Аутоиммунитет обычно возникает в результате системной иммунной реакции, вызванной неспособностью адекватно регулировать иммунный ответ. Для генетической коррекции in vivo с помощью CRISPR-Cas9, sgRNA и Cas9 должны проникнуть в ядро клетки для редактирования участка ДНК мишени. Существуют две основные системы доставки CRISPR-Cas9: вирусные векторы и липидные наночастицы [5]. При использовании вирусного вектора переноса наиболее широко применяется адено-ассоциированный вирус (AAV), который имеет низкую вероятность геномной интеграции в чужеродные гены и продемонстрировал свою безопасность [16]. Учитывая, что AAV имеет небольшой размер, а крупноразмерный SpCas9, полученный из Streptococcus pyogenes, используется редко, несмотря на его высокую эффективность, поэтому применяются более мелкие белки Cas9, полученные из других видов бактерий [17]. Cas9, полученные из Staphylococcus aureus (SaCas9) или Campylobacter jejuni (CjCas9), могут быть упакованы вместе с sgRNA в AAV и применяться для коррекции генов in vivo с достойной эффективностью [18,19].

PCSK9, который регулирует липопротеин низкой плотности (LDL) и известен как основной фактор риска атеросклероза и ишемической болезни сердца, был нокаутирован в гепатоцитах с помощью NHEJ с SaCas9, что привело к значительному снижению LDL [20]. В другом исследовании сообщалось, что доставка мегануклеазы in vivo с помощью AAV, нацеленной на PCSK9, показала снижение уровня холестерина в сыворотке крови [9,10]. Изучались также редкие метаболические заболевания. Мышиную модель дефицита OTC лечили с помощью AAV8 и SaCas9, и наблюдался ограниченный, но значительный терапевтический эффект в лечении наследственной тирозинемии [11,12]. В некоторых исследованиях мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) патогенная мутация в экзоне 23 была удалена, и наблюдалось улучшение функции скелетных мышц и миокарда [13-15].

В основе аутоиммунитета лежит простая концепция дисбаланса между провоспалительными и противовоспалительными стимулами, что приводит к аномальному иммунному ответу. Цитокины, такие как интерлейкин-1 (IL-1) и фактор некроза опухоли (TNF), играют важную роль в воспалении, поэтому снижение экспрессии этих цитокинов в конечном итоге приводит к отмене аутоиммунного процесса [21]. Например, цитокины интерлейкин-36 (IL-36) (IL-36A, IL-36B и IL-36G) и члены семейства IL-1 могут вызывать про-воспалительные, т.е. способствующие воспалению, эффекты в коже и других органах [22]. Исследования показали, что цитокины, принадлежащие к семейству IL-36, могут играть важную роль в развитии аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (RA), системная красная волчанка (SLE), воспалительные заболевания кишечника (IBD), Sjogren's синдром и psoriasis vulgaris [23-25]. Известно, что адаптерный белок Myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) активируется при стимуляции IL-36. Инактивация адаптерного белка MyD88 с помощью CRISPR-Cas9 снижала активность дифференциально экспрессируемых генов, индуцирующих экспрессию IL-1B и IL-36G [26].

Tumor necrosis factor alpha-induced protein 3 (TNFAIP3) индуцируется TNF-альфа и, как известно, ингибирует активацию NF-κB и TNF-опосредованный апоптоз [27]. Сообщалось, что генетические изменения TNFAIP3 связаны с предрасположенностью к развитию SLE и RA [28,29]. Исследование геномной ассоциации при SLE показало, что UBE2L3 может быть новой терапевтической мишенью. UBE2L3 был идентифицирован как ключевой фермент E2 для комплекса сборки linear ubiquitin chain assembly complex (LUBAC) и необходим для LUBAC-опосредованной активации NF-κB [30]. Кроме того, сообщалось об ассоциации с семейным Behcet-like аутовоспалительным синдромом и инфантильно-неустойчивым IBD [31,32]. Исследование нокаута TNFAIP3, опосредованного TALEN, показало, что исправление патогенных вариантов TNFAIP3 может обратить вспять связанные с ним аутоиммунные проявления [33]. Кроме того, нокаут кандидата причинного варианта rs6927172 с помощью редактирования генов CRISPR-Cas9 повлиял на экспрессию генов IL-20RA и TNFAIP3, потенциально вовлеченных в аутоиммунный ответ [34].

Помимо цитокинов, многие генетические варианты, способствующие развитию аутоиммунных заболеваний, связаны с Т-клетками. Например, FoxP3 + регуляторные Т-клетки играют важную роль в иммунологической толерантности [35]. Immuno-dysregulation polyendocrinopathy, enteropathy X-linked (IPEX) синдром, вызванный мутацией FoxP3 у человека, может привести к различным аутоиммунным заболеваниям в раннем детстве [36]. При IPEX снижается уровень FoxP3 и значительно ухудшается функция Tregs. Фактически, эпигенетическое редактирование промотора и консервативной не кодирующей последовательности 2 (CNS2) в гене FoxP3 показало 20-30% снижение деления эффекторных Т-клеток [37], поэтому CRISPR-Cas9 может быть потенциальным терапевтическим подходом для лечения случаев IPEX.

При аутоиммунитете были изучены различные методы лечения с использованием CRISPR-Cas9. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) были получены путем добавления антагониста рецептора интерлейкина-1 (IL1Ra) или гена растворимого рецептора TNF с помощью редактирования генов CRISPR-Cas9 и они были дифференцированы в суставной хрящ. Это показало, что воспалительный ответ был ослаблен путем запуска динамической негативной обратной связи при стимуляции воспалительными цитокинами [38]. В других исследованиях сообщалось, что суставной хрящ устойчив к IL-1альфа-опосредованной деградации ткани путем удаления рецептора интерлейкина-1 (IL1r1) в мышиных iPSCs [39].

Редактирование генов в мезенхимных стволовых клетках (MSCs) было использовано с помощью CRISPR-Cas9 для направленного воздействия на эндогенную активацию панкреатических транскрипционных факторов и хемокиновых рецепторов MSCs. MSCs были дифференцированы в суррогатные инсулин-продуцирующие клетки и могут быть пересажены путем ex vivo экспансии и трансплантации, сохраняя при этом свои иммуномодулирующие свойства [40]. Другие исследования успешно активировали транскрипцию эндогенного человеческого инсулина с помощью sgRNAs, нацеленных на множественный инсулиновый промотор и дефицитный по нуклеазе ген Cas9-вирионного белка 160 (dCas9-VP160) в Т-клетках эмбриональной почки человека 293 (HEK293T), Hela и фибробластах человека [41].

В трех исследованиях генетическая терапия была протестирована в моделях клеток человека при RA. По результатам этих исследований, гены MYC, FOXO1, SNP rs6927172, TNFAIP3, OLIG3 и miR-155 были предложены в качестве подходящих кандидатов для лечения с помощью CRISPR-Cas9.

Yang и др. предположили, что гены MYC и FOXO1 связаны с ревматоидным артритом [42]. Считалось, что у больных RA CD4+ Т-клетки обнаруживают более высокую аутофагию, а MYC считался регулятором этого пути [42]. Также считалось, что FOXO1 коррелирует с активностью RA [42]. Это исследование, собрав данные ATAC-seq, Hi-C, Capture Hi-C и nuclear RNA-seq в стимулированных CD4+ T-клетках в течение 24 часов, предоставляет доказательства того, что гены MYC и FOXO1 могут быть причинными факторами RA [42]. В исследовании Yu et al. межгенный SNP rs6927172 в области хромосомы 6q23 был обнаружен ассоциированным с течением заболевания RA по данным геномного широко-геномного ассоциативного исследования [43]. Согласно исследованию, многие гены, такие как IL20RA, IL22RA2, IFNGR1, OLIG3 и TNFAIP3, фланкируют область SNP, и когда они нарушили область SNP с помощью CRISPR-Cas9, только TNFAIP3 и OLIG3 вызывали снижение экспрессивности [43]. Это показывает, что SNP rs6927172, TNFAIP3 и OLIG3 в значительной степени связаны с течением заболевания RA [43]. Jing et al. продемонстрировали, что микроРНК 155 (miR-155) может быть важным про-воспалительным фактором у пациентов с RA [44]. Они использовали нокаутированную по miR-155 клеточную линию макрофагов RAW 264.7 и обнаружили, что в этой клеточной линии повышена регуляция SHP1 и нарушен процесс выработки про-воспалительных цитокинов [44]. Таким образом, они предполагают, что редактирование генома miR-155 может быть потенциальной терапевтической стратегией для РRA [44].

В четырех исследованиях на клеточных моделях человека и еще в четырех исследованиях на моделях мышей проверялась генетическая терапия при IBD. В результате этих исследований гены JAK2, TL1A, SGK2, PTPN2, c-MYC, HDAC7, IFN- γ и miR-125a были предложены в качестве подходящих кандидатов для лечения с помощью CRISPR-Cas9.

Анализ rs1887428, расположенного в промоторной области гена Janus kinase 2 [JAK2], проведенный Cardinale et al. выявил гены-мишени, на которые влияет этот полиморфизм [45]. Авторы обнаружили, что аллель риска rs1887428 связан с транскрипционным фактором (TF) RBPJ [45]. Согласно им, rs1887428 не оказывал очень большого влияния на экспрессию JAK2, но его влияние было установлено на STAT5B, амплифицированный в сторону уменьшения [45]. Ограничением данного исследования было то, что в нем не удалось найти мотив связывания TF и локус количественного признака экспрессии [45]. Mokhtar и др. показали, что экспрессия SGK2, являющегося частью PI3K/Akt-пути, влияет на течение заболевания IBD [46]. Иммуногистохимию проводили на клетках SW480, а нокдаун гена SGK2 осуществляли с помощью CRISPR gRNA [46]. В результате белок SGK2 был локализован в цитоплазме эпителиальных клеток толстой кишки как при язвенном колите длительной, так и короткой продолжительности [46]. Это указывает на то, что ген SGK2 может играть решающую роль в течении заболевания IBD [46]. В исследовании Li et al. варианты гена PTPN2 встречались у пациентов с болезнью Крона [46]. У этих пациентов PTPN2 имел мутацию с потерей функции и был связан с rs7234029 SNP [46]. Они использовали субэпителиальные клетки миофибробластов (SEMF) [46]. Результат показал, что экспрессия PTPN2 была увеличена в пораженной подвздошной кишке по сравнению с нормальной подвздошной кишкой, и, напротив, CRISPR-Cas9 опосредованная делеция PTPN2 привела к повышению уровней фосфорилирования STAT3 и Erk1/2 и пролиферации [47]. Это указывает на то, что варианты гена PTPN2 и SNP rs7234029 играют решающую роль в развитии болезни Крона [47]. Matthews и др. исследовали rs6651252 SNP на хромосоме 8 [48]. Исследование показало, что rs6651252 находится внутри ДНК-усиливающего элемента, реагирующего на Wnt, и ассоциированный с болезнью аллель увеличивает связывание фактора транскрипции TCF7L2 с этим регионом [48]. Используя CRISPR-Cas9, они обнаружили, что энхансер rs6651252 регулирует экспрессию c-MYC, и выявили, что уровень экспрессии MYC повышен у пациентов с болезнью Крона [48].

Pai и др. сосредоточили внимание на члене сверх-семейства фактора некроза опухоли TL1A [49]. Согласно результатам исследования, у трансгенных мышей с TL1A наблюдался спонтанный илеит (ileitis) [49]. При использовании нейтрализующего анти-TL1A фактора уменьшалось веерное расширение щетиночной каймы и обнаруживался бактериальный эндоцитоз, вызванный MLCK [49]. Наконец, экспрессия TL1A, IFNγ и MLCK1 и 2 была повышена в слизистой пациентов с IBD. [48] Таким образом, исследование показывает, что повышение TL1A, IFNγ и MLCK связано с течением заболевания IBD [49]. Friedrich и др. использовали первичные эпителиальные клетки толстой кишки (CEC), человеческие T84 и мышиные CMT93 для характеристики функций HDAC7 [50]. Нокаутные мыши были получены с помощью системы CRISPR-Cas9 [50]. Результат показал, что функция HDAC была снижена у пациентов с IBD, и, по данным нокаутных мышей, было установлено, что HDAC играет важную роль в поддержании кишечного барьера [50]. Eftychi и др. скрестили NEMOIEC-KO с IFNγ -/- мышами, созданными с помощью CRISPR-Cas9, чтобы продемонстрировать, что IFN-γ может играть решающую роль в воспалении толстой кишки [51]. Они обнаружили, что многие про-воспалительные цитокины, такие как Tnf, IL1b и IL6, обнаружили пониженную экспрессию у нокаутных мышей, и предположили, что IFN-γ необходим для воспаления толстой кишки [51]. Ge и др. показали, что микроРНК-125a может подавлять воспаление слизистой оболочки кишечника [52]. Согласно их результатам, экспрессия miR-125a была снижена в слизистой и периферической крови пациентов с IBD [52]. MiR-125a подавляет дифференцировку клеток Th1/Th17 и выработку TNF-α Кроме того, у нокаутных по miR-125a мышей наблюдались более тяжелые формы колита [52].

В двух исследованиях генотерапия была протестирована на клеточных моделях человека при SLE. В результате этих исследований A20 DUB и ген CXorf21 были предложены в качестве подходящих кандидатов для лечения с помощью CRISPR-Cas9. Odqvist и др. задались целью оценить, повышает ли TNFAIP3 (A20) деубиквитиназа (DUB) риск развития SLE [53]. Они использовали CRISPR-Cas9 для создания моноцитов U937 человека с инактивирующей C103A мутацией A20 DUB [53]. Результаты показали, что клетки A20 C103A или клетки с полиморфизмом rs2230926 создавали увеличенную внеклеточную ловушку нейтрофилов и повышенную частоту аутоантител к цитруллинированным эпитопам [53]. Они пришли к выводу, что прерывание домена A20 DUB повышает восприимчивость к SLE [53]. Harris и др. сосредоточили внимание на участии генов Chromosome X open reading frame 21 (CXorf21) в течении заболевания SLE [54]. Они провели эксперименты in vitro с нокдауном CRISPR-Cas9 и обнаружили, что нокдаун CXorf21 привел к снижению экспрессии TNF-α и IL-6 [54]. Они пришли к выводу, что половой диморфизм экспрессии CXorf21 может быть фактором риска развития SLE [54].

В четырех исследованиях генетическая терапия была протестирована на моделях клеток человека при MS. В результате этих исследований ген IR7R, полипептид 39B РНК-геликазы DEAD box, ген IL2RA и ген TNFRSF1A были предложены в качестве подходящих кандидатов для лечения с помощью CRISPR-Cas9. Gregory и др. продемонстрировали, что IL7Rα-связанный путь иммунного ответа имеет решающее значение в патогенезе MS. [55]. SNP rs6897932 в экзоне 6 IL7R влияет на экспрессию генов растворимой и мембран-связанной формы белка и повышает риск развития MS [55]. Растворимая форма IL7R является фактором повышенного риска MS. Аллель "С" гена rs6897932 ассоциирован с MS, и он усиливает пропуск экзона 6 гена IL7R путем усиления нарушения сплайсинга экзонов [55]. Этот результат позволяет предположить, что rs6897932 может влиять на количество растворимой и мембран-связанной формы белка [55]. Изоформы имеют большое значение для регуляции сигнального пути IL7 [55]. В результате существует прямая связь между альтернативными аллелями rs6897932 и риском развития MS.. Galarza-Munoz et al. продемонстрировали, что эпистатическое взаимодействие у человека связано с риском MS. РНК-геликаза DDX39B, которая является мощным активатором экзона 6 IL7R и репрессором растворимой формы IL7R, сильно коррелирует с риском MS [56]. Было показано, что эпистатическое взаимодействие между rs2523506 в DDX39B и rs6897932 в IL7R регулирует сплайсинг экзона 6 IL7R и повышает риск развития MS. [56]. Не только локальные мутации в гене IL7R, но и генетический и функциональный эпистаз с геном IR7R связан с риском развития MS. В другом исследовании Maier и др. показали, что ген IL-2RA имеет много вариантов, повышающих риск MS, и несколько вариантов были независимо связаны с уровнем sIL-2RA [57]. Maier и др. исследовали генетическую гетерогенность IL-2RA при MS и сахарном диабете 1 типа (СД1) вместе, которые связаны общими аллелями. Варианты IL2RA способствовали риску развития MS и T1DM соответственно [57]. rs2104286 SNP, расположенный в интроне 1 IL2RA, был в основном связан с предрасположенностью к MS [56]. Gregory и др. показали, что препараты, блокирующие TNF, являются эффективными средствами лечения аутоиммунных заболеваний, не связанных с MS. Исследование показало, что rs1800693 SNP в гене TNFRSF1A, который кодирует рецептор фактора некроза опухоли 1 (TNFR1), связан с MS в качестве причинного варианта [58]. Блокирующие TNF препараты имеют побочные эффекты, которые способствуют возникновению MS и других аутоиммунных заболеваний, таких как RA. Однако в исследовании Gregory et al. сообщалось о показателе заболевания для rs1800693, предсказывающем побочные эффекты [58].

В одном исследовании генотерапия была проверена на клеточных моделях человека при сахарном диабете 1 типа (СД), а в другом - на мышиных моделях. На основании этих исследований AID/RAD51 и SNP rs10914542 гена LCK были предложены в качестве подходящих кандидатов для лечения CRISPR-Cas9. Zhu и др. попытались выявить роль SNPs гена лимфоцит-специфической протеин-тирозинкиназы (LCK) [59]. Они взяли образцы крови пациентов с СД 1 типа и использовали CRISPR-Cas9 для выявления роли SNP гена LCK [59]. Среди SNP только SNP rs10914542 показал значимую ассоциацию [59]. Таким образом, они показали, что аллель G SNP rs10914542 в LCK повышает риск развития СД 1 типа [59]. Jeremy et al. использовали мышей с нокаутом гена цитидиндеаминазы (AID) и обнаружили, что AID/RAD51 может быть мишенью для лечения больных СД 1 типа [60].

В одном исследовании генотерапия была протестирована на клеточных моделях человека при псориазе, а в другом - на мышиных моделях. В результате этих исследований гены desmoglein 1 и ERAP1 были предложены в качестве подходящих кандидатов для лечения с помощью CRISPR-Cas9. Arakawa и др. продемонстрировали, что ERAP1 играет решающую роль в развитии псориаза [61]. Они создали клеточную линию меланомы с нокаутом ERAP1 и выявили, что эпистаз между вариантами HLA-C*06:02 и ERAP1 влияет на развитие псориаза [61]. Порядок включает ADAMTS-подобный белок 5 (ADAMTSL5) и иммуногенность меланоцитов [61]. Roth-Carter et al. использовали нокаутных мышей с десмоглеином 1 и обнаружили, что у нокаутных мышей наблюдалось нарушение барьерной функции [62]. Анализ кожи E18.5 нокаутных мышей показал, что ингибирование Dsg1 приводит к увеличению путей развития псориатического процесса [62]. Эти результаты подтверждают роль Dsg1 в дифференцировке эпидермиса, формировании барьеров и регуляции воспалительных реакций [62].

В одном исследовании генотерапия была протестирована в клеточных моделях болезней брюшины [63]. В результате исследования гены α- или γ-gliadin были предложены в качестве подходящих кандидатов для обработки CRISPR-Cas9. По данным Jouanin et al., зерна пшеницы содержат белки глютена, иммуногенные эпитопы которых могут вызвать болезней брюшины [63]. Они проанализировали последовательности генов α- и γ-глиадина и создали конструкции CRISPR-Cas9, нацеленные на α- или γ-глиадины [63]. Результат показал, что можно использовать CRISPR-Cas9 для редактирования α- или γ-глиадинов и создания безопасных форм злаков [63].

В данном исследовании мы попытались расширить наше понимание роли CRISPR-Cas9 в лечении аутоиммунных заболеваний путем всестороннего обзора литературы. Мы также рассмотрели гены-мишени и SNPs различных аутоиммунных заболеваний, пригодные для манипуляций методом CRISPR-Cas9. Обзор целевых генов и SNP представлен в таблице 1 и таблице 2. Поскольку аутоиммунитет основан на дисбалансе между про-воспалительными и противовоспалительными стимулами, цитокины, такие как IL1, IL36 и TNF альфа, а также факторы, связанные с Т-клетками, играют важную роль в аутоиммунных заболеваниях. Путем создания синтетической sgRNA последовательности, комплементарной определенному гену, Cas9, РНК-направляемая ДНК нуклеаза, может подавлять гены, связанные с цитокинами и факторами Т-клеток. Таким образом, CRISPR-Cas9 может стать потенциальным терапевтическим подходом к лечению аутоиммунных заболеваний.



Table 1. Human cell models using CRISPR-Cas9 in autoimmune diseases.



Table 2. Non-human cell models using CRISPR-Cas9 in autoimmune diseases.

В последнее время генотерапия и особенно метод CRISPR-Cas9 стали многообещающим подходом, поскольку наше понимание иммунологических и молекулярных основ аутоиммунных заболеваний прогрессирует. Возможности не ограничиваются часто встречающимися заболеваниями; она даже имеет большие перспективы для лечения редких заболеваний. Тем не менее, многие исследования по лечению аутоиммунных заболеваний с помощью CRISPR-Cas9 до сих пор проводились на клетках, поэтому необходимо больше исследований на людях. Кроме того, необходимо решить ряд технических проблем, таких как нецелевая активность вне мишени, неудовлетворительность indels или низкая эффективность гомологически-направленного восстановления, доставка компонентов системы CRISPR-Cas9 in vivo и иммунные реакции [64]. Несмотря на эти ограничения, имеющиеся данные свидетельствуют о перспективной роли CRISPR-Cas9 в регуляции аутоиммунных заболеваний, и необходимы дальнейшие исследования, направленные на эффективность применения метода CRISPR-Cas9 для лечения человека.