Colorectal cancer (CRC) is the third most commonly diagnosed malignancy worldwide and is responsible as one of the main causes of mortality in both men and women. Despite massive efforts to raise public awareness on early screening and significant advancements in the treatment for CRC, the majority of cases are still being diagnosed at the advanced stage. This contributes to low survivability due to this cancer. CRC patients present various genetic changes and epigenetic modifications. The most common genetic alterations associated with CRC are p53 and KRAS mutations. Gene therapy targeting defect genes such as TP53 (tumor suppressor gene encodes for p53) and KRAS (oncogene) in CRC potentially serves as an alternative treatment avenue for the disease in addition to the standard therapy. For the last decade, significant developments have been seen in gene therapy for translational purposes in treating various cancers. This includes the development of vectors as delivery vehicles. Despite the optimism revolving around targeted gene therapy for cancer treatment, it also has various limitations, such as a lack of availability of related technology, high cost of the involved procedures, and ethical issues. This article will provide a review on the potentials and challenges of gene therapy targeting p53 and KRAS for the treatment of CRC.

Рак является одной из основных проблем здравоохранения, затрагивающих мужчин и женщин во всем мире. По оценкам, в 2020 году будет зарегистрировано 19,3 миллиона новых случаев рака и почти 10,0 миллионов смертей от рака. Колоректальный рак (CRC) был зарегистрирован как третья наиболее часто диагностируемая злокачественная опухоль в мире, после рака молочной железы и легких. CRC занимает второе место среди причин смерти от рака после рака легких. Развитые страны имеют самый высокий риск развития рака толстой и прямой кишки [1].

Хирургическая резекция и традиционная терапия, такая как химиотерапия, уже давно считаются "золотым стандартом" лечения CRC [2]. Несмотря на многочисленные инициативы по повышению осведомленности населения о раннем скрининге CRC и достижения в терапии рака, большинство случаев диагностируется на поздних стадиях, что обуславливает плохой прогноз этого рака [3,4].

Рак возникает в результате накопления соматических мутаций и других генетических изменений, которые влияют на контрольные точки деления клеток и приводят к аномальному росту клеток и, в конечном счете, к возникновению опухоли. Происходит процесс канцерогенеза, при котором аномальные клетки приобретают выгодные биологические способности, известные как отличительные признаки рака [5]. Как и при других типах рака, в прогрессировании CRC участвуют генетические и эпигенетические изменения. Мутации TP53 (опухолевого супрессора) и KRAS (онкогена) являются одними из наиболее часто регистрируемых генетических изменений при CRC [6].

Традиционные методы лечения, такие как химиотерапия, вызывают серьезные побочные эффекты у пациентов [7]. Необходимо, чтобы более безопасные и эффективные варианты были включены в лечение рака. Одним из предлагаемых методов лечения CRC является направленная генотерапия. Этот подход направлен на увеличение продолжительности жизни пациентов и снижение риска рецидива заболевания. Прогресс в области генотерапии открывает перспективы для различных инновационных методов лечения, которые, вероятно, станут заметными в улучшении выживаемости онкологических больных. Перенос генов - это один из методов лечения, при котором новые гены вводятся в злокачественную клетку или в окружающую ткань, чтобы вызвать гибель клеток или замедлить распространение рака. Гибкость этой методики и возможность использования широкого спектра генов и векторов закрепили ее успешные результаты во многих клинических испытаниях. По мере развития технологий генотерапии в онкологии они могут использоваться самостоятельно или в сочетании с текущими или традиционными методами лечения рака [8,9].

CRC - это рак, возникающий из толстой и прямой кишки. Он начинается с трансформации нормальных крипт толстой кишки в доброкачественные кишечные полипы. Небольшое количество из них (аденоматозные полипы) прогрессируют в аденому и становятся раковыми образованиями (злокачественная неоплазия) и метастазами. Большинство полипов, таких как воспалительные и гиперпластические полипы, являются доброкачественными и не относятся к категории пред-злокачественных образований [10]. Большинство CRC являются аденокарциномами. В развитии CRC происходит постепенный переход, также называемый "многоступенчатым туморогенезом", и с каждой стадией связаны специфические генетические изменения в опухолевых супрессорах или онкогенах [11,12,13].

CRC можно разделить на четыре группы на основе их консенсусных молекулярных подтипов (CMS), а именно [14];

(a) CMS1: микросателлитная нестабильность (MSI) и сильная активация иммунных компонентов

(b) CMS2: демонстрирует эпителиальную дифференцировку и ап-регуляцию связанного с крыльями сайта интеграции (WNT) и сигнализации MYC;

(c) CMS3: выраженная метаболическая дисрегуляция; и

(d) CMS4: выраженная экспрессия генов, совместимых со стромальной инвазией, эпителиально-мезенхимным переходом (EMT), трансформирующим фактором роста-бета (TGF-?β) и ангиогенезом.

Небольшая часть мутаций, называемых "драйверами", ответственна за клеточные преобразования, которые приводят к образованию рака. Драйверные мутации характеризуют молекулярные фенотипы опухолей и выступают в качестве прогнозов клинических исходов для пациентов [15]. Клетки, несущие драйверные мутации, приобретают селективное преимущество, что приводит к их пролиферации, и эти мутации прошли положительный отбор в процессе эволюции рака. Они рассматриваются как часть "генов рака". Помимо драйверных мутаций, наши клетки накапливают и другие мутации, называемые "пассажирскими", которые, на первый взгляд, могут не влиять на прогрессирование рака. Несмотря на это, пассажирские мутации вызывают повышенный интерес, поскольку они могут влиять на эпигенетику, иммуногенность или ответ на терапию у онкологических больных [16]. Три ключевых игрока в развитии CRC - это гены-супрессоры опухолей, онкогены и гены несоответствия-репарации. Мутации в этих генах могут возникать в период беременности или приобретаться в течение жизни (наследственные или соматические мутации). Хотя многие ученые больше внимания уделяют роли соматических, а не зародышевых мутаций в предрасположенности к раку, неоспоримо, что наследственный аспект мутаций (зародышевые мутации) играет важную роль в развитии и метастазировании рака, что находит клиническое применение в онкологических исследованиях. CRC представляет собой один из самых больших процентов семейных случаев [17,18]. Следует также отметить, что большинство случаев CRC (70%) возникают в результате спорадических мутаций и в значительной степени зависят от внешних факторов риска, таких как образ жизни, отсутствие физической активности и нездоровое питание [4,17].

Утвердилось мнение, что CRC возникает в результате накопления генетических и эпигенетических изменений. Эти изменения способствуют образованию карциномы из нормальной слизистой путем изменения сигнальных путей, участвующих в регуляции ракового поведения [19,20]. Шесть ключевых генов-драйверов CRC, а именно гены аденоматозного полипоза (APC), KRAS, BRAF, PIK3CA, SMAD4 и TP53, были определены с помощью инструментов биоинформатики [21]. Рисунок 1 иллюстрирует колоректальную прогрессию и соответствующие мутации, которые в ней участвуют [10,22,23,24].

Рисунок 1. Предполагаемые механизмы спорадических событий для прогрессии CRC из нормальной толстой кишки.

В канцерогенезе CRC выявлены три основных молекулярных пути: хромосомная нестабильность (CIN), а также пути MSI и метилирования островков CpG (CIMP) [25]. В 80% случаев спорадического CRC опухоль возникает по пути CIN и прогрессирует через классическую последовательность аденома-карцинома. Этот путь запускается многоступенчатыми мутационными событиями с участием множества генов, таких как онкоген KRAS, и генов-супрессоров опухоли, таких как APC и TP53. APC мутирует в большинстве (80-90%) случаев наследственного и спорадического CRC. Мутации APC нарушают образование комплекса APC, что приводит к транслокации b-vatenin в ядро. Это впоследствии вызывает чрезмерную активацию передачи сигналов Wnt и приводит к пролиферации и активации клеток [12,26,27].

Формирование CRC также включает динамическое взаимодействие между злокачественными клетками, компонентами микроокружения (стромальными и эндотелиальными клетками сосудов) и иммунной системой [28,29,30]. Повышенная активация фибробластов происходит параллельно с прогрессированием CRC. Накопление ассоциированных раком фибробластов (CAFs), которые являются основным компонентом микроокружения опухоли, способствует плохому прогнозу и рецидивам CRC [31]. Эти стромальные клетки поддерживают рост и дифференцировку раковых клеток посредством секреции цитокинов, и наоборот [32]. Следует отметить, что различия в генетическом составе (т.е. полиморфизм) также объясняют различия в восприимчивости к инфекции и в риске развития CRC между разными популяциями или расами [33,34].

Профилирование рака может быть проведено путем анализа генетических изменений или изменений, способствующих его канцерогенезу. В таблице 1 приведены основные генетические мутации, обнаруженные в нескольких наиболее часто диагностируемых солидных опухолях [35-39]. Перечисленные гены служат возможными мишенями для разработки целевой терапии против различных типов рака. Отметим, что мутации p53 и KRAS встречаются не только при CRC, но и во многих других видах рака, таких как злокачественные опухоли молочной железы, легких и поджелудочной железы.

Таблица 1. Распространенные генетические мутации в солидных опухолях.

Хотя в Таблице 1 перечислены распространенные мутации, связанные с солидными опухолями, частота и мутационное профилирование раковых больных могут сильно отличаться в зависимости от их генетического состава и гетерогенности опухоли. Если взять в качестве примера TP53, то участки мутаций этого гена у разных онкологических больных различны. Таким образом, важно тщательно анализировать различные опухоли, чтобы проводить более персонализированную терапию на основе мутационных профилей пациентов.

Сеть атласа генома рака сообщила о наиболее часто мутировавших генах в пути CIN, которые включают APC, TP53, KRAS, PIK3CA, FBXW7, SMAD4, TCF7L2 и NRAS [40]. Один из этих генов, а именно TP53, является вторым по частоте мутирования при колоректальном раке, поражая приблизительно 60% пациентов с CRC. Ген TP53, расположенный на коротком плече хромосомы 17, кодирует важный опухолевый супрессорный белок p53. p53 действует как транскрипционный фактор, регулирующий клеточный цикл и апоптоз путем связывания со специфическими последовательностями различных генов, включая p21, Bax и Bcl-2, в ответ на клеточные стрессоры, такие как повреждение ДНК или гипоксия [41]. Активированный р53 через различные молекулы-мишени может (а) вызывать временный арест клеточного цикла для восстановления повреждений ДНК; (б) вызывать апоптоз; и (в) прекращать дальнейшее деление клеток [42]. Потеря транскрипционной активности р53 приводит к нерегулируемому росту клеток и развитию опухолей в различных органах, включая толстую кишку. В большинстве случаев мутации TP53 в раковых клетках CRC представляют собой мутации типа missense в ДНК-связывающем домене [41]. Эта мутация приводит к образованию мутантного р53 с пониженной способностью связываться со специфической последовательностью, которая регулирует транскрипционный путь р53. Примерно в 70% опухолей CRC, несущих миссенс-мутации, дикий тип TP53 теряется в результате потери гетерозиготности (LOH) из-за хромосомной нестабильности [25]. Предполагается, что миссенс-мутации р53 приводят к прогрессированию аденомы в аденокарциному, а дополнительная потеря дикого типа TP53 приводит к более прогрессивному развитию CRC [41].

Среди генов, представляющих интерес по данным Cancer Genome Atlas Network (2012) [40], анализ на мутацию гена KRAS является наиболее полезной оценкой, регулярно используемой в настоящее время для прогнозирования ответа на анти-EGFR терапию. KRAS (Kirsten ras sarcoma viral oncogene) - это гуанозинтрифосфат (GTP)-связывающий белок, расположенный ниже EGFR в KRAS-BRAF-MEK-ERK-пути, который является одним из наиболее важных митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK)-сигнальных путей. Путь ERK-MAPK играет важную роль в пролиферации и дифференцировке клеток. Мутации в KRAS приводят к EGFR-независимой активации MAPK-пути путем снижения активности GTPase, что приводит к увеличению пролиферации клеток, потенциально возникающей на ранней стадии колоректального канцерогенеза [43]. Также предполагается, что путь ERK-MAPK вовлечен в прогрессирование и онкогенное поведение CRC человека.

Различные исследования показали, что мутации в KRAS вовлечены примерно у 30-40% пациентов с CRC [44,45,46]. Доля мутаций KRAS различается в зависимости от региона и расы. Например, в Малайзии распространенность ниже (приблизительно 20%), как сообщалось ранее [47-49]. Более 90% активирующих мутаций произошло в кодоне 12 и кодоне 13 в экзоне 1, причем наиболее часто наблюдались замены одного основания глицина на аспартат (G12D) и глицина на валин (G12V) в кодоне 12 [45]. Также были зарегистрированы мутации в кодонах 61 и 146, хотя они составляют всего 1-4% мутаций KRAS и их клиническое значение остается неясным [50].

Ассоциации между мутационным статусом KRAS и клинико-патологическими особенностями CRC были изучены, но консенсуса относительно их взаимосвязи не достигнуто. Hayama et al. (2019) и Scott et al. (2020) [42,46], например, показали, что KRAS-мутированный CRC чаще наблюдается в правой половине толстой кишки, в то время как Zulhabri et al. (2012) [48] сообщили, что эти мутации чаще встречаются в левостороннем CRC. Другие исследования, включая совместное исследование RASCAL [51] и исследование Phipps et al. (2013) [52], не выявили связи между мутациями KRAS и местом расположения опухоли. Zulhabri et al. (2012) также изучали связь между различными этническими группами и мутационными профилями KRAS, но не обнаружили значительной ассоциации между переменными [48]. Экспрессия мутации p53 миссенс-типа или подавление TGF-β индуцирует подслизистую инвазию. Дополнительная мутация гена KRAS способствует более злокачественной трансформации (эпителиально-мезенхимальный переход и метастазирование) [53].

В последние годы было доказано, что молекулярная характеристика мутаций, связанных с раком, дает важную информацию о прогнозе заболевания и ответе на лечение, такое как химиотерапия. Две ранее не зарегистрированные прогностические ассоциации в CRC, а именно мутация TP53 и общее бремя мутаций, подтвержденные корреляции с гомологом KRAS и прото-онкогенами B-Raf (BRAF), были выявлены с помощью мультигенных панелей. Этот вывод позволил понять важность информации, полученной в результате скромных генетических и молекулярных тестов в клинической практике [54]. Это подтверждается более поздним исследованием, в котором сообщалось, что многочисленные переменные, такие как молекулярные маркеры (например, мутации KRAS), расположение опухоли с другими клинико-патологическими переменными и микросателлитный статус, могут использоваться в комбинации для определения прогноза и выступать в качестве прогностических факторов при CRC I-III стадии [55]. В другом исследовании Tortola et al. (2016) также сообщалось о корреляции между мутациями TP53 отдельно или в сочетании с мутациями KRAS с плохим исходом у пациентов с CRC, хотя они не рекомендовали рутинное использование этих мутаций в качестве прогностических маркеров в клиниках [6].

Мутации KRAS связаны с более агрессивным фенотипом опухоли и плохим прогнозом у пациентов с CRC по сравнению с пациентами с диким типом KRAS [56,57]. Мутации в кодоне 12 и 13 KRAS, BRAF и каталитической субъединицы альфа фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат-3-киназы (PIK3CA) также являются предиктором резистентности к анти-EGFR терапии. Таким образом, было предложено, что этих пациентов с мутациями KRAS или NRAS не следует лечить терапией, направленной на EGFR. Вместо этого в анти-EGFR терапию для пациентов с мутациями BRAF следует включить ингибитор BRAF, чтобы преодолеть резистентность к лечению [58,59].

Лечение CRC включает в себя (а) хирургию; (б) традиционную химиотерапию; (в) иммунотерапию; и (г) различные технологии генной терапии, такие как коррекция генов и направленная на вирусы ферментная лекарственная терапия [10]. Генотерапия представляет собой многообещающий подход, поскольку позволяет проводить более персонализированное лечение. Это обеспечит успех лечения в клинических условиях. Вкратце, генотерапией можно назвать доставку специфического генетического материала (генов, сегментов генов или олигонуклеотидов) для изменения кодировки генного продукта или изменения биологических свойств клеток-хозяев для лечения различных патологических состояний или заболеваний [60]. Терапия переноса генов осуществляется либо методами in vivo, либо ex vivo.

Вирусные и невирусные средства доставки используются для введения лекарств или интересующих генов в зависимости от желаемой специфичности генотерапии. Целевая генотерапия предпочтительнее рекомбинантного терапевтического использования пептидов, где последние обычно характеризуются низкой доступностью, недостаточной стабильностью, значительным токсическим эффектом и дороговизной [61].

Целенаправленная генотерапия представляет собой новый способ лечения заболевания, не имеющего окончательного излечения. За последние три десятилетия был достигнут значительный прогресс в генной терапии рака, в результате чего ряд препаратов был одобрен, а многие еще находятся на стадии клинических испытаний. В будущем геномное профилирование опухоли в сочетании с анализом гуморального и клеточного иммунитета хозяина позволит выбрать наиболее подходящего пациента и методы лечения для генной терапии [62].

Генотерапия служит способом лечения, который можно использовать в сочетании с существующими и традиционными методами лечения. Стратегии генотерапии обычно включают использование интервенционных генетических методов, направленных на а) усиление иммунологического ответа на опухоль и б) доставку цитотоксических или летальных агентов и/или генов в неопластические клетки, что осуществляется в ходе различных клинических испытаний [63]. Они осуществляются с помощью различных механизмов, таких как включение или замена дефектных генов, сбивание генов, деактивация неисправных генов или вставка новых генов, которые вводятся с помощью средств доставки или векторов [64]. На рисунке 2 представлены векторы и стратегии генотерапии рака [60,65-70]. Для лечения рака также было предложено несколько методов лечения, которые потенциально могут быть включены в генную терапию, в том числе [71]:

Figure 2. Gene therapy approaches and vectors for cancer treatment. Methods for gene therapy in cancer include RNA interference (RNAi), herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK), inducible caspase 9; CAR-T (iCasp9): chimeric antigen receptor T-cell therapy (CAR-T), herpes simplex virus 1 (HSV-1); zinc finger nucleases (ZFN), transcription activator -like effector nucleases (TALEN) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 (CRISPR-Cas9).

(a) Gene-directed enzyme prodrug therapy (GDEPT), which aims to reduce the toxicity effect after chemotherapy;

(b) Cancer drug-resistance gene transfer to elevate the chemotherapy and radiation effects onto the tumor cells without compromising the normal tissues; and

(c) Combination of diagnostic and therapeutic systems (theranostic).

As stated in the previous section, CRC progression is also heavily influenced by the tumor microenvironment. Besides targeting cancer cells alone, blocking the angiogenesis process is one the prime methods for CRC treatment. Targeted therapy using AAV to deliver anti-angiogenic genes, namely angiostatin and endostatin, has resulted in tumor shrinkage with little side effects [72].

По данным сайта ClinicalTrials.gov, в августе 2021 года было проведено 140 клинических испытаний, связанных с CRC ((дата обращения 30 августа 2021 года) https://www.clinicaltrials.gov). Эти данные свидетельствуют о большом интересе и усилиях со стороны медицинского сообщества по утверждению генной терапии в качестве ключевого метода лечения CRC. Различные стратегии были изучены в направленной генной терапии рака CRC с использованием различных векторов и подходов к доставке in vitro и in vivo. В таблице 2 приведены примеры вирусных и невирусных систем доставки, используемых для генотерапии рака CRC на доклинических и клинических стадиях [73-88]. Следует отметить, что в ходе этих исследований были получены обнадеживающие данные об эффективности генотерапии, а большинство заявленных стратегий лечения приводили к минимальным побочным эффектам или их отсутствию.

Таблица 2. Вирусные и невирусные способы доставки генов для генной терапии CRC.

Принцип воздействия на мутации-драйверы для лечения CRC давно интригует научное сообщество. Эти мутации, играющие важную роль в канцерогенезе, представляют собой специфические мишени опухоли и обычно экспрессируются большинством, если не всеми, неопластическими клетками [89]. Генотерапия, нацеленная на р53, была изучена для лечения различных солидных опухолей. Генотерапия на основе р53 в онкологии обычно направлена на введение дикого типа р53 или подавление экспрессии мутантного р53 в р53-дефектных раковых клетках [90,91]. Подавление функции мутантного р53 предлагается в качестве надежного подхода для блокирования злокачественного развития CRC [41,92].

Первый в истории продукт генотерапии для лечения плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC), а именно Gendicine (рекомбинантный аденовирус человека p53), был разработан компанией Shenzhen SiBiono GeneTech Co. Ltd. Gendicine вышел на коммерческий рынок в 2004 году после одобрения Китайским управлением по контролю за продуктами и лекарствами (CFDA) годом ранее. Гендицин действует через аденовирусы, несущие ген р53. Белок р53 дикого типа, экспрессируемый клетками, трансдуцированными Гендицином, действует как опухолевый супрессор, активируется при клеточном стрессе и опосредует остановку клеточного цикла и восстановление ДНК, или, в зависимости от состояния клеточного стресса, способствует запрограммированной гибели клеток (апоптоз, старение и/или аутофагия). Одним словом, восстанавливая активность р53 и тем самым ставя на "тормоз" процесс деления клеток, развитие рака впоследствии блокируется. Коммерческий успех Гендицина, очевидно, подтверждается данными о его безопасности, согласно которым он был использован более чем у 30 000 пациентов, в рамках не менее 30 опубликованных клинических исследований. В сочетании с традиционным лечением, а именно химиотерапией и радиотерапией, Gendicine продемонстрировал значительно лучшие показатели ответа по сравнению со стандартными методами лечения, при этом не было зарегистрировано никаких значительных побочных эффектов [69]. В Китае гендицин уже более десяти лет клинически используется для лечения злокачественных опухолей, отличных от HNSCC, в основном для пациентов с распространенными или нерезектабельными раковыми опухолями. Однако стандартные схемы лечения с использованием генотерапии р53 еще предстоит разработать для широкого применения в клинической практике [93]. Этот успешный опыт применения Гендицина закрепил идею целенаправленного лечения в онкологии и дал ценное представление о возможностях генотерапии для лечения злокачественных опухолей.

Помимо Gendicine, к целевым генотерапиям для лечения рака относятся Rexin-G® и VB-111, которые используются для лечения рака поджелудочной железы и глиобластомы соответственно. Rexin-G® - первый вектор генотерапии, направленный на опухоль, несущий цитоцидную конструкцию циклина G1, который был протестирован в клинических условиях [94,95]. VB-111 (ofranergene obadenovec), напротив, представляет собой нереплицирующийся аденовирус, несущий Fas-химерный трансген (Fas и человеческий рецептор фактора некроза опухоли 1), который вызывает направленный апоптоз ангиогенных кровеносных сосудов опухоли и способствует развитию опухолеспецифического иммунного ответа [96,97].

Лечебный эффект комбинации генотерапии с использованием гена р53 и стандартного лечения при лечении рака пищевода также был изучен Cui et al. (2015) [9]. В этом исследовании пациентов с раком пищевода средней и поздней стадии лечили комбинацией генотерапии с использованием рекомбинантного вектора аденовируса человека p53 (rAd-p53) и химиотерапии. После инъекции отмечалось уменьшение опухолей, и, кроме самоограничивающейся лихорадки, не было зарегистрировано никаких побочных эффектов.

Для воздействия на злокачественные клетки был разработан целый ряд онкологических и/или опухолеспецифических промоторных систем. Это потенциально подчеркивает возможность включения промотора для генов-супрессоров опухоли, доставляемых в раковые клетки с помощью подходящего генетического вектора [98]. Более недавним событием в генной терапии CRC является создание наночастиц (NPs) из наночастиц мезопористого кремнезема (MSNs) в качестве новых генетических транспортных средств, которые, как сообщается, эффективно связываются и нацеливаются на клетки CRC [99,100].

По сравнению с методами генотерапии, связанными с р53, подход, направленный на KRAS, не полностью разработан в онкологической практике. Однако в нескольких исследованиях сообщалось о потенциале направленной генотерапии против KRAS. При раке поджелудочной железы, где была обнаружена высокая распространенность мутации KRAS (95% случаев), избыточная экспрессия проапоптотического белка, которым является p53-регулируемый модулятор апоптоза (PUMA) под Ras-чувствительным промотором, оказалась эффективной для избирательного уничтожения Ras-трансформированных клеток in vitro. Этот метод был предложен в качестве полезной, эффективной и безопасной стратегии уничтожения Ras-мутированных опухолевых клеток [101,102].