Транстиретиновый амилоидоз, также называемый ATTR-амилоидозом, является прогрессирующим смертельным заболеванием, характеризующимся накоплением в тканях амилоидных фибрилл, состоящих из неправильно сформированного белка транстиретина (TTR).^1,2 Амилоидоз ATTR может быть приобретенным; называемый амилоидозом ATTR дикого типа, эта форма амилоидоза ATTR является признанной причиной кардиомиопатии и сердечной недостаточности.² В более редких случаях амилоидоз ATTR является наследственным (известный как вариантный или наследственный амилоидоз ATTR [hATTR]); амилоидоз hATTR может быть вызван более чем 100 различными патогенными мутациями в TTR.³ Считается, что наследственная форма амилоидоза ATTR встречается приблизительно у 50 000 человек во всем мире^4,5; она имеет аутосомно-доминантный тип наследования и клинический фенотип с преобладанием амилоидной полинейропатии или кардиомиопатии, причем у большинства пациентов наблюдается сочетание этих двух форм.⁶ После появления симптомов амилоидоз ATTR прогрессирует и приводит к смерти в среднем через 2-6 лет после постановки диагноза у пациентов с амилоидной кардиомиопатией⁷ и через 4-17 лет после появления симптомов у пациентов с амилоидной полинейропатией при отсутствии кардиомиопатии⁸.

Современные терапевтические стратегии лечения амилоидоза ATTR основаны на уменьшении образования амилоида путем стабилизации тетрамерной формы TTR (с diflunisal или tafamidis)^9,10 или путем ингибирования синтеза белка TTR (с inotersen или patisiran) посредством деградации мРНК TTR.^11,12 Такие методы лечения облегчают симптомы и улучшают функциональное состояние, а также продлевают выживаемость^12-14, но ограничены требованием длительного приема для поддержания нокдауна TTR. В случае с патисираном длительное лечение приводит к продолжению премедикации глюкокортикоидами и антигистаминными препаратами.¹⁵ Кроме того, у пациентов, получающих ТТР-стабилизирующие препараты, наблюдается прогрессирование заболевания.¹⁶ Инотерсен связан с серьезными побочными эффектами, включая гломерулонефрит и снижение количества тромбоцитов.¹⁷ Более обширный нокдаун TTR связан с большим улучшением начальных и конечных точек нейропатии у пациентов с полинейропатией hATTR.¹² Углубление снижения TTR, включая устойчивый нокдаун, может привести к улучшению исходов у пациентов с амилоидозом ATTR. Потенциальной альтернативой подавлению генов на основе нацеливания на мРНК является использование системы кластеризованных регулярно перемежающихся коротких палиндромных повторов и связанной с ними эндонуклеазы Cas9 (CRISPR-Cas9) для редактирования генов in vivo.^18-21 Будучи моногенным заболеванием, амилоидоз ATTR представляет собой идеальную мишень для применения CRISPR-Cas9-опосредованного редактирования генов in vivo. Ограниченная и специфическая нормальная функция TTR в транспорте тироксина и витамина А²² означает, что нокдаун оказывает лишь ограниченные дополнительные физиологические эффекты²³; кроме того, циркулирующий TTR почти полностью (более 99%) вырабатывается в печени,² для которой доступны известные системы нацеливания, такие как липидные наночастицы.

NTLA-2001 - это новая терапия путем редактирования генов in vivo на основе CRISPR-Cas9, которая вводится путем внутривенных вливаний и предназначена для редактирования TTR в гепатоцитах, что приводит к снижению производства как дикого, так и мутантного типа TTR после однократного введения. В мышиных моделях и у не-человекообразных приматов (циномольгусовых обезьян) однократные дозы приводили к стойкому снижению белка TTR в сыворотке крови на 95% и более^24,25 и, следовательно, потенциально обеспечивают больший нокдаун TTR, чем имеющиеся в настоящее время методы лечения.



Figure 1. Mechanism of Action of NTLA-2001.

NTLA-2001 состоит из запатентованной системы доставки липидных наночастиц (LNP) с тропизмом к печени, несущей одну направляющую гид РНК (sgRNA), нацеленную на TTR человека, и оптимизированную по кодонам последовательность мРНК белка Cas9 Streptococcus pyogenes (рис. 1). Ранее LNP использовались in vivo для целенаправленной доставки в печень различных терапевтических РНК-грузов, таких как малые интерферирующие РНК и мРНК.^26,27 Для NTLA-2001 формула LNP была разработана для редактирования генома в отношении липидного состава и РНК-груза, чтобы обеспечить эффективную доставку в печень в различных доклинических моделях. Как описано ранее, при диффузии полиэтиленгликоля с липидами из этих LNPs, аполипопротеин Е плазмы связывается (опсонизирует) c поверхностью LNP в кровообращении; затем LNP активно эндоцитируются гепатоцитами через рецепторы липопротеинов низкой плотности.²⁷ Учитывая, что печень является почти исключительным местом производства TTR,² эта система доставки, нацеленная на печень, должна максимизировать эффективность при минимизации системных токсических эффектов.

Здесь мы приводим промежуточные данные текущего клинического исследования по оценке однократного повышения дозы NTLA-2001 для редактирования и нокаута TTR при лечении пациентов с hATTR-амилоидозом с полинейропатией.

Спонсорами клинического исследования являются компании Intellia Therapeutics и Regeneron Pharmaceuticals; спонсоры разработали протокол, доступный на сайте NEJM.org. Надзор за исследованием осуществлял независимый комитет по мониторингу данных и безопасности. Данные были собраны исследователями в Новой Зеландии и Великобритании и проанализированы спонсорами. Подготовлен первый черновик рукописи под руководством авторов и при финансовой поддержке спонсоров. Авторы имели доступ к данным и сотрудничали в подготовке и редактировании черновиков рукописи до и после ее представления. Исследователи и спонсоры ручаются за точность и полноту данных и за соответствие исследования протоколу. Протокол был рассмотрен национальными и институциональными этическими и регуляторными органами, включая экспертные комитеты по оценке новых исследований генотерапии, таких как редактирование генов (Консультативный комитет по генной терапии Министерства здравоохранения Новой Зеландии и Консультативный комитет по генотерапии Агентства по регулированию лекарственных средств и продуктов здравоохранения Великобритании). Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией и руководством по надлежащей клинической практике Международного совета по гармонизации, и все пациенты дали письменное информированное согласие.

Мы сообщаем о результатах в двух группах начальной дозы в части 1 двухэтапного глобального многоцентрового исследования фазы 1 с открытой меткой. Пациенты получали однократную дозу NTLA-2001, состоящую из общей дозы РНК 0,1 мг на килограмм массы тела или 0,3 мг на килограмм массы тела, вводимой внутривенно в период с ноября 2020 года по апрель 2021 года. Основные критерии отбора для участия в первой части исследования включали возраст от 18 до 80 лет, диагноз полинейропатии, вызванной амилоидозом hATTR (с кардиомиопатией или без нее), массу тела от 50 до 90 кг во время скрининга и отсутствие доступа к утвержденным методам лечения амилоидоза ATTR. Пациенты с не ATTR амилоидозом, известным лептоменингеальным ATTR амилоидозом или с получением в анамнезе РНК-замалчивающей терапии были исключены. Предыдущее применение стабилизаторов TTR допускалось с периодом вымывания (3 дня для дифлунизала).

Исследования безопасности на циномольгусовых обезьянах были использованы для определения уровня no-observed-adverse-effect level (NOAEL), который был определен как однократное введение 3 мг на килограмм внутривенно, что эквивалентно дозе 1 мг на килограмм для человека. В соответствии с аллометрическим масштабированием на основе общей площади поверхности тела и применением коэффициента безопасности 10, максимальная рекомендуемая начальная доза NTLA-2001 для данного исследования составила 0,1 мг на килограмм. Для снижения потенциального про-воспалительного эффекта внутривенных инфузий LNP пациенты получали глюкокортикоиды и блокаду гистаминовых рецепторов 1 и 2 типа перед инфузией.

Пациенты находились под наблюдением для оценки нежелательных явлений и результатов лабораторных исследований. Образцы сыворотки были получены на исходном уровне и на неделях 1, 2 и 4 для анализа уровня белка TTR с помощью оценочного иммуноферментного анализа. Оценку безопасности и терапевтической активности планируется провести через 24 месяца после введения NTLA-2001. В соответствии с требованиями регулирующих органов, одобривших данный протокол, более длительное наблюдение за безопасностью планируется в рамках отдельной программы, находящейся в стадии разработки.



Figure 3. In Vivo Pharmacologic Properties of Cyn-LNP, the Nonhuman Primate Surrogate of NTLA-2001.

Исследования на циномольгусовых обезьянах показали быстрое первоначальное распределение и удаление компонентов LNP (Таблица S3 и Рис. S8). Кроме того, однократная доза Cyn-LNP (суррогат NTLA-2001 для не-человекообразных приматов) в дозе 3 или 6 мг на килограмм была связана с максимальным процентом редактирования генов 73% в целой печени и почти полным (более 94%) снижением сывороточного белка TTR, которое сохранялось в течение 12 месяцев (рис. 3A). Редактирование TTR было подтверждено анализом печеночной ткани методом секвенирования следующего поколения (Рисунок 3B).²⁵

Доклинические исследования на мышах и циномольгусовых обезьянах показали, что однократная доза NTLA-2001 или его суррогата Cyn-LNP приводит к стойкому редактированию TTR и практически полному устранению экспрессии белка TTR в сыворотке крови в дозах, не вызывающих побочных эффектов. Чтобы оценить способность NTLA-2001 снижать экспрессию белка TTR в сыворотке крови после однократной внутривенной инфузии у людей, мы начали открытое исследование с использованием одной дозы, для доказательства концепции с участием пациентов, страдающих амилоидозом hATTR с полинейропатией.

В одном месте проведения исследования (Окленд, Новая Зеландия) скрининг прошли три пациента, двое из которых были признаны соответствующими требованиям и включены в исследование. У одного из участников масса тела превышала верхний предел, разрешенный протоколом исследования на тот момент. В другом месте проведения исследования (Лондон, Великобритания) скрининг прошли четыре пациента, все они были признаны соответствующими требованиям и включены в исследование. Возраст пациентов составлял от 46 до 64 лет, четверо из шести пациентов были мужчинами; масса тела варьировалась от 70 до 90 кг. У трех пациентов была мутация p.T80A, у двух - p.S97Y и у одного - p.H110D. Три пациента ранее не получали никакой терапии, а три пациента ранее получали дифлунизал. У всех шести пациентов была сенсорная полинейропатия при отсутствии двигательных симптомов (балл инвалидности по полинейропатии - 1) и класс сердечной недостаточности I по классификации Нью-Йоркской ассоциации сердца. Уровень N-концевого про-B-типа натрийуретического пептида колебался от 50 до 596 нг на литр.

Лечение с помощью NTLA-2001 было завершено у всех пациентов без прерывания инфузии. Никаких предусмотренных протоколом событий, связанных с прекращением лечения, не наблюдалось. Нежелательные явления, возникшие во время или после лечения, все из которых были легкой степени тяжести (класс 1), были зарегистрированы у трех из шести пациентов. У одного пациента произошло нежелательное явление, представляющее особый интерес (реакция 1 степени, связанная с инфузией; см. таблицу S4). Серьезных нежелательных явлений не наблюдалось. Повышение уровня D-димеров наблюдалось через 4-24 часа после введения у пяти из шести пациентов; повышение было ниже, чем при дозе NOAEL у не-человекообразных приматов. Значения вернулись к исходному уровню у всех шести пациентов к 7-му дню. Показатели коагуляции (активированное частичное тромбопластиновое время и протромбиновое время) оставались в пределах 1.2 раза выше верхней границы референсных диапазонов, а уровень фибриногена и количество тромбоцитов оставались выше нижней границы референсных диапазонов; показатели функции печени (уровни аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы) оставались в пределах нормы (рис. S11).

Figure 4. Reductions from Baseline in Serum TTR Protein Concentration after Infusion of NTLA-2001 in Humans.

Для определения фармакодинамических эффектов NTLA-2001 оценивали концентрацию TTR в сыворотке крови. Снижение концентрации белка TTR в сыворотке по сравнению с исходным уровнем наблюдалось к 14-му дню и углублялось к 28-му дню (рис. 4A и 4B). На 28 день NTLA-2001 ассоциировался со средним снижением TTR на 52% в группе, получавшей дозу 0,1 мг на килограмм веса, и на 87% в группе, получавшей 0,3 мг на килограмм (Рисунок 4C). Эффект был дозозависимым, с большим снижением концентрации TTR среди пациентов, получавших более высокую дозу NTLA-2001. Кроме того, эффект NTLA-2001 был воспроизводим среди пациентов на каждом уровне дозы, при этом снижение на 28-й день варьировалось от 47 до 56% в группе с низкой дозой и от 80 до 96% в группе с высокой дозой (Рисунок 4A и 4B).

Мы сообщаем о доказательстве редактирования генов in vivo с помощью CRISPR-Cas9 у человека. Системное введение NTLA-2001 шести пациентам с hATTR-амилоидозом с полинейропатией было связано в каждом случае с устойчивым снижением концентрации белка TTR в сыворотке крови. Лечение NTLA-2001 было связано с зависимым от дозы эффектом. На 28-й день, т.е. на момент, когда эффект препарата достиг своего постоянного минимума в доклинических исследованиях, среднее снижение концентрации белка TTR в сыворотке крови по сравнению с исходным уровнем составило 52% в группе, получавшей меньшую дозу (0,1 мг на килограмм), и 87% в группе, получавшей большую дозу (0,3 мг на килограмм). Лечение NTLA-2001 было связано с нежелательными явлениями только легкой степени тяжести.

Эти данные представляют собой промежуточные результаты первых двух групп доз в продолжающемся исследовании по повышению дозы. Полученные результаты близко соответствуют картине, наблюдаемой в данных in vitro на клеточных линиях и данных in vivo по потенцированию у животных, которые показали глубокое и постоянное снижение концентрации белка TTR в сыворотке крови при использовании NTLA-2001, таким образом, предоставляя доказательства потенциала редактирования генов in vivo в качестве терапевтической стратегии для лечения амилоидоза hATTR. Важно отметить, что данное исследование включает очень небольшое количество пациентов с ограниченным наблюдением на сегодняшний день. Для подтверждения стойкости эффекта планируется продолжить серийные измерения концентрации ТТР в сыворотке крови у пациентов, о которых сообщается в данном исследовании.

Данные исследований РНК-таргетинга генов показали, что наблюдаемое снижение уровня белка ТТР в сыворотке крови приводит к значимым клиническим преимуществам по сравнению с плацебо. Эти препараты приводят к среднему снижению концентрации ТТР в сыворотке крови приблизительно на 80% по сравнению с исходным уровнем и демонстрируют более благоприятные клинические эффекты у пациентов, у которых достигнута более низкая концентрация белка ТТР. Для поддержания такого снижения с помощью целенаправленного воздействия РНК препаратов требуются регулярные серийные вливания. На основании данных, полученных на животных, NTLA-2001 может привести к почти полному и постоянному нокдауну экспрессии TTR при однократном введении. Как и в случае применения современных стандартных препаратов, пациенты будут получать добавки витамина А, чтобы компенсировать потерю TTR, который играет нормальную физиологическую роль в транспорте витамина А³¹.

Потенциал нецелевого редактирования генов с помощью систем CRISPR-Cas является проблемой в связи с использованием этих методов лечения у людей.³² В первичных гепатоцитах человека терапевтические концентрации NTLA-2001 не показали никаких признаков ранее описанных механизмов нецелевого мутагенеза.^33,34 Вычислительное моделирование, биохимические бесклеточные анализы и клеточные анализы in vitro были использованы для определения наиболее вероятных участков в геноме за пределами TTR, в которые NTLA-2001 может внести нецелевые правки. Семь сайтов-кандидатов на возникновение indels были подтверждены в анализах с клеточными линиями, в которых использовались сверхнасыщенные дозы NTLA-2001. Мы оценили терапевтический индекс NTLA-2001 в первичных гепатоцитах человека, определив частоту нецелевых правок при концентрациях sgRNA, которые вызывали высокую степень целевых правок и снижение продукции белка TTR. Кроме того, мы провели широкое секвенирование для выявления структурных вариантов и определения риска непреднамеренной генотоксичности или онкогенной трансформации.^35,36 Indels и структурные варианты ДНК являются естественными результатами восстановления двуцепочечных разрывов ДНК.³⁶ Структурные варианты ДНК, индуцированные редактированием генома CRISPR-Cas9, не были случайными, а были связаны с концевым соединением в сайте TTR on-target и, как ожидается, представляют собой низкий риск. Изменения, обнаруженные в первичных гепатоцитах человека, могут предсказать структурные варианты ДНК, которые могут возникнуть в естественных условиях. Участники, которые добровольно примут участие в терапии NTLA-2001, должны будут пройти долгосрочный мониторинг безопасности.

Подход CRISPR-Cas9, использованный для NTLA-2001, является модульным и может быть адаптирован для лечения других заболеваний путем простой замены sgRNA. Действительно, подход к редактированию генов in vivo, использованный в данном исследовании, в настоящее время изучается для применения при других заболеваниях. Многие исследователи планируют дальнейшие клинические программы с использованием стратегий редактирования генов на основе CRISPR-Cas9 для лечения широкого спектра заболеваний; эти программы могут использовать потенциал не только для подавления экспрессии вредных белковых продуктов, но и для вставки генов для производства функциональных белков, мутации которых вызывают патологический дефицит.

Исследование, о котором здесь сообщается, продолжается. Продолжается эскалация дозы с целью добиться большего снижения сывороточного белка TTR, чем это достигается при использовании имеющихся методов лечения, с ожидаемым благоприятным воздействием на прогрессирование заболевания, качество жизни и смертность. Данные, полученные от первых групп пациентов в этом исследовании, обеспечивают клиническое доказательство концепции редактирования генов in vivo с помощью CRISPR-Cas9 в качестве терапевтической стратегии.