотерапии в дерматологии был 36-летний пациент с JEB с мутациями субъединицы ламинина β3 (LAMB3) [9]. Культивируемые эпидермальные трансплантаты были созданы из эпидермальных стволовых клеток, трансдуцированных кДНК LAMB3 с помощью гаммаретровирусного вектора на основе MLV, и пересажены на раневое ложе правого бедра. В области трансплантации наблюдалось клиническое улучшение и восстановление экспрессии ламинина-332, а последующее наблюдение показало продолжение клинического ответа и нормальный уровень синтеза функционального ламинина-332 в течение 6,5 лет [10]. Впоследствии генотерапия с использованием того же вектора была успешно проведена у 49-летнего и 7-летнего пациентов с JEB [11,12]. Кроме того, аутологичные эпидермальные трансплантаты с генной коррекцией ex vivo с использованием гамма-ретровирусных векторов на основе MLV, содержащих кДНК коллагена типа VII α-1 цепи (COL7A1), были пересажены на шесть раневых участков у каждого из семи участников с аутосомно-рецессивным DEB (RDEB) (https://clinicaltrials.gov/; NCT № NCT01263379) [13,14]. Большинство обработанных участков сохранили уровень заживления более 50 % на 2- (71 %) и 3 года (80 %) после лечения [13]. 2.1.2. Self-inactivating (SIN)-retroviral and lentiviral vectors Хотя эти клинические испытания на пациентах с JEB и RDEB продемонстрировали приемлемую безопасность и переменную эффективность, оставались опасения, включая инсерционный онкогенез на основе MLV гамма-ретровируса, наблюдавшийся у пациентов с Х-сцепленной SCID [3]. Существуют две возможные причины инсерционных онкогенных мутаций под действием гамма-ретровирусного вектора. Первая - существование энхансера и промотора, расположенных в длинных терминальных повторах (LTRs) (рис. 1А). Высокая транскрипционная активность LTRs оказывает превосходный терапевтический эффект, но может также активировать гены вблизи места вставки в геном. Вторая причина связана с местом вставки гаммаретровирусного вектора на основе MLV в хромосому [15]. Поскольку интеграза MLV облегчает вставку в сайт начала транскрипции генома хозяина, то энхансер и промотор LTR могут трансактивировать прото-онкогены, если вирусный вектор вставлен вблизи соответствующих сайтов начала этих генов.
Для решения этих проблем в генотерапии недавно стали использовать лентивирусные векторы (рис. 1B) [16,17], поскольку они менее склонны к интеграции вблизи промоторных областей онкогенов, чем гамма-ретровирусы [18]. Кроме того, векторы SIN, в которых отсутствует сильный вирусный энхансер в LTR, недавно стали использоваться вместо классических ретровирусных векторов, что привело к снижению частоты инсерционных неблагоприятных событий [19]. 2.1.3. SIN-lentiviral gene therapy for Netherton syndrome (NS) Исследование 1 фазы с использованием SIN-лентивируса было проведено для лечения NS [20], редкого и тяжелого аутосомно-рецессивного кожного заболевания, вызванного мутациями сериновой пептидазы ингибитора Казаль-типа 5 (SPINK5) [21]. Клинически NS характеризуется врожденной эритродермией, специфическими аномалиями волосяных стержней и атопическими проявлениями, сопровождающимися высоким уровнем IgE. В данном клиническом исследовании ген-модифицированные эпителиальные слои были получены из аутологичных кератиноцитов, трансдуцированных SIN-лентивирусным вектором, кодирующим кДНК SPINK5 под контролем промотора человеческого инволюкрина (involucrin) (NCT01545323) [20]. Ген-модифицированные эпителиальные слои были успешно получены у трех из пяти испытуемых, причем экспрессия кодируемого SPINK5 белка (LEKTI) в ген-модифицированных эпителиальных слоях была сопоставима с экспрессией, полученной с использованием нормальных донорских кератиноцитов. Два пациента, успешно образовавшие трансплантаты, были изъяты до трансплантации, поскольку один из них стал недоступен в течение запланированного периода трансплантации, а другой считался клинически нестабильным. Оставшемуся пациенту после хирургической деэпидермизации был пересажен ген-модифицированный трансплантат площадью 20 см2 на левой передней поверхности бедра без каких-либо неблагоприятных осложнений. Копийное число вектора можно было определить через 3 месяца, а экспрессия LEKTI была обнаружена, но на более низком уровне, чем в нормальной коже, и со временем уменьшалась, став практически необнаружимой через 6 месяцев. 2.1.4. SIN-retroviral gene therapy for EB Для лечения RDEB (NCT04186650) [22,23] была проведена фаза I/II ex vivo SIN-ретровирусной генотерапии с целью лечения трех пациентов с помощью откорректированных по гену аутологичных кожно-эквивалентных трансплантатов (EBGraft). EBGraft состоял из аутологичных кератиноцитов и фибробластов, генетически скорректированных с помощью SIN-ретровирусного вектора, экспрессирующего кДНК COL7A1 под контролем человеческого промотора EF1α. В другом клиническом исследовании фазы 1 с участием четырех взрослых с RDEB проводились три внутрикожные инъекции аутологичных фибробластов, генетически скорректированных SIN-лентивирусным вектором, кодирующим кДНК COL7A1 под контролем промотора PGK человека [24]. У трех из четырех субъектов наблюдалось значительное 1,26--26,10-кратное увеличение средней интенсивности флуоресценции коллагена VII типа (COL7) в инъецированной коже по сравнению с таковой в неинъецированной коже, у двух из четырех субъектов это увеличение сохранялось в течение 12 месяцев без серьезных побочных реакций или аутоиммунных реакций против COL7. 2.2. Adenoviral vectors Аденовирусные векторы характеризуются высокой эффективностью переноса генов in vivo, способностью заражать как неделящиеся, так и делящиеся клетки, а также способностью переносить большие трансгены [25]. Поскольку трансгены, введенные аденовирусными векторами, не интегрируются в хромосомы, экспрессия генов является преходящей, и риск канцерогенеза вследствие интеграции вирусных генов в хромосомы низок. Из 70 серотипов аденовирусов, открытых на сегодняшний день, наиболее часто используемый аденовирусный вектор основан на аденовирусе типа 5. Аденовирусы имеют геном размером ~36 кб, включающий ранние (E1-E4) и поздние (L1-L5) гены, участвующие в репликации вирусной ДНК и синтезе структурных белков, соотв. [25]. Для получения вирусного вектора вектор, в котором область E1 заменена на интересующий ген, вводится в клетки HEK293, постоянно экспрессирующие белок E1, что исключает рост аденовирусного вектора, лишенного области E1, в терапевтических клетках.
Аденовирусные векторы прошли клинические испытания в качестве векторов вакцин против инфекционных заболеваний, таких как ВИЧ и геморрагическая лихорадка Эбола, поскольку сами аденовирусные векторы функционируют как адъювант, вызывающий иммунный ответ, вызванный на введение вектора [26,27]. Аденовирусные векторы также используются для онколитической вирусной терапии, направленной на опухоли и несущей иммуномодулирующие гены [25]. В этой стратегии вирус реплицируется специфическим для опухолевых клеток образом, экспрессируя белок E1 под контролем промотора специфического для опухоли гена, например, гена обратной транскриптазы теломеразы (TERT). Онколитические вирусные векторы оказывают противоопухолевое действие посредством прямого эффекта на клетки, связанного с вирусной репликацией, активации иммунной системы повреждающими молекулярными паттернами, связанными с гибелью раковых клеток, и активации иммунной системы различными цитокинами и иммуномодулирующими генами, переносимыми векторами. 2.2.1. Adenoviral gene therapy for malignant melanoma Несколько исследовательских групп провели клинические испытания аденовирусных векторов, экспрессирующих IL-2. Этот вектор стимулирует пролиферацию Т-клеток и вызывает активацию цитотоксических Т-лимфоцитов и естественных клеток-киллеров, что приводит к регрессии метастатических опухолей [28]. Одна группа провела испытание I фазы с прямой инъекцией аденовирусного вектора с удаленными E1,E3 в злокачественную меланому, причем этот вектор экспрессировал IL-2 под контролем промотора CMV [29]. В исследовании приняли участие 15 пациентов, при этом местное воспаление в месте инъекции, лихорадка, недомогание и анорексия наблюдались у восьми и трех пациентов, соответственно. Более того, у пяти из 15 пациентов наблюдалась неполная регрессия опухоли в месте инъекции, а биопсия после инъекции продемонстрировала некроз опухоли и CD3- и CD8-положительную лимфоцитарную инфильтрацию.
Мутации в гене супрессоре опухолей p53 являются распространенным генетическим изменением в раковых опухолях человека [30]. У пациентов с метастатической меланомой была проведена 1 фаза исследования с введением аденовируса 5-го типа с дефектом репликации, содержащего p53 дикого типа (SCH58500) [30] внутрь опухоли. Лечение прошли пять пациентов, четверо из которых были положительны в отношении переноса р53 дикого типа в опухолевую ткань через 2 дня после инъекции. У четырех пациентов наблюдалась стабилизация болезни в течение 1 месяца, а у оставшегося пациента - прогрессирование болезни. Побочные реакции были легкими у всех пациентов. 2.2.2. Adenoviral gene therapy for cutaneous lymphoma Для кожных лимфом были проведены клинические испытания 1 и 2 фазы, в ходе которых пациенты получали повторные введения TG1042 внутрь опухоли [31,32], не реплицирующегося аденовирусного вектора, содержащего кДНК интерферона-γ на основании его ключевой роли в противоопухолевом иммунном ответе. Девять [семь с кожной Т-клеточной лимфомой (CTCL) и два с многоузловой кожной В-клеточной лимфомой (CBCL)] и 21 (18 с CTCL и 3 с CBCL) пациент были включены в исследования фазы 1 и фазы 2 соответственно. В исследовании фазы 1 пять из девяти пациентов продемонстрировали местный клинический ответ [три полных ответа (CRs) и два частичных ответа (PRs)] [31], причем у трех из этих пациентов наблюдался системный CRs с исчезновением других неинъецированных поражений кожи в течение в среднем 3 месяцев. В исследовании фазы II 15 из 21 пациента были отобраны для анализа [32]. После повторной интратекальной терапии местные опухоли регрессировали у 50 % пациентов (три CR и пять PR), а у 33 % пациентов регрессировали и отдаленные поражения, которые не были подвергнуты воздействию. Это может отражать системную иммунную активацию после местной терапии. 2.3. Adeno-associated virus (AAV) vectors Векторы AAV не являются патогенными и могут быть трансфецированы в неделящиеся клетки [33]. Частота случайной интеграции векторов AAV в хромосомы низка. Большинство векторов AAV стабильно существуют в виде внехромосомной эписомальной ДНК, и экспрессия генов продолжается в течение длительного времени. Векторы AAV функционируют, перенося гены для редактирования и вызывая РНК-интерференции, поскольку передаваемые гены малы (менее 4,7 кб) [33]. Традиционно в качестве AAV-вектора используется серотип 2, однако в последние годы появились различные серотипы AAV (типы 1-12), каждый из которых используется избирательно в зависимости от клетки-мишени [34]. 2.3.1. Adenoviral gene therapy for Fabry disease Болезнь Фабри - это Х-сцепленная врожденная дисфункция обмена гликосфинголипидов, вызванная аномалией гена, кодирующего лизосомальный фермент α-галактозидазу А (αGLA) [35]. Дефицит αGLA приводит к накоплению гликосфинголипидов во всем организме, что приводит к прогрессирующей почечной недостаточности, сердечно-сосудистым заболеваниям, цереброваскулярным заболеваниям, периферической невропатии мелких волокон, ангиокератоме и другим симптомам. Недавно в Европе были проведены два клинических испытания с использованием рекомбинантных AAV-векторов, содержащих ген GLA (FLT190) (NCT04040049 и NCT04455230). 2.4. Herpes simplex virus (HSV) vectors HSV - это нейротропный вирус с двухцепочечной ДНК, характеризующийся большим вирусным геномом [36]. HSV демонстрирует тропизм к широкому разнообразию типов клеток и высокую инфекционность как для делящихся, так и для неделящихся клеток. Геном HSV остается эписомальным, что позволяет избежать риска инсерционного мутагенеза. Поскольку HSV экспрессирует собственную тимидинкиназу, инфицированные клетки можно лечить ацикловиром или ганцикловиром в случае непредвиденных проблем. Векторы HSV быстро распознаются и уничтожаются иммунной системой, поскольку многие люди уже имеют иммунитет к HSV. Поэтому генотерапия с использованием векторов HSV часто проводится непосредственно в очагах поражения. 2.4.1. HSV gene therapy for malignant melanoma Активно разрабатываются онколитические векторы HSV. Talimogene laherparepvec (T-VEC) - это живой, ослабленный вектор HSV-1, кодирующий гранулоцит-макрофагальный колоние-стимулирующий фактор (GM-CSF), который был генетически модифицирован для избирательной репликации в опухолевых клетках с приемлемым профилем безопасности [37]. T-VEC одобрен в США, Европе и других странах для местного лечения непригодной для резекции или рецидивирующей злокачественной меланомы [38]. В рандомизированном исследовании фазы 3 проводилось сравнение T-VEC с GM-CSF у пациентов с неоперабельной меланомой стадии IIIB, IIIC или IV, в результате которого была выявлена значительно более высокая общая частота реакции на терапию T-VEC (26,4 %) по сравнению с GM-CSF (5,7 %). 2.4.2. HSV gene therapy for EB В текущем клиническом исследовании топический гель низко-иммуногенного вектора HSV, кодирующего ген COL7A1 (KB103), наносился непосредственно на раны пациентов с ДEB (NCT03536143) [23]. В исследование включены четыре пациента с DEB, причем для каждого испытуемого отобраны три раны (две раны получат KB103, а одна рана получит плацебо). 2.5. Невирусные векторы Преимущество вирусных векторов заключается в сильной активности переноса генов, однако возникают опасения по поводу иммуногенности и безопасности. Поэтому в настоящее время активно разрабатываются невирусные векторы. В настоящее время исследуются катионные липосомы и катионные полимеры, которые способны образовывать электростатический комплекс с генами для создания частиц, называемых липоплексами и полиплексами, соответственно, которые функционируют как векторы для переноса генов. Однако их активность по переносу генов обычно слабее, чем у вирусных векторов, и требуются многократные дозы. 2.5.1. Невирусная генотерапия злокачественной меланомы Антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) - это фармакологические стратегии, которые снижают экспрессию определенных белков путем ингибирования их трансляции с мРНК [39]. Oblimersen sodium представляет собой 18-основной фосфоротиоат ASO, который связывает мРНК Bcl-2, продукт которой участвует в анти-апоптотических эффектах, связанных с повышенной устойчивостью к химиотерапии при меланоме. В клиническом исследовании у пациентов с распространенной меланомой комбинация облимерсена и дакарбазина показала тенденцию к улучшению выживаемости без прогрессирования и общей реакции [39]. 2.5.2. Non-viral gene therapy for EB АСО могут связывать последовательности РНК мишени и стерически ингибировать связывание факторов сплайсинга с пре-мРНК транскриптами, тем самым обеспечивая пропуск экзонов [40]. COL7A1 является привлекательным кандидатом для терапии с пропуском экзонов, поскольку большинство экзонов короткие и находятся в рамке считывания, это позволяет удалять их по отдельности без нарушения открытой рамки считывания. QR-313 представляет собой гель, состоящий из карбомер-содержащего ASO, разработанного для гибридизации со специфической последовательностью в экзоне 73 пре-мРНК COL7A1. Недавно было начато клиническое исследование с участием пациентов с аутосомно-доминантным DEB или RDEB, имеющих одну или несколько патогенных мутаций в экзоне 73 COL7A1. В этом исследовании QR-313 применяется местно один раз в день в течение 8 недель (NCT03605069) [40]. Помимо QR-313, компания Amryt Pharma PLC (Бостон, штат Массачусетс, США) разработала препарат для местного применения (AP103), который использует полимер [высоко-разветвленный поли(β-аминоэфир)] для доставки кДНК COL7A1 в кожу (https://www.amrytpharma.com/) [23]. 3. Genome editing technologies Обычные методы лечения с заменой генов вызывают терапевтический эффект путем введения в клетки нормальной копии мутировавших генов. Редактирование генома - это технология, которая модифицирует геномную ДНК на основе пути восстановления двунитевых разрывов ДНК (DSBs) с помощью нуклеазы, специфичной для сайта расщепления [41]. DSBs восстанавливаются двумя путями репарации (рис. 2). Негомологичное соединение концов (NHEJ) используется в отсутствие матрицы для репарации. В этом случае концы ДНК просто соединяются друг с другом, что обычно приводит к появлению небольших инсерционных или делеционных мутаций, ведущих к нарушению рамки считывания или восстановлению рамки считывания для выходящих за рамки мутаций. В качестве альтернативы может быть использован путь гомологичной рекомбинации (HR) в присутствии матрицы для репарации, имеющей гомологичные последовательности с фланкирующими областями DSB [41]. HR обладает высокой точностью и может вносить специфические изменения нуклеотидов в гены мишени. Основными технологиями редактирования генома, разрабатываемыми в настоящее время, являются нуклеаза zing-finger (ZFN), нуклеазы с эффектором, подобным активатору транскрипции (TALENs), и кластерные регулярно перемежающиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR)/CRISPR-ассоциированный белок 9 (CRISPR/Cas9) (рис. 3).
Fig. 2. Genome editing using a site-specific nuclease. DNA double-strand breaks (DSBs) induced by site-specific nucleases are mainly repaired via two pathways: non-homologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Because the target sequence is repeatedly cleaved by nucleases after repair, insertion/deletion mutations are introduced during error-prone NHEJ. However, when a targeting vector with a homologous sequence is co-introduced with a nuclease, the insertion of foreign DNA into the target sequence is enabled by HR using the homologous sequence. Fig. 3. Schematic diagram of site-specific nucleases. (A) Zing-finger nuclease (ZFN). ZFN is a fusion protein of a DNA-binding domain comprising three to six ZF motifs and the nuclease domain of the restriction enzyme FokI. Because one ZF recognises three bases, nine bases are recognised when one ZFN consists of 3 ZF motifs, and 18 bases are recognised when one ZFN consists of six ZF motifs. (B) Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) are artificial chimeric proteins that comprise a transcription activator?like effector (TALE) attached to the FokI nuclease domain. The DNA-binding domain of TALE has a repeat structure of 34 amino acids as one module, and one module recognises one base. The 12th and 13th amino acid residues in the module are called the repeat variable di-residue (RVD), with the RVD specifying base recognition. (C) Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) has two components: a guide (g)RNA that recognises arbitrary DNA sequences and a DNA-cleavage enzyme called Cas9. gRNA includes a ?100-base-long DNA-binding unit comprising trans-activating CRISPR (tracr)RNA and CRISPR (cr)RNA. Approximately 20 bases in crRNA recognize the target sequence. ZFNs - это слитые белки, состоящие из ДНК-связывающего домена в массиве ZF, содержащего от трех до шести ZF-мотивов из Ё30 аминокислот, и нуклеазного домена фермента рестрикции FokI (рис. 3A) [42]. Преимуществом ZFN является небольшой молекулярный вес, однако они не нашли широкого применения из-за сложного процесса, необходимого для их производства.
TALEN представляют собой искусственные химерные белки, состоящие из бактериального активатора транскрипции (TALE), связанного с доменом нуклеазы FokI (рис. 3B) [43]. Синтез TALEN не требует специальной технологии и широко используется; однако TALEN значительно больше ZFN, что делает невозможным их загрузку в вирусные векторы, такие как векторы AAV.
Технология CRISPR/Cas9 основана на механизме адаптивной иммунной защиты бактерий [44]. CRISPR/Cas9 состоит из двух элементов: направляющей (g)РНК, распознающей произвольные последовательности ДНК, и фермента Cas9, расщепляющего ДНК (рис. 3C). Поскольку 20 оснований в gRNA обнаруживают последовательность мишени, их значительно легче конструировать, чем ZFN и TALEN; однако gRNA могут оказывать большее внецелевое воздействие, чем TALEN, поскольку они могут распознавать сходные последовательности с несовпадением нескольких оснований в последовательностях ДНК, отличных от мишени. 3.1. Genome editing strategies for genodermatoses Более простые и эффективные стратегии генотерапии с использованием методов редактирования генома включают NHEJ-опосредованное разрушение мутантных аллелей и рефрейминг мутаций со сдвигом рамки [45]. Сдвиги рамки, вызванные NHEJ-индуцированными indels, приводят к преждевременным мутациям в терминирующие кодоны в аллеле-мишени, которые, как ожидается, разрушаются на уровне мРНК по нонсенс-опосредованному пути распада мРНК, что приводит к значительным преимуществам для пациентов с доминантно-негативными расстройствами [46]. Кроме того, путь NHEJ применим к генетическим заболеваниям, вызванным мутациями со сдвигом рамки считывания, путем восстановления рамки считывания; однако структурные изменения, вызванные аминокислотными перестановками, могут повлиять на функцию белка [47]. Недавно был разработан подход экзон-делеции для высокоэффективных стратегий перестройки генов, который позволяет удалять экзоны, содержащие мутации со сдвигом рамки считывания или нонсенс, независимым от пациента способом [45]. Две gRNAs, фланкирующие интересующий экзон(ы), доставляются вместе с Cas9 для удаления одного или нескольких мутировавших экзонов, что приводит к восстановлению открытой рамки считывания или пропуску нонсенс-мутаций путем сплайсинга соседних экзонов в рамке считывания [48].
HR является привлекательной терапевтической стратегией, поскольку она может восстанавливать DSBs с использованием матрицы донорской ДНК, тем самым восстанавливая полную кодирующую последовательность мутировавшего гена. Кроме того, промоторы, которые обычно регулируют экспрессию белка, могут быть использованы без модификаций, что позволяет нормально регулировать экспрессию гена. Однако применение технологии HR в клинической практике требует включения маркеров отбора, таких как кассеты с антибиотиками, в донорский шаблон и экспансии откорректированных по гену клеток из-за низкой частоты HR-опосредованных генных коррекций [49,50]. 4. Conclusion Различные методы генотерапии генетических заболеваний и рака разрабатываются с целью решения ряда проблем, включая высокую стоимость лечения, разработку технологий переноса генов и редактирования генома с достаточно высокой эффективностью, подавление инсерционных мутаций вирусными векторами, предотвращение внецелевого редактирования с помощью систем редактирования генома и контроль иммунного ответа на векторы для лечения in vivo. Генотерапия в дерматологии выгодна тем, что поверхностные участки могут быть клинически оценены на наличие новообразований. Поэтому ожидается, что в будущем генотерапия в дерматологии будет развиваться. Поскольку генотерапия является дорогостоящим методом лечения, а ее безопасность еще не определена, необходимо тщательно оценить необходимость и применение генотерапии, включая ее эффективность, прежде чем приступать к ее практическому использованию.
|