CRISPR-Cas9 может корректировать наследственные генетические заболевания с известными генными мутациями [1, 2]. Эта технология также может применяться для индукции специфических мутаций в экспериментальных моделях заболеваний in vitro и in vivo для изучения различных стратегий вмешательства. В контексте Т-клеточной иммунотерапии применение технологии CRISPR-Cas9 изучается для улучшения эффекторной функции и персистенции Т-клеток, снижения токсичности, связанной с лечением, и повышения доступности препаратов для пациентов [3, 4].

CAR T-клеточная терапия привела к устойчивым ремиссиям в популяциях рефрактерных пациентов и, более конкретно, продемонстрировала полные терапевтические ответы в 80-97% при некоторых В-клеточных злокачественных опухолях, таких как острый лимфобластный лейкоз (ALL) [5, 6]. Благодаря такой клинической эффективности, доклиническая разработка CAR T-клеточной терапии для нескольких других видов рака является областью активных исследований, и будущее клеточной иммунотерапии, несомненно, будет эффективным и динамичным. При традиционной CAR T-клеточной терапии собственные Т-клетки пациента генетически модифицируются для экспрессии синтетического рецептора, который распознает специфический антиген мишень на опухолевых клетках. Специфичность и активация CAR Т-клеток обычно являются результатом объединения внеклеточных антигенсвязывающих доменов антител (например, одноцепочечных вариабельных фрагментов, scFvs; вариабельных доменов тяжелой цепи (VHH)) с внутриклеточным сигнальным механизмом CD3ζ цепи Т-клеточного рецептора (TCR). Дополнительная ко-стимуляция обеспечивается в тандеме с сигнальными доменами таких молекул, как CD28 или 4-1BB, для дальнейшего усиления активации и персистенции Т-клеток (рис. 1) [7-9]. Первые одобренные Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) применения CAR T-клеточной терапии произошли в 2017 году с выпуском коммерческих CD19-направленных CAR T-клеточных препаратов Kymriah (tisagenlecleucel) и Yescarta (axicabtagene ciloleucel), которые используются для лечения B-клеточного ALL и диффузной крупноклеточной лимфомы (DLBCL) [7, 10, 11]. Хотя CD19 является трансмембранным гликопротеином, постоянно и стабильно экспрессирующимся на всех стадиях дифференцировки В-клеточной линии и, таким образом, присутствует как на здоровых, так и на злокачественных В-клетках, аплазия, возникающая в результате введения CD19 CAR T-клеток, клинически неплохо переносится и становится возможной благодаря заместительной терапии иммуноглобулинами [12]. С тех пор были одобрены другие препараты CD19 CAR T-клеток, а также первый не-CD19 направленный CAR, нацеленный на антиген созревания В-клеток (BCMA) для лечения множественной миеломы [10, 13-15]. Кроме того, в настоящее время проводятся многочисленные клинические испытания для оценки безопасности и эффективности препаратов CAR при злокачественных опухолях кроветворной системы и не-гемопоэтических раковых опухолях. Эти препараты нового поколения включают одиночные антигены, тандемные CAR и совместно экспрессируемые рецепторы против нескольких опухолевых мишеней, рецепторы с логической связью и с искусственно преобразованной доставкой полезной нагрузки для усиления функции эффекторных Т-клеток [10, 16].



Fig. 1 Schematic representation of a chimeric antigen receptor (CAR) T-cell. CAR T-cells are typically produced by transducing T-lymphocytes with a transgene encoding a synthetic antigen receptor. This transgene is integrated into the T-cell genome, transcribed and translated into a CAR protein. The core functional components of a CAR are binding and signaling domains separated into extracellular and intracellular compartments, respectively. The extracellular binding portion of the receptor is typically comprised of a single-chain variable fragment derived from the variable regions of an antibody that recognizes specific tumor antigens, together with a spacer that provides flexibility to the binding domain. The transmembrane domain connects the binding domain with intracellular signaling moieties. The TCR-derived CD3ζ chain drives T-cell activation and is fused in tandem with co-stimulatory endodomains that allow for robust and sustained function

Несмотря на эти разработки, причины неудачной терапии CAR Т-клетками многофакторные и не могут быть устранены только с помощью синтетических биологических усовершенствований. Основные ограничения для успешной терапии CAR T-клетками возникают как в процессе производства in vitro, так и во время пролиферации CAR T-клеток in vivo. При многих В-клеточных злокачественных опухолях полные ответы связаны с активной пролиферацией CAR Т-клеток, с явным преимуществом долгосрочного пребывания CAR Т-клеток [6, 17-21]. Таким образом, ограниченное разрастание и персистенция CAR T-клеток после терапии является распространенным механизмом неудачного лечения. Отсутствие терапевтического уровня пролиферации и персистенции CAR T-клеток in vivo может быть частично объяснено существующим истощенным состоянием исходных или произведенных Т-клеток (например, при хроническом лимфоцитарном лейкозе [CLL]), приобретением гипофункции CAR T-клеток после инфузии [20, 22-24], снижением дифференцировки стволовых клеток памяти/центральной памяти [20, 25-28] и преждевременным старением [23]. Кроме того, многие пациенты не могут получить пользу от этой терапии из-за проблем со сбором аутологичных Т-клеток, особенно у пациентов, получающих интенсивную химиотерапию и имеющих низкое количество Т-клеток памяти, обладающих оптимальной пролиферативной способностью [20, 26].

Дополнительные трудности характерны для солидных опухолей, где CAR Т-клетки должны добраться до опухолевых участков и преодолеть стромальные барьеры, чтобы проникнуть в опухолевое ложе и вызвать опухоль-специфическую цитотоксичность. Даже если доставка и инфильтрация проходят успешно, Т-клетки могут стать дисфункциональными из-за токсичного микроокружения опухоли (TME), характеризующегося метаболическими нарушениями, присутствием ингибирующих растворимых факторов и цитокинов, а также повышенной частотой супрессивных иммунных клеток или опухолевых клеток, которые выделяют эти медиаторы и избыточно экспрессируют лиганды для негативных рецепторов иммунных контрольно-пропускных пунктов. Злокачественные клетки также подвергаются потере антигена или его снижению, чтобы избежать распознавания CAR T-клетками в месте опухоли. У потенциальных пациентов, получающих терапию CAR Т-клетками, также может наблюдаться прогрессирование заболевания во время длительного процесса получения достаточного количества качественных Т-клеток. Выше перечисленные проблемы не могут быть решены с помощью одного подхода. Однако многие из этих проблем могут быть преодолены с помощью сайт-специфического генетического редактирования в сочетании с подходами клеточной инженерии нового поколения. С появлением легко мультиплексируемого прецизионного редактирования генома с использованием технологии кластеризованных регулярно перемежающихся коротких палиндромных повторов (CRISPR)-CRISPR-ассоциированного белка 9 (Cas9) (CRISPR-Cas9) [29], появилась возможность обойти многие из этих препятствий на пути CAR T-клеточной терапии рака и ускорить интеграцию этого подхода к лечению в рутинное медицинское лечение различных злокачественных опухолей.

Появление технологии CRISPR-Cas9 с ее простотой, гибкостью и эффективностью значительно улучшило процесс и сроки редактирования генов. Вкратце, фермент ДНК-эндонуклеаза Cas9 может быть направлен практически на любой участок генома для создания разрыва двухцепочечной ДНК. Область разреза для Cas9 выбирается на основе последовательности из 20 пар оснований одиночной направляющей РНК (sgRNA), которая направляет Cas9 к сайту мишени для разрезания ДНК, обладающему комплементарностью последовательности к sgRNA. Этот сайт дополнительно предопределяется последовательностью protospacer adjacent motif (PAM) в ДНК мишени вниз по течению от места разреза, состоящей из любой вариации 5'-NGG. Наряду с основной sgRNA существуют дополнительные структуры и особенности РНК, такие как петли и шпильки, необходимые для активного и стабильного образования комплекса с Cas9, как показано на рис. 2 [30]. Эта сайт-специфическая ДНК-эндонуклеазная система была впервые обнаружена у бактерий как форма "адаптивного иммунного ответа" для борьбы с инфекциями [31, 32]. С тех пор исследователи использовали основные компоненты CRISPR-Cas9 для создания сайт-специфического редактирования генов в клеточных системах животных и человека для широкого спектра применений (обзор приведен в [33]).



Fig. 2 CRISPR/Cas9 components and Cas9 enzyme class variants. (Left) Endonuclease Cas9 can cleave a specific site within DNA as determined by the complementarity of the synthetic (crispr) crRNA to the target DNA strand, together with a (trans-activating) tracrRNA hairpin to provide structural stability. The crRNA and tracrRNA make up a single guide RNA (sgRNA) complex. Additional specificity is provided by the protospacer adjacent motif (PAM) that directs Cas9 to cut 3 base pairs upstream. a Cas9 cuts DNA via its HNH and RuvC domains that each cut a single DNA strand, resulting in a double-stranded break. b Mutations in one domain or both domains restrict(s) Cas9 to perform single-strand nicking (nCas9) or (c) to possess no catalytic activity (dCas9). Created with BioRender.com

Обычный белок Cas9 состоит из шести доменов: REC I, REC II, Bridge Helix, PAM-Interacting, HNH и RuvC [34, 35]. Rec I является самым большим доменом и обеспечивает связывание направляющей гид РНК. Роль домена REC II еще не была хорошо изучена. Богатая аргинином спираль-мостик имеет решающее значение для индукции активности разрезания при связывании с ДНК [35]. Инициация связывания с целевой ДНК опосредуется PAM-интерактивным доменом, который придает специфичность PAM [9, 34-36]. Нуклеазный компонент Cas9 содержит нуклеазные домены HNH и RuvC, которые расщепляют как целевую, так и не-целевую нити ДНК, создавая двухцепочечный разрыв (DSB) (рис. 2a). Внедрение DSB вызывает либо негомологичное соединение концов (NHEJ), либо гомологом-направленную репарацию (HDR) для исправления разрыва (рис. 3а). NHEJ происходит во время всех фаз клеточного цикла и считается подверженным ошибкам, так как может вносить случайные вставки и делеции пар оснований (indels), в результате чего образуется пул отредактированных клеток, которые могут быть клонированы для нокаута гена. В качестве альтернативы, совместная доставка шаблона трансгена, когда шаблон фланкирован гомологичными рукавами выше и ниже по течению от сайта разрезания, усиливает высокоточную репарацию гомологичной рекомбинации, что приводит к вставке желаемого трансгена в целевой локус мишень, который ограничен фазами G2/S клеточного цикла. Вставка трансгена может состоять из любого маркера экспрессии (например, флуоресцентной молекулы), селектируемого репортера, элемента, который будет повышать или понижать экспрессию целевого гена, или совершенно новой генной кассеты [37].



Fig. 3 Applications of Cas9 variants. a Double-stranded DNA breaks (DSBs) generated by the Cas9 nuclease will be repaired by non-homologous end joining (NHEJ) or homology-directed repair (HDR) within the cell. During NHEJ, the ligase frequently adds random insertions and deletions (indels) to repair the break site. This process is considered as error-prone and used to cause generalized gene disruptions, typically with a loss-of-function outcome. HDR uses a repair template that has homology with sites upstream and downstream of the cut site, allowing for recombination of the template for an error-free repair. For gene editing purposes, an exogenous donor DNA repair template can be designed to insert large foreign DNA constructs into the site, allowing for site-specific knock-in that can result in reduction or gain of activity at the desired locus, or replacement with a new gene cassette. b nCas9 can be tethered to cytidine and adenosine deaminases to allow for single-base pair editing. Cytidine deaminase catalyzes the conversion of CT while adenosine deaminase will catalyze the conversion of AG. Base editing can be used to cause gene disruption without generating DSBs by altering coding regions to introduce premature STOP codons or to interfere with splicing donor/acceptor sites. nCas9 can also be fused to reverse transcriptase (RT), together with a specialized guide RNA (pegRNA) forming a complex that can be used to introduce larger sequence additions into a DNA region without creating DSBs. c Enzymatically dead Cas9 (dCas9) can be tethered to transcriptional activators (e.g., VP64) to potentiate transcription at a specific promotor region targeted by the gRNA, while transcriptional repressors (e.g., KRAB) can attenuate transcriptional activity. dCas9 can be tethered to epigenetic modifying enzymes to catalyze demethylation (e.g., TETs) or active methylation (DNMTs) for temporal regulation of epigenetic motifs and transcriptional activity at gRNA-specified loci promoters. Created with BioRender.com

Индукция DSB позволяет нарушить работу генов и/или вставить трансгены в целевые локусы мишени. Однако существуют риски, связанные с такими разрывами, когда они происходят в нецелевых сайтах, потенциально внося непреднамеренные изменения в геном. Таким образом, точный контроль над тем, когда и где происходят DSB, полезен для снижения частоты непреднамеренных indels и транслокаций [38] и предотвращения отбора инактивированных р53 клеток [39, 40]. Было продемонстрировано, что прямая доставка в клетки предварительно сформированного комплекса Cas9/gRNA рибонуклеопротеина (RNP) позволяет Cas9 сразу же стать активной. RNP также быстро разрушается после интернализации, что уменьшает время присутствия Cas9 для потенциального нецелевого разрезания, но достаточно для поддержания оптимального порога эффективности редактирования по мишени [41-43].

Также было разработано несколько вариантов фермента Cas9 для преодоления недостатков расщепления DSB ДНК . Например, варианты Nickase Cas9 (nCas9) содержат мутации в домене RuvC или HNH, которые делают Cas9 способным разрезать только одну целевую или нецелевую нить ДНК, соответственно [44] (рис. 2b). Использование двух пар комплексов nCas9/gRNA, фланкирующих целевой сайт, позволяет лучше контролировать место возникновения DSB, так как оба комплекса должны находиться в одном и том же месте разреза для индукции DSB, это позволяет уменьшить образование нецелевых DSB [45]. Мутации в обоих каталитических доменах создают каталитически dead вариант Cas9 (dCas9) (рис. 2c). dCas9 может быть легко связан с другими функциональными ферментами, чтобы вызвать различные сайт-специфические модификации, независимо от каталитической активности Cas9 [46].

В процессе редактирования оснований (рис. 3б) введение точечных мутаций в ДНК может создавать или восстанавливать однонуклеотидные варианты, изменять донорские и акцепторные сайты сплайсинга, изменять состав кодонов для изменения аминокислотного кода или вводить преждевременный STOP-кодон [47-49]. Соответственно, редакторы оснований могут вносить четыре переходные мутации, которые заменяют пиримидин на другой пиримидин или пурин на другой пурин (CT, TC, GA, AG) [48]. Ферментами, катализирующими эти реакции, являются цитидин- и аденозиндеаминазы. Цитидиндеаминаза вызывает дезаминирование цитозиновых оснований до урацила. Во время репликации ДНК ДНК-полимераза "считывает" урацил как тимин, поскольку эти основания имеют одинаковые свойства сопряжения оснований, в результате чего в зарождающейся нити ДНК происходит функциональная коррекция цистина на тимин. Аденозиндезаминаза действует аналогичным образом, катализируя дезаминирование аденозина до инозина (I), который "считывается" ДНК-полимеразой как гуанин [50]. Редактирование оснований действует в пределах небольшого окна специфичности, когда оно направлено на точный сайт с помощью направляющей РНК (т.е. на 13-18 пар оснований выше по течению от сайта PAM) [48]. Чтобы избежать внецелевых разрезов [51-55] и при этом достичь максимальной эффективности редактирования, было разработано несколько вариантов Cas9 и деаминаз, которые демонстрируют различную специфичность PAM [56-58] или окна редактирования [59-61]. Первые редакторы оснований использовали dCas9, но более поздние исследования показали, что nCas9 предпочтительнее для более высокой эффективности редактирования, так как она может вызывать nick (никировать) в не-редактируемой нити, чтобы способствовать использованию C-U или AI модифицированной нити в качестве шаблона во время репарации ДНК, что приводит к полностью сохраняемому редактированию [50]. Редакторы оснований цитидиндеаминазы обычно используются для создания преждевременных STOP-кодонов во время транскрипции [48]. Наконец, редакторы оснований аденозиндеаминазы могут использоваться для изменения сайтов доноров/акцепторов сплайсинга.

Основным ограничением редактирования оснований является то, что оно не может быть применено для введения мутаций трансверсии (т.е. пиримидина в пурин и наоборот), а также небольших делеций или вставок. Для решения этой проблемы была разработана альтернативная технология, известная как 'prime editing' ("редактирование праймеров "), которая позволяет осуществлять все возможные преобразования между основаниями и целевые вставки или делеции без индукции DSBs [62]. В этой стратегии nCas9 связывается с ферментом обратной транскриптазы (RT), а prime editing guide RNA (pegRNA) направляет этот комплекс nCas9/RT к желаемому участку генома. Помимо сайта распознавания мишени, pegRNA содержит область связывания, которая ассоциируется с nicked нитью ДНК, служащей праймером, это затем сопровождается тем, что последовательность РНК кодирует новую матрицу. RT синтезирует ДНК с последовательности pegRNA в nicked нити ДНК для дальнейшей ligation. Это создает несовпадение в ДНК, которое может быть откорректировано с помощью второго комплекса nCas9/гидРНК (стратегия редактирования PE3). После вырезания (nicking) из не-отредактированной нити клеточный механизм репарации ДНК исправляет это повреждение, используя в качестве шаблона исходную нить, отредактированную с помощью pegRNA, что приводит к полному внесению желаемой генной правки в целевом локусе мишени (рис. 3б). Прайм-редакторы способны вызывать не только замены с разрешением по паре оснований, но и вставки до 44 пар оснований и делеции до 80 пар оснований [63]. Таким образом, как и редакторы оснований, прайм-редакторы могут быть использованы для модификации пост-митотических клеток и демонстрируют сниженный риск генотоксичности, которая часто сопровождает генерацию множественных DSBs. Для дальнейшего повышения эффективности прайм-редактирования были использованы современные стратегии, модулирующие активность фермента [64, 65] или структуру pegRNA [54, 66].

dCas9 можно использовать для повышения или понижения транскрипционной активности на основе привлечения транскрипционных активаторов или репрессоров к определенным сайтам в процессах CRISPR активации (CRISPRa) и CRISPR интерференции (CRISPRi), соответственно [67-70] (рис. 3c). CRISPRi включает связанный транскрипционный репрессор, такой как домен Krüppel associated box (KRAB), чтобы вызвать репрессию транскрипции на определенном сайте начала транскрипции [46, 71]. В качестве альтернативы CRISPRa включает связывание активаторов транскрипции, таких как VP64, для стимулирования экспрессии эндогенных генов [46, 72]. Кроме того, связывание деметилирующих ten-eleven translocation (TET) methylcytosine dioxygenases или ДНК-метилтрансфераз (DNMTs) может обеспечить локус- и регион-специфические эпигенетические модификации [73, 74] (рис. 3c). Эта стратегия ранее использовалась для воздействия на гиперметилированные промоторные области генов-супрессоров опухолей [75].