На протяжении десятилетий Клаудия Теста мечтала сказать своим пациентам с болезнью Хантингтона, что у нее есть для них лечение. Невролог из Университета Вирджинии Содружества Теста и многие другие члены сообщества больных болезнью Хантингтона с трепетом следили за ходом испытаний томинерсена в фазе 3. Этот препарат представляет собой антисмысловой олигонуклеотид (ASO) - короткий одноцепочечный фрагмент ДНК, предназначенный для соединения с конкретной мишенью мРНК. Томинерсен, разработанный компанией Ionis Pharmaceuticals и лицензированный компанией Roche, соединяется с мРНК, кодирующей мутантный белок хантингтин, и направляет его на разрушение в клетке. Томинерсен прошел фазу испытаний 1/2, показавших его безопасность и снижение уровня хантингтина. Поэтому, когда в марте 2021 года компания Roche объявила, что прекращает испытания томинерсена в фазе 3, Теста и другие были потрясены.

По словам Тесты, специалисты надеялись, что 2021 год станет первым годом, когда у них появится реальный терапевтический препарат, модифицирующий болезнь. "А теперь мы вернулись в бесконечность".

Промежуточный анализ данных исследования не показал никакой разницы между пациентами, получавшими интратекальное введение томинерсена каждые 16 недель, и теми, кто получал плацебо. Хуже того, оказалось, что пациенты, получавшие томинерсен каждые 8 недель, болели сильнее, чем участники контрольной группы.

"Они приняли единственное решение, которое могли принять. Они должны были остановиться", - говорит Теста.

В то же время менее масштабное исследование фазы 1/2 ASO для лечения пациентов с болезнью Хантингтона, проводимое Wave Therapeutics (от которой Теста получает гонорары за консультации), также было прекращено после того, как предварительные результаты показали, что препарат не смог снизить уровень мутантного хантингтина. Теперь компания поддерживает новый, потенциально более эффективный препарат ASO. В то время как сообщество специалистов по болезни Хантингтона оправилось от удара, две другие биотехнологические компании - Voyager Therapeutics из Кембриджа, штат Массачусетс, и uniQure из Амстердама - продвинулись вперед в испытаниях генотерапии, в которой используются адено-ассоциированные вирусные (AAV) векторы для доставки микроРНК, предназначенных для снижения токсичных уровней мутантного белка хантингтина.

Хотя проблемы безопасности и недостаточная эффективность не остановили взрывной рост числа испытаний. На сайте Clinicaltrials.gov зарегистрировано около 5000 испытаний генотерапии и более 100 испытаний ASO со всего мира - больше, чем когда-либо прежде. Но долгосрочная безопасность некоторых из этих методов лечения остается неясной.

В конце 1990-х годов казалось, что генотерапия не за горами. Ученые почти закончили секвенирование генома человека, а генная инженерия позволила им превратить вирусы, вызывающие такие заболевания, как простуда и даже СПИД, в средства доставки жизненно важных генотерапий. Идея о том, что исследователи смогут вылечить даже самые смертельные человеческие болезни, не казалась такой уж надуманной. Затем все пошло ужасно не так.

В 1999 году 18-летний Джесси Гелсингер получил инъекцию аденовирусного вектора, который нес исправленную копию его мутировавшего гена, кодирующего орнитиновую транскарбамилазу, которая вызывала редкое Х-сцепленное заболевание печени. Аденовирусный вектор вызвал подавление иммунной реакции, которая привела к его смерти через четыре дня. Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) наложило немедленный клинический запрет на испытания генотерапии, и в одночасье поле боя превратилось из обжигающего в холодное.

"Казалось, все остановилось", - говорит Роланд Херцог, иммунолог из Университета Индианы, который в то время был постдокторантом в Детской больнице Филадельфии.

Проблема заключалась не в новом гене, который нужно было вводить, а в векторе, доставляющем ген. Поиск способа безопасного и эффективного введения нового гена (или системы редактирования генов) в клетки организма по-прежнему является стержнем любого начинания в области генной терапии, говорит Дженнифер Гамильтон, постдокторант в лаборатории лауреата Нобелевской премии Дженнифер Дудна в Калифорнийском университете в Беркли.

"Доставка - это ключевой момент, который необходимо учитывать в подобных подходах", - говорит она.

Способность аденовирусного вектора вызывать сильный иммунный ответ отчасти является причиной того, что продуценты вакцин использовали аденовирус для создания вакцины ChAdOx1 против COVID-19. Но эта иммуногенность заставила исследователей обратиться к другим вирусам для доставки генотерапии. Тот факт, что ученые продолжат полагаться на вирусы, не является сюрпризом, по словам Гамильтона. "Вирусы хорошо эволюционировали, чтобы доставлять гены извне клетки внутрь", - говорит она.

Вместо аденовируса они начали экспериментировать с созданными лентивирусами, такими как ВИЧ, и с AAVs. "AAVs стали огромным достижением. Они изменили весь ландшафт генной терапии", - говорит Марк Сэндс, эксперт по генотерапии в Медицинской школе Вашингтонского университета в Сент-Луисе.

AAV остается самым популярным вектором отчасти благодаря множеству серотипов, которые способны заражать практически все виды тканей, даже неделящиеся клетки. Очень важно, что AAV, в отличие от аденовируса, редко вызывает сильный иммунный ответ, поэтому исследователи могут вводить пациентам высокие дозы вируса, которые часто необходимы для введения нужного гена в достаточное количество клеток.

"Удивительно, что в большинстве случаев можно обойтись такими высокими дозами. Это говорит о том, насколько безвреден этот вектор", - говорит Херцог.

Со временем было собрано больше информации о безопасности доклинических испытаний, и регулирующие органы приобрели опыт оценки этой информации, говорит Питер Маркс, директор Центра оценки и исследования биологических препаратов FDA. Спустя более десяти лет генотерапия, казалось, готова сделать снова первые нерешительные шаги вперед. Это, наряду с появлением инструментов редактирования генов на основе CRISPR, означало, что сначала под пристальным взглядом нервных глаз стартовало несколько испытаний, а затем сотни. Казалось, что это направление невозможно остановить.

И снова все пошло ужасно не так.

6 мая 2020 года сигналы с мобильного телефона Николь Полк разбудили эксперта по генной терапии Калифорнийского университета в Сан-Франциско за несколько часов до рассвета. У коллег возникли вопросы по поводу смерти участника испытания генной терапии ASPIRO, проводимого компанией Audentes Therapeutics. Эта биотехнологическая компания из района залива (ныне часть японской фармацевтической компании Astellas Pharma) разработала генную терапию для редкого нервно-мышечного заболевания - Х-сцепленной миотубулярной миопатии. Они ввели очень высокую дозу AAV: 3 x 10¹⁴ геномов вектора на килограмм веса тела. Впоследствии мальчик умер в результате сепсиса.

Семь недель спустя умер второй мальчик, получивший такую же высокую дозу той же генотерапии AAV. 20 августа умер и третий мальчик - все трое умерли от сепсиса. Для Паулка эти смерти стали суровым предупреждением о потенциальной опасности высоких доз AAV.

"Я не думаю, что кто-то ожидал такой глубокой реакции, которую невозможно было контролировать", - говорит она.

Она задается вопросом, который волнует всех, - не произойдет ли в этой области еще один "момент Джесси Гелсингера". Как и в случае с Гелсингером, ученые отмечали сильную токсичность в доклинических испытаниях, когда не человекообразные приматы получали высокие дозы терапии. Высокие дозы AAV также вызывали токсичность печени и иммунной системы в животных моделях и у людей, получавших генотерапию для лечения мышечной дистрофии Дюшена.

"Когда на рубеже тысячелетий произошли первые события, у нас не было такого опыта в FDA", - говорит Маркс. "Научные знания и зрелость контролеров придали нам больше уверенности. Именно поэтому эти смерти не остановили развитие отрасли, как это было в 2000 году".

В декабре 2020 года FDA сняло запрет на проведение клинических испытаний ASPIRO. "Точный биологический механизм, приведший к смерти пациентов, окончательно не установлен", - говорит Эдвард Коннер, руководитель направления генотерапии компании Astellas. "В ходе всестороннего анализа компания Astellas не выявила клинических доказательств, прямых или косвенных, того, что иммунные реакции способствовали повреждению печени".

Подробный анализ внутренних выводов компании был опубликован. Тем не менее, ученые затаили дыхание, и опасения росли по мере появления серьезных побочных явлений в других испытаниях генотерапии. В декабре 2020 года амстердамская компания uniQure сообщила, что у одного человека в фазе 3 испытаний терапии гемофилии B на основе AAV5 развилась гепатоцеллюлярная карцинома (в марте 2021 года независимое расследование исключило роль вектора). Представитель компании uniQure заявил, что детальный анализ тканей печени пациента выявил предраковое состояние из-за нескольких ранее существовавших заболеваний.

В Пенсильванском университете Дениз Сабатино с коллегами опубликовали в журнале Nature Biotechnology работу, в которой показали потенциальные проблемы с печенью, возникшие у собак почти через десять лет после того, как их лечили с помощью генотерапии AAV для лечения гемофилии А у собак. В феврале команда bluebird bio объявила о двух случаях острой миелоидной лейкемии, а также об одном случае миелодиспластического синдрома (диагноз, который позже был изменен на трансфузионно-зависимую анемию) у участников испытания генотерапии LentiGlobin для лечения серповидно-клеточной болезни. А в конце апреля 2021 года компания Adverum Biotechnologies объявила о том, что у одного из участников испытания препарата для лечения диабетического макулярного отека развилась потеря зрения в глазу, на котором проводилась терапия.

Несмотря на эти неудачи и несмотря на COVID-19, число новых испытаний генотерапии в прошлом году резко возросло. Сэндс задается вопросом, разумно ли это.

После смерти Гелсингера эксперты по генотерапии стали полагаться на AAVs как на вектор выбора. Этот маленький вирус казался рабочей лошадкой, которую искали в этой области. Но даже когда AAV называли спасителем генной терапии, Сэндс отметил некоторые долгосрочные проблемы безопасности.

Сэндс обнаружил гепатоцеллюлярную карциному у нескольких неонатальных мышей, которых лечили генотерапией на основе AAV, использовавшейся для лечения метаболического расстройства. Однако после того, как Сэндс опубликовал свои результаты в 2001 году, его выводы были поставлены под сомнение, поскольку в предыдущих исследованиях мышам старшего возраста вводили AAV без видимых проблем.

"Появилось много компаний, и на кону стояла репутация многих людей", - говорит Сэндс. Все говорили, что эти векторы доброкачественны, и тут появляюсь я и говорю: "Подождите минутку". Это вызвало огромный отпор".

Шесть лет напряженной лабораторной работы, наконец, позволили определить конкретные участки, где вектор AAV интегрировался в геном мыши. Сэндс и его коллеги обнаружили, что вирусы встраивались в область в 6-килобат на хромосоме 12, изменяя экспрессию генов хозяина и приводя к опухолеобразованию. По мнению Сэндса, это подчеркивает необходимость проведения долгосрочных исследований безопасности генной терапии на основе AAV, чтобы эта область могла безопасно развиваться.

"Я большой сторонник AAV-терапии. Но меня всегда беспокоило то, что если [интеграция] является проблемой для генотерапии человека, то она должна была изучаться систематически в течение последних 20 лет", - говорит он. "Если мы не понимаем, как происходит интеграция, мы не можем изменить конструкцию AAVs, чтобы сделать их более безопасными".

Сабатино согласна. Ее работа показала, что векторы AAV, введенные для лечения собачьей гемофилии, иногда интегрируются в клетки печени собак, создавая клональные разрастания, которые могут стать раковыми. Но для раcследования этих проблем у человека требуются годы. По словам Сабатино, подобные проблемы не выявляются в ходе испытаний на нечеловеческих приматах, потому что у этих животных развивается иммунный ответ на человеческую генотерапию. Это означает, что их организм борется с вирусом и сопутствующей ему генетической нагрузкой, поэтому мониторинг обычно длится всего несколько месяцев.

"В этом и заключается ценность долгосрочных животных моделей для последующего наблюдения. Вы не можете отслеживать обезьяну в течение нескольких месяцев и ожидать, что обнаружите клональную экспансию", - говорит она.

Центр по оценке и исследованию биологических препаратов FDA, который следит за испытаниями и результатами генотерапии, знает о возможности долгосрочных проблем с генотерапией, говорит Маркс. В своем проекте руководства по генотерапии для индустрии FDA рекомендует 15-летний период наблюдения.

"Мы должны обеспечить безопасность этих продуктов, и именно поэтому мы здесь, в FDA, чтобы убедиться, что все это делается безопасно", - говорит Маркс.

Элисон Бейтман-Хаус, специалист по биоэтике из Нью-Йоркского университета, согласна с тем, что необходимы долгосрочные исследования на животных. Не зная всей величины потенциального риска, говорит Бейтман-Хаус, пациенты не смогут дать настоящее информированное согласие на клинические испытания.

"Мы действительно летим вслепую", - говорит она.

Сэндс и Сабатино сохраняют оптимизм в отношении перспектив AAVs и других методов генотерапии. По мнению Паулка, проблема будет заключаться в разработке лучших рекомбинантных векторов с улучшенным тропизмом и сниженной иммуногенностью, чтобы пациентам требовалось меньше вектора и уменьшалась вероятность тяжелой иммунной реакции.

Главный научный сотрудник компании Affinia Therapeutics, расположенной в Уолтхэме, штат Массачусетс, Чарльз Олбрайт говорит, что компания работает над созданием именно таких улучшенных векторов. Один из векторов имеет в 32 раза больше экспрессии РНК, что позволяет использовать меньшую дозу; другой вектор был настроен как для того, чтобы направить его в сторону от печени, так и для того, чтобы направить его в сторону мышц.

"Это очень выгодно", - говорит Олбрайт. "Обходить печень и увеличивать поглощения в мышцах - эта специфическая комбинация будет очень мощной, если мы сможем перенести ее на не-человекообразных приматов".

Постоянное беспокойство по поводу безопасности генотерапии на основе AAV заставило некоторых ученых переосмыслить способы доставки генной терапии.

В ноябре 2020 года компания Intellia Therapeutics начала фазу 1 испытаний первой в мире системно вводимой терапии CRISPR-Cas9 для лечения наследственного транстиретинового амилоидоза с полинейропатией. Вместо упаковки системы редактирования генов в вирусный вектор компания Intellia использует липидную наночастицу, что в чем-то схоже с методом, используемым в мРНК-вакцинах против SARS-CoV-2, разработанных компаниями Moderna и BioNTech-Pfizer. Доклинические исследования показали, что терапия CRISPR-Cas9 уничтожила более 97% неправильно сформированного белка транстиретина. Преимущество этого метода, по словам Гамильтона, заключается в том, что пациенты могут получать многократные дозы с течением времени, поскольку их иммунная система не будет образовывать антитела против вектора. В конце июня 2021 года компания Intellia опубликовала первые результаты исследования, которые показали зависимое от дозы снижение уровня транстиретина в сыворотке крови.

Гамильтон работает над созданием другого типа системы CRISPR-Cas9, которая доставляет систему редактирования генов в виде рибонуклеопротеинового комплекса, который может войти в клетку-мишень, отредактировать геном, а затем разрушиться. По словам Гамильтона, эта стратегия преходящего дозирования не только предотвращает развитие антител против вирусного вектора, но и означает, что иммунная система не будет вырабатывать антитела против Cas9.

"Ex vivo CRISPR имеет свои недостатки, поскольку требует выделения кроветворных стволовых клеток для редактирования в лаборатории, которые затем возвращаются в виде трансплантата стволовых клеток. Участники испытаний должны пройти лечение миелоаблативным препаратом, таким как бусульфан, который разрушает их собственные стволовые клетки, что требует нескольких недель госпитализации. Поэтому редактирование генов CRISPR ex vivo не подходит для стран с низкими ресурсами.

"В странах с низким уровнем дохода в Африке к югу от Сахары, как правило, отсутствует значительная инфраструктура, необходимая для широкого предоставления трансплантации костного мозга, не говоря уже о генотерапии, которая требует извлечения клеток, их транспортировки, генетической модификации и возвращения пациенту", - говорит Бетси Фосс-Кэмпбелл, директор по политике и пропаганде Американского общества генной и клеточной терапии.

Стремясь решить эту проблему, Фонд Билла и Мелинды Гейтс в феврале 2021 года заключил партнерство с компанией Novartis, чтобы доставить одноразовую генотерапию in vivo для лечения серповидно-клеточной болезни в Африку, где проживает большинство людей с этим заболеванием. Эта терапия должна будет доставляться непосредственно пациенту, без необходимости модифицировать клетки в лаборатории и без длительной и дорогостоящей госпитализации. Если все пойдет по плану, говорит Сьюзан Стивенсон, исполнительный директор Института биомедицинских исследований компании Novartis, то генотерапия серповидно-клеточной болезни может быть готова к испытаниям на людях чуть более чем через 5 лет.

"Это отличная модель для подражания. Проводить лечение там, где находится большинство пациентов", - говорит она.

Из своей лаборатории в Понтифик университете Хаверии в Боготе Карлос Хавьер Альмечига Д.Аз с интересом следит за достижениями в области генотерапии. Он изучает группу наследственных лизосомальных заболеваний, которые приводят к летальному исходу в детском возрасте. В Колумбии самый высокий в мире уровень заболеваемости болезнью накопления мукополисахаридов, известной как синдром Моркио А. Д'аз говорит, что, хотя синдром Моркио А является идеальным кандидатом для генотерапии, привлечь интерес фармацевтической промышленности и обеспечить финансирование остается сложной задачей, поскольку в других странах мира это заболевание встречается крайне редко. По его словам, в этой области нужны более локальные решения, разработанные для конкретных групп населения, страдающих от конкретных заболеваний.

Не будучи скованными недавними неудачами и проблемами, специалисты в области генотерапии не теряют надежды и оптимизма. Существуют серьезные проблемы в плане улучшения доставки и доступности, а также мониторинга долгосрочной безопасности, но ученым они не кажутся непреодолимыми.

"Даже несмотря на все разочарования и боль, это просто невероятно захватывающее время в этой области", - говорит Теста.