Генотерапия обладает значительным потенциалом для клинической медицины, но риски и продолжительность доставки генов должны быть тесно согласованы с предполагаемым клиническим использованием [1]. Долгосрочная экспрессия после генотерапии полезна при заболеваниях, требующих хронического уровня экспрессии белка, таких как наследственные дефициты ферментов или рак, и для этих заболеваний вирусные векторы могут иметь преимущества. Для клиническоого использования, в котором требуется или оправдана только краткосрочная экспрессия генов, доставка нуклеиновых кислот (ДНК или РНК, включая мРНК, siRNA, shRNA и микроРНК saRNA) с помощью невирусных векторов, особенно носителей на химической основе, таких как катионные липиды, катионные полимеры или липидные наночастицы, обеспечивает гораздо более благоприятное соотношение риск/польза. Примеры могут включать предоперационную защиту нейронов или других органов, быструю экспрессию терапевтических препаратов после инсульта, повреждения спинного мозга или травматического повреждения головного мозга, экспрессию заменителей в ЦНС или интерференционные олигонуклеотиды для любого заболевания с известной последовательностью кДНК-мишени, среди многих других. Липидная/полимер-опосредованная трансфекция имеет и другие преимущества перед вирусными векторами, прежде всего, безопасность, низкую иммуногеность и возможность доставки полезной нагрузки практически неограниченного размера [2,3]. На рисунке 1 представлены схемы трансфекции вирусными и невирусными векторами. На рисунке 1А показаны пути трансфекции, используемые лентивирусами и аденовирусами - двумя распространенными вирусами, применяемыми для генотерапии. В обоих случаях ДНК желаемого гена попадает в ядро и может интегрироваться в геном хозяина. На рисунке 1А показаны пути трансфекции, используемые невирусными векторами. На этом рисунке векторы снова несут ДНК, которая попадает в ядро. Здесь ДНК вряд ли интегрируется в геном хозяина. Невирусные векторы также могут упаковывать различные типы РНК, многим из которых не нужно проникать в ядро. Трансфекция с помощью РНК изначально предполагалась полезной для краткосрочной экспрессии терапевтического средства, но интерес к доставке РНК, в частности мРНК, но также siRNA, shRNA и miRNA, в качестве долгосрочного лечения множества заболеваний не только набрал обороты, но и стал реальностью в виде вакцин COVID-19 [4].



Figure 1. Schematic diagrams of viral and non-viral transfection of the cell. (A) Lentiviral and adenoviral transfection. These are two common viruses used for gene therapy transfections. The packaged nucleic acid escapes from the endosome and is directed to the nucleus if DNA is packaged or is replicated into DNA if RNA is packaged and directed into the nucleus, where integration into the genome occurs. (B) Non-viral vector transfection. Here, the packaged DNA is once again released from the endosome; DNA is directed into the nucleus; mRNA remains in the cytoplasm. Small RNA molecules, such as siRNA, will also enter the nucleus [5].

Катионный липид или полимером опосредованный перенос генов особенно подходит для временной экспрессии генов, как в фундаментальных исследованиях, так и в отдельных клинических применениях. Катионные липиды обычно состоят из полярной головной группы и неполярного симметричного или ассимметричного углеродного хвоста, а также могут включать сигналы ядерной локализации (NLS), антитела, полимеры или другие целевые молекулы. Отрицательно заряженные нуклеиновые кислоты конденсируются и самособираются в гетерогенные комплексы при смешивании с катионными липидами [6]. Структура и размер этих комплексов влияют на эффективность трансфекции и зависят от температуры, концентрации, соотношения зарядов, буфера, времени и состава липидов. Эти комплексы липид/нуклеиновая кислота защищают нуклеиновые кислоты от деградации во внеклеточной среде [7,8]. Многочисленные лаборатории [9-11], включая нашу [9], исследовали предельные параметры трансфекции, опосредованной катионными липидами, с целью повышения эффективности трансфекции. Первыми катионными полимерами, использованными для упаковки нуклеиновых кислот, были поли-лизин (PLL) и полиэтиленимин (PEI). Эти полимеры склонны к образованию комплексов с нуклеиновыми кислотами в более мелкие и однородные частицы, что повышает эффективность трансфекции. Однако поверхностные заряды обоих типов комплексов вызывают некоторую цитотоксичность [10]. Также была проведена обширная работа по созданию катионных полимеров для повышения эффективности трансфекции и снижения токсичности [12,13].

Препятствия для трансфекции нуклеиновых кислот, опосредованной липидами или полимерами, включают: (1) перенос комплекса нуклеиновой кислоты/липида через внеклеточную среду в ткань мишени; (2) ассоциация и поглощение комплекса нуклеиновой кислоты/липида клеткой-мишенью [14]; и (3) внутриклеточное высвобождение нуклеиновой кислоты из комплекса нуклеиновой кислоты/липида [12]. Трансфекция ДНК имеет дополнительный барьер, связанный с переносом в клеточное ядро. Дополнительные барьеры существуют для некоторых тканей-мишеней, включая центральную нервную систему (ЦНС), защищенную ВВВ и состоящую в основном из неделящихся клеток.

В настоящее время более 70% клинических испытаний, в которых в качестве терапии используются нуклеиновые кислоты, используют ту или иную форму вирусного вектора, включая ретровирусы, лентивирусы, аденовирусы и адено-ассоциированные вирусы [13]. Эти векторы, часто в высоком титре, могут обеспечить доставку нуклеиновой кислоты в цитоплазму и ядра клеток, где ДНК интегрируется в геном, но ограничены размером нуклеиновой кислоты, которая может быть упакована. Интеграция в геном - желательный эффект для долгосрочной терапии заболеваний, вызванных, например, дефицитом генетических ферментов, таких как тяжелый комбинированный иммунодефицит и болезни хранения гликогена [15,16]. Ранние клинические испытания этих векторов выявили такие проблемы, как иммунологические (в том числе аллергические) реакции [17], эффект "вне мишени" и беспорядочная интеграция в геном, приводящая к раковым заболеваниям, таким как лейкемия [18]. Со времени этой ранней работы вирусные векторные системы были модифицированы для повышения безопасности, но недавно было зарегистрировано еще одно неблагоприятное событие после доставки вирусного вектора. Пациент, участвовавший во II фазе испытаний AAV.7m8-aflibercept, вирусного вектора для интравитреальной инъекции для лечения диабетического макулярного отека, потерял зрение в леченом глазу [19]. Помимо серьезных побочных явлений, доставка вирусных векторов не во всех случаях может быть постоянным решением проблемы генетического заболевания. Heller и др. следили за мышами в мышиной модели болезни Krabbe (мыши Twitcher), которых лечили геном AAV9-галацитозилцерамида, когда они были новорожденными. Вектор доставлялся одним из трех методов: интрацеребральная инъекция, интратекальная инъекция или внутривенная инъекция. Мыши демонстрировали снижение центральной и периферической невропатологии и длительную выживаемость, но в возрасте 6-8 месяцев у них начали появляться небольшие очаговые участки демиелинизации в головном мозге. Это позволило предположить нарушение регуляции терапевтического GALC, вероятно, из-за истощения трандуцированной эписомальной ДНК [20]. Работа над системами, использующими вирусные векторы, будет продолжена с целью повышения их безопасности в свете потенциального преимущества единственного лечебного метода.

Потенциальная опасность вирусных векторов заставила многих исследователей рассмотреть возможность использования невирусных векторов для доставки терапевтических нуклеиновых кислот, в том числе для лечения генетических заболеваний. Патисиран, невирусный вектор в виде липидной наночастицы, несущей siRNA, направленную на ингибирование белка транстиретина для лечения наследственного транстиретинового амилоидоза, недавно получил одобрение FDA [21]. Пациенты, получающие лечение препаратом Патисиран, получают внутривенное введение вектора один раз в 3 недели. Нуклеиновые кислоты, доставляемые в клетки невирусными векторами, обычно не интегрируются в геном хозяина, хотя это может рассматриваться как преимущество и как недостаток в зависимости от цели предлагаемой терапии нуклеиновыми кислотами. Исторически сложилось так, что эффективность доставки невирусных векторов была ниже, чем у вирусных векторов, и большое количество работ было направлено на повышение эффективности трансфекции in vitro, ex vivo и in vivo, в том числе и в нашей лаборатории [22-25]. Как правило, невирусные векторы доставляются в интересующие клетки или ткани физическими или химическими методами. Физические методы включают электропортацию, сонопортацию, лазерное облучение, магнитофекцию и микроинъекцию [26], которые используют электричество, звук, лазеры, магнитные частицы и микрокатетеры, соответственно, чтобы открыть отверстия в клеточных мембранах для проникновения чужеродных нуклеиновых кислот. Все эти методы несут риск необратимого повреждения клеток и их гибели [27]. Микроинъекция - это прямое введение нуклеиновых кислот в клетки, и этот метод требует как минимум специально обученного персонала. Все вышеперечисленные методы могут трансфицировать небольшое количество клеток, что делает их полезными в первую очередь для трансфекции клеток ex-vivo с последующим введением трансфицированных клеток в клетки или ткани органа/организма. Ввиду ограниченной клинической полезности этих методов, большее внимание уделяется химическим методам трансфекции нуклеиновых кислот, а точнее, трансфекции, опосредованной липидами или полимерами. Достижения в области химической невирусной трансфекции были сосредоточены на химических модификациях, таких как асимметрия липидов и аминолипиды [28,29]. Также были изучены различные катионные полимеры [24]. Эти усилия были направлены на улучшение упаковки, стабильности, эндосомного выхода, высвобождения груза и целенаправленного воздействия на конкретные ткани или органы. Таргетинг (целенаправленное воздействие) в ткани и органеллы обычно зависит от пептидов, антител и других белков. Высвобождение груза нуклеиновой кислоты из липидного или полимерного носителя зависит от дисульфидных связей [30]. В таблице 1 приводится краткое описание некоторых современных достижений в области упаковки и стабильности средств доставки нуклеиновых кислот, а также см. рисунок 2 ниже.



Figure 2. Chemical structures of nucleic acid delivery vehicles described in Table 1.



Table 1. Properties of effective nucleic acid delivery vehicles. This table shows necessary properties of effective cationic lipid- and polymer-based nucleic acid delivery vehicles where newer materials have been successful. Chemical structures are shown in Figure 2 below.

Катионные липиды и полимеры имеют различные преимущества. Катионные полимеры склонны к комплексообразованию с нуклеиновыми кислотами в более мелкие и однородные наночастицы, что повышает эффективность трансфекции. Их высокий катионный заряд также способствует эффективному эндосомальному поглощению, но этот заряд также несет в себе некоторую цитотоксичность [10]. Кроме того, полное понимание роли компонентов этих полимеров в трансфекции делает рациональный дизайн более труднодостижимым и затрудняет перевод в клинику [33-35]. Катионные липиды также показали некоторую цитотоксичность и потребовали обширной работы по разработке рецептур для оптимизации идеальных комбинаций и концентраций липидных компонентов. Комплексы катионных липидов не так стабильны, как катионные полимеры, но новые работы в этой области показывают их перспективность [36-38]. Масштабирование катионных липидов проще [37,39,40], чем катионных полимеров, и в целом они продемонстрировали перспективность для клинического применения.

Как ДНК, так и РНК, распознаваемые иммунной системой как чужеродный генетический материал, быстро разрушаются в биологических системах. Поэтому обе нуклеиновые кислоты представляют трудности при рассмотрении в качестве терапевтических средств, и поэтому инкапсуляция в вирусный или невирусный вектор имеет решающее значение. Использование ДНК (в основном в виде кДНК) считается предпочтительным для терапии, требующей длительной экспрессии, такой как заместительная терапия при генетических заболеваниях. Встраивание ДНК в геном с помощью невирусного вектора остается теоретической, хотя и крайне отдаленной возможностью, и даже этот редкий шанс исключен в случае мРНК, которые транскрибируются в цитоплазме и не должны достигать ядра. Это не относится к некоторым малым РНК, нацеленным на промоторы генов или при CRISPR. При доставке ДНК возникают дополнительные препятствия, связанные с транспортировкой через цитоплазму, избеганием путей деградации и транзитом через ядерную мембрану. Эписомная ДНК, находящаяся в цитоплазме, скорее всего, не является устойчивой по целому ряду причин [37,41]. Эписомная ДНК генов может быть утрачена в результате рекомбинации, разрушения нуклеазами и разделения по неядерным клеточным компартментам. ДНК также может быть утрачена в результате деления клетки или может утратить свою функцию в результате замалчивания воспринимаемой чужеродной ДНК.

Несмотря на многочисленные успехи, достигнутые in vitro и на животных моделях с использованием как ДНК, так и РНК, преимущество РНК заключается в том, что она более эффективно трансфицируется в неделящиеся клетки [42]. Одним из механизмов проникновения чужеродной ДНК в ядро является деление клетки. Хотя РНК несколько менее стабильна, чем ДНК, синтезированная in vitro РНК может быть модифицирована для повышения ее стабильности и снижения иммуногености. Многие РНК малого размера (siRNA, saRNA, shRNA, miRNA) легче защитить и упаковать, и, используя их, возможно, легче добиться эффективной трансфекции. Некоторые из этих малых РНК должны попасть в ядро, чтобы проявить эффект, и более высокая эффективность трансляции может привести к большему количеству молекул, достигших этой цели. мРНК, попав в клетку, быстро транслируется, не попадает в ядро и не может интегрироваться, поэтому может быть лучше для краткосрочной терапии. Повышенная эффективность трансфекции в неделящихся клетках, таких как нейроны, делает РНК предпочтительной нуклеиновой кислотой для трансфекции ЦНС [42]. По всем этим причинам РНК представляется оптимальной для повторяющейся геной терапии ЦНС. Даже для лечения генетических заболеваний необходимо взвесить риск и преимущества вирусных векторов, уровни их экспрессии и необходимую продолжительность экспрессии в сравнении с преимуществами РНК и ДНК при конкретных заболеваниях.

4. Катионные липиды используются для защиты нуклеиновых кислот и повышения эффективности процесса трансфекции уже несколько десятилетий. Felgner et al. определили три функциональных свойства, необходимых для трансфекции с использованием катионных липидов: спонтанный захват нуклеиновой кислоты катионным липидом с образованием липоплексов, увеличение клеточного поглощения, обусловленное взаимодействием положительно заряженных комплексов с биологическими поверхностями, и слияние с плазмалеммой или эндосомой [43]. Липоплексы, образованные в ранних экспериментах, повышали эффективность трансфекции, но также демонстрировали некоторую цитотоксичность, проявляющуюся как в виде апоптоза, так и в виде ингибирования иммунной системы [44]. В последние годы была проделана большая работа по повышению эффективности и снижению токсичности этих липоплексов. Были изучены все аспекты структуры этих катионных липидов; токсичность была связана с катионной головной группой и ее мультивалентной природой, длиной и степенью ненасыщенности гидрофильных доменных цепей и связывающими функциями. Эффективность трансфекции связана со всеми этими структурными особенностями, и вариации каждой из них могут повысить эффективность трансфекции для клетки или органа мишени [45,46].

Липидные наночастицы являются еще одним средством доставки нуклеиновой кислоты в клетки/ткани/организмы и используются в фармацевтической промышленности для доставки плохо растворимых лекарств. Их безопасность хорошо известна при дермальном, глазном и пероральном введении, но использование поверхностно-активных веществ для стабилизации может вызывать воспалительные реакции при других способах введения [29]. Изучение возможности их использования для переноса генетического материала стало более реальным с применением липоплексов, позволяющих инкапсулировать более нейтральный препарат. Состав этих наночастиц может варьироваться в широких пределах, но, в качестве примера, липидные наночастицы, созданные для переноса мРНК для вакцин SARS-CoV2, состоят из комплекса катионный липид:мРНК, добавления полиэтилгликозилированного липида для стабильности, а также фосфолипида и холестерина для структуры [33]. Как и в случае с более простыми липоплексами (комплексы катионный липид: нуклеиновая кислота), специфическая оптимизация этих частиц может повысить эффективность трансфекции и нацелить частицы на ткани/органы [3]. Из-за более сложной природы липидных наночастиц по сравнению с липоплексами, их синтез намного сложнее, чем создание катионных комплексов липид:нуклеиновая кислота, и может включать использование гомогенизации с высоким сдвигом, ультразвуковой обработки, эмульгирования растворителем и выпаривания, хотя эти процессы хорошо известны в промышленности [34]. Недавно появились сообщения об упрощенных химических структурах, а также об упрощенном синтезе комплексов LNP:RNA. Kuboyama и др. описали катионный липид (3-гидроксилпропил) дилинолеамин), который может быть получен в ходе процесса в одну стадию. Затем этот липид можно смешать с ApoB-siRNA и с этаноловым раствором липидов, включая вышеуказанный катионный липид, затем отфильтровать, разбавить и доставить в клетки культуры и/или мышам. Измерение уровня ApoB показало, что ингибирование синтеза ApoB происходило как in vitro, так и in vivo, и что у мышей не наблюдалось никаких побочных эффектов [35]. Blakney и др. сообщили, что saRNA может быть соединена с соотв. LNPs таким образом, что нуклеиновая кислота находится на внешней стороне наночастицы. Было показано, что эти комплексы LNP:saRNA доставляют saRNA-fluc с той же эффективностью, что и LNPs, инкапсулирующие saRNA, как в культивируемые клетки, так и в организм мышей BALB/c [38], предполагая, что saRNA так же хорошо защищена от деградации при прилипании к внешней поверхности LNPs, как и при инкапсуляции. Это может навести на мысль о возможности создания полезных "общих" LNPs. Продолжается работа по повышению стабильности, снижению токсичности, простоте синтеза и эффективности трансфекции как для катионных липидов, так и для LNPs. На сегодняшний день единственный генетический препарат, представленный на рынке с использованием невирусной системы доставки, Патисиран, инкапсулирован в липидную наночастицу [21].

Заболевания центральной нервной системы, такие как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и опухоли мозга, были устойчивы к традиционным методам лечения, по крайней мере, частично из-за почти непроницаемого барьера "кровь-мозг" (BBB). Генотерапия представляет собой новый путь для лечения этих заболеваний, и многие исследования посвящены именно таким подходам. Несколько исследований показали терапевтические преимущества трансфекции катионных липидов: siRNA или LNP:siRNA в уменьшении клеток глиобластомы либо in vitro, либо когда опухолевые клетки были посеяны подкожно у мышей (ex vivo), но BBB не является в этих исследованиях фактором +++ [47]. Доставка pDNA остается в центре внимания большинства исследований; в недавнем обзоре Wang et al. перечислили 20 работ, посвященных доставке нуклеиновых кислот в ЦНС, но только в 6 описана трансфекция РНК [48]. Доставка нуклеиновых кислот в качестве лекарств/терапии в ЦНС сталкивается со всеми проблемами доставки в любой другой орган тела, такими как быстрая биодеградация нуклеиновых кислот и иммуногеность продуктов распада нуклеиновых кислот, но, кроме того, доставка в ЦНС должна преодолеть препятствие в виде гематоэнцефалического барьера (BBB). Существует два подхода к барьеру "кровь-мозг". Первый подход заключается в том, чтобы обойти ВВВ. Сюда входят интратекальные инъекции, интрапаренхимальные инъекции и разрушение ВВВ путем создания локальной воспалительной реакции, вызывающей временное открытие плотных соединений, например, с помощью маннитола, или через такое событие, как травматическое повреждение мозга [49,50]. Альтернативный подход заключается в адаптации препарата для использования известных транспортных систем ВВВ [51]. Оба метода имели успех [52].

Внутричерепное введение комплексов нуклеиновых кислот было одним из первых подходов к обходу BBB. Интракортикальное введение мышам pVEGF-GFP, соединенного с катионным липидом, вызывало ангиогенез в областях, окружающих места инъекции/трансфекции [53]. Этот подход также использовался для трансфекции RNAi. Pfeifer и др. смогли ввести RNAi, предназначенные для подавления экспрессии прионового белка, мышам, инфицированным scrapie. В данном случае RNAi была инкапсулирована в лентивирусный вектор. Результаты были схожи в том, что результаты были положительными, но только локально вокруг места интрапаренхимальной инъекции [54].

Трансфекция ЦНС нуклеиновыми кислотами в липоплексах также может быть достигнута путем доставки липоплекса в то время, когда ВВВ нарушен. Интраназальная доставка катионного липида: GFP-мРНК оказалась успешной [55] при демонстрации кратковременной экспрессии GFP при интраназальном введении мышам 3 мг/кг (высокая доза) комплекса. Предполагается, что дозировка для интраназальной доставки требует такого большого объема препарата, что он нарушает ВВВ, по крайней мере, времено [52]. Назальная доставка терапевтических препаратов была продемонстрирована на мышиных моделях и, вероятно, работает за счет преходящего нарушения BBB при высокой дозе [50,52]. Доставка siRNA:LNP в ЦНС также была продемонстрирована после внутривенной инъекции мышам, перенесшим травматическое повреждение мозга [56].

Другим способом преодоления ВВВ является использование эндогенных транспортных механизмов внутри ВВВ. Для доставки малых молекул существуют carrier-mediated transporters (CMT). Эти транспортеры доставляют витамины и другие питательные вещества в мозг. Системы CMT включают, например, GLUT1, LAT1 (большой транспортер нейтральных аминокислот) и CAT1 (транспортер катионных аминокислот). LAT1 - это транспортная система, которая доставляет L-DOPA, габапентин и AAV9 в мозг [52]. Другие молекулы для получения доступа в ЦНС полагаются на рецептор-опосредованные транспортеры. В качестве примера можно привести рецептор инсулина и рецептор трансферрина. Используя преимущества транспортировки вектора AAV9 через BBB, 15 педиатрических пациентов со спинальной мышечной атрофией 1 получили одну внутривенную дозу вектора AAV9, несущего кДНК замену гену выживания двигательных нейронов 1. Через два года после лечения все 15 пациентов были живы и не имели проишествий по сравнению с 8% выживаемостью в исторической когорте [57]. Рецептором опосредованные транспортеры для ВВВ также были изучены в качестве механизмов для пересечения ВВВ. На эти транспортеры должны направлять специфические лиганды. Zhang и др. синтезировали "иммунолипосомы", инкапсулирующие кДНК-LacZ. Эта система доставки несет моноклональное антитело к рецептору инсулина человека, что позволяет иммунолипосоме пересекать ВВВ. При внутривеном введении макакам-резус бета-галактозидазы было обнаружено, что она широко экспрессируется во всей ЦНС [56]. Эти системы доставки были названы липосомами Троянский конь (THLs) [52]. Также сообщалось о доставке siRNA. Wang и др. создали липидную наночастицу, которая переносила пептид GCN для опосредованного рецепторами транспорта через BBB и пептид tet1 для рецепторов мишеней на нейронах в ЦНС. Этот LNP инкапсулировал siRNA на β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1 (BACE 1). Снижение активности BACE 1 уменьшит выработку предшественника амилоида, участвующего в развитии AD. Двойным трансгенным мышам (APP/PSI) (модельная система для AD) внутривено вводили LNP:siRNA-BACE 1 и через 1 час приносили в жертву. Иммуногистохимия показала 50% снижение мРНК BACE 1, а также уменьшение количества амилоидных бляшек [58].

ВВВ можно обойти путем прямого введения. Thakker и др. использовали интратекальное введение siRNA для демонстрации широкомасштабного ингибирования экспрессии белка [59]. В этом случае голую siRNA, нацеленную на последовательности, кодирующие усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), вводили в дорсальный третий желудочек мышей, сверхэкспрессирующий EGFP. Снижение экспрессии белка наблюдалось в тканях мозга, особенно вблизи места инъекции. Чтобы продемонстрировать более широкую эффективность, siRNA, направленной на подавление экспрессии белка-транспортера дофамина (DAT-1), была аналогичным образом введена в дорсальный третий желудочек в виде голой siRNA. Наблюдалось значительное снижение DAT-1 во всей ткани мозга. Подобная инъекция мышам также использовалась для доставки невирусного вектора, несущего siRNA, мышам Thy1-aSyn, моделирующими болезнь Паркинсона. В данном случае siRNA против синуклеина (SNCA) была соединена с разветвленным PEI F25-LMW и введена в боковой желудочек мышей. Через пять дней после трансфекции мышей принесли в жертву, и было обнаружено, что экспрессия мРНК SNCA в стриатуме снижена на 65%, а белка SNCA - на 59% по сравнению с контрольными животными [60].

В нашей лаборатории мы неоднократно демонстрировали на разных видах животных и в течение многих лет быстрое и широкое распространение и экспрессию различных репортерных и нейропротекторных генных последовательностей путем интратекального введения комплекса нуклеиновых кислот. Anderson и др. продемонстрировали стабильность комплексов катионный липид:мРНК в спинномозговой жидкости (СЖ) человека и крысы [61]. Комплекс катионных липидов сохранял мРНК в течение не менее 4 часов по сравнению с менее чем 5 минутами для голой мРНК. Мы также показали, что интратекальная доставка через cisterna magna и боковой желудочек комплексов катионный липид:pDNA приводит к широкой экспрессии белка, а также к биологическому эффекту. Трансфекция путем доставки в cisterna magna крыс комплекса катионный липид:pDNA-fLUC обеспечивает широкую экспрессию люциферазы в ЦНС, которая достигает пика примерно через 72 часа, но видна при визуализации биолюминесценции в реальном времени с помощью системы In Vivo Imaging System (IVIS) компании Caliper Life Sciences (Хопкинтон, штат Массачусетс, США) в течение как минимум 10 дней после трансфекции [62]. Кроме того, в мышиной модели pDNA, кодирующая иммуномодулирующий слитый белок OX40-TRAIL, была соединена с MLRI и доставлена в цистерну магна мышей до начала экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE), модели рассеянного склероза (РС). У трансфицированных мышей наблюдалось снижение тяжести заболевания [23]. Используя тот же катионный липид, миристоил лауроил ингибитор Розенталя (MLRI), соединенный с мРНК-fLUC, транслированной in vitro c конструкции pDNA-fLUC, и введенный крысам путем инъекции в cisterna magna, мы обнаружили экспрессию люциферазы, опять же с помощью IVIS визуализации. Крысам вводили 150 µг/кг мРНК в комплексе с MLRI путем введения в цистерну в течение 15 минут 120 µл. В течение 1 часа после трансфекции у крыс получали повторные изображения каждый час для поиска экспрессии люциферазы. В каждой временной точке животным вводили внутривенно дозу люциферина и сразу же проводили визуализацию. Изображение проверяли каждые 2 мин до тех пор, пока свет не переставал обнаруживаться. Цель повторной визуализации состояла в том, чтобы определить наиболее интенсивный период излучения света крысой после однократной дозы люциферина и подтвердить, что свет больше не обнаруживается до следующей часовой временной точки и дозы люциферина.



Figure 3. Flow diagram of the in vivo imaging experiment. A luciferase mRNA;cationic lipid complex was slowly injected into the cisterna magna of anesthetized rats. After 1 h, rats were placed into a light tight box and their background light was measured. The animals were then intravenously injected with luciferin and quickly returned to the light tight box. Emitted light was again quantified, and photos were taken of the rats with superimposed images of the emitted light. Emitted light was measured every 2 min for 1 min until only background levels of light were detected. This short time course was repeated hourly until only background light was detected, sometime around 4-7 h after the initial lipid complex injection into the CSF.

На рисунке 4 показаны изображения одного из таких временных интервалов от минуты к минуте. Как видно из рисунка, пик светового излучения наступает очень быстро (1-3 мин), и свет больше не обнаруживается через 15 мин после внутривенного введения люциферина. Чтобы регистрировать только свет, вызванный распадом люциферина, перед каждым введением люциферина проводилось подсчет фонового света, который вычитался из подсчетов, измеренных после введения люциферина. Световое излучение регистрировалось до 7 ч после трансфекции. На рисунке 5 показан репрезентативный часовой временной график, демонстрирующий экспрессию люциферазы в течение нескольких часов после трансфекции. Опять же, фоновые показатели вычитаются из общего количества, измеренного в каждой временной точке. На сегодняшний день это единственные изображения in vivo, демонстрирующие функционирование трансфецированной мРНК после CSF введения в живого животного. Наконец, одна крыса была принесена в жертву через 3 часа после трансфекции липоплексом MLRI:mRNA-fLuc (через cisterna magna). Мозговая ткань от этого трансфицированного животного, а также от контрольного животного, была секционирована и обработана для иммуногистохимии, как было описано ранее [62] Стирание было обнаружено с помощью кроличьего моноклонального антитела против люциферазы. На рисунке 6 показаны несколько срезов ткани мозга при разном увеличении. Люцифераза была широко распространялась в тканях мозга трансфицированной крысы, но не в контрольной крысе.



Figure 4. Time course demonstrating the duration of luciferase activity after a single intravenous injection of its substrate, luciferin. Frames (A-C) are three different representations of the time course data. (A): Images from the IVIS living image software of light emission from the head of the rat. (B): Emitted photon counts shown in graph form. (C): Photon counts of emitted light collected by the cooled CCD camera of the IVIS imaging system. Background photon counts were collected before luciferin injection and subtracted from counts after luciferin dosing.



Figure 5. Hourly time course after transfection with mRNA-fLUC. Starting 1 h after transfection of the liposome into the CSF of a rat, the animal was given an intravenous dose of luciferin and imaged every 2 min until light was no longer detected. Peak counts of photon emissions from each hourly time point are shown in the figure (after subtraction of background photon counts). Frames (A-C) show the data from the time course in three representations. (A): IVIS images showing light emission over the rat head. (B): Graphic representation of the counted photon emissions from each hourly time point. (C): Table showing the hourly photon emission counts.



Figure 6. Immunohistochemistry showing the widespread presence of luciferase expression in the brain of a rat after a single cisterna magna injection of MLRI:mRNA-fLUC, as well as a control, non-transfected rat. Rats were infused with 8 ?g mRNA that encoded for luciferase in a 120 ?L formulation with cationic lipid, using a syringe pump over 30 min. The animals were euthanized 3 h after in vivo imaging and were perfused, sectioned (30 ?L), and stained using a monoclonal antibody and immunofluorescent secondary Ab. Left panels: (A): IVIS image of the transfected animal prior to intravenous luciferin injection. 20? and 40? control sections are below (A). Right panels: (B): IVIS imaging of the transfected animal after intravenous luciferin dosing. 20? and 40? sections from the transfected animals are below frame (B). Dark staining representing expressed luciferase is seen in the sections from the transfected animal, while there is no such staining in the sections from the control animal.

Обнаружение с помощью IVIS-визуализации света от распада люциферина у трансфецированных крыс потребовало оптимизации нескольких экспериментальных параметров. Таблица 2 суммирует эти усилия. Эффективность транскрипции in vitro (IVT) плазмиды pDNA:fLuc была повышена с помощью насадки ARCA (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), а затем вся IVT мРНК была проверена на биологическую активность in vitro путем трансфекции в клетки культуры ткани CHO-K1. Кроме того, фоновый свет был сведен к минимуму путем отбора крыс с помощью IVIS-визуализации непосредствено перед трансфекцией, а также путем сбривания шерсти с головы каждого трансфицированного животного.



Table 2. Optimization of transfection and light detection: Light detection using IVIS imaging required optimization of the signal from transfected rats as well as background light emission. The table below summarizes the steps taken to optimize our luciferase specific light signal.

Генотерапия стала активным направлением исследований многих заболеваний ЦНС. Текущие исследовательские программы, использующие модельные системы для AD, PD, MS инсульта и опухолей мозга, активно ищут способы лечения и терапии этих и других заболеваний ЦНС. После того, как кандидаты на лечение будут найдены, необходимо будет решить проблему доставки препаратов через ВВВ и трансфекции в популяцию клеток, которая в основном не делится. Для доставки генотерапии в ЦНС использовались как вирусные, так и невирусные векторы, но невирусные векторы имеют ряд преимуществ, включая меньшую токсичность, меньшую иммуногенность и возможность упаковки большого количества нуклеиновых кислот. Невирусные векторы включают физические методы трансфекции, но невирусные векторы на основе липидов, такие как катионные липиды, комплексы нуклеиновых кислот и липидные наночастицы, содержащие нуклеиновую кислоту, имеют больший потенциал для трансфекции всего органа или даже полной системной трансфекции и были в центре внимания исследователей. Десятилетия назад катионные липиды были впервые соединены с нуклеиновыми кислотами для их защиты, а также для нейтрализации сильно отрицательного заряда этих макромолекул. С тех пор химические манипуляции с катионными липидами, а также их включение в состав LNPs повысили эффективность трансфекции и снизили токсичность и иммуногенность. В последнее время возрос интерес к использованию РНК для генотерапии ЦНС. По крайней мере, частично это объясняется тем, что трансфекция неделящихся клеток с помощью РНК более эффективна, чем трансфекция с помощью ДНК. Хотя генотерапия на основе РНК менее долговечна, чем терапия на основе ДНК, мы продемонстрировали эффект, сохраняющийся дольше, чем можно было бы ожидать. Хотя существует лишь несколько примеров РНК-препаратов, одобренных Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США, Патисиран - это препарат siRNA для лечения генетического заболевания, который вводится внутривенно один раз в 3 недели, что является разумным режимом лечения.

Интратекальное введение - это средство, которое мы использовали для успешного преодоления BBB и трансфекции ЦНС с помощью единичных инъекций CSF. Мы показали, что трансфекция как pDNA, так и мРНК возможна, эффективна и может быть прослежена во времени с помощью репортерного гена и визуализации in vivo. Был достигнут огромный прогресс в преодолении препятствий на пути генотерапии ЦНС, и фокус на терапии на основе РНК, а также методы доставки, которые пересекают BBB, вероятно, увеличат скорость этого прогресса в ближайшие годы.