Система CRISPR-Cas9 является мощным инструментом для редактирования генов. В этой системе единичные направляющие РНК (sgRNA) направляют нуклеазы Cas9 к целевой последовательности мишени, которые затем вносят двунитевые разрывы (DSBs). В клетках млекопитающих DSBs преимущественно восстанавливаются путем негомологичного соединения концов (NHEJ), вызывая микроинсерции или делеции (indels). Если шаблон в виде ДНК-донора предоставляется в меньшей степени, то для точной замены мутировавшей последовательности ДНК используется путь гомологически-направленной репарации (HDR) (1-4). В сочетании с адено-ассоциированным вирусом (AAV) серотипа 6 с геномом одноцепочечной ДНК для доставки донорского шаблона, предварительно собранные рибонуклеопротеиновые (RNP) комплексы нуклеазы Cas9 и синтетической sgRNA привели к эффективной HDR в человеческих гемопоэтических стволовых и клетках предшественниках (HSPCs) и Т-клетках (5-7). Подход CRISPR-Cas9/AAV6 был использован для исправления мутаций, вызывающих несколько моногенных заболеваний крови в полученных из HSPC пациентов (8-10). Хотя система CRISPR-Cas9 успешно справилась с исправлением мутаций, ее потенциальные эффекты вне мишени все еще вызывают серьезную озабоченность (11-15). Специфичность мишени CRISPR-Cas9 была повышена за счет использования усеченных sgRNAs (15, 16), удлиненных sgRNAs с двумя дополнительными нуклеотидами G на 5 конце (17) и sgRNAs с высокой специфичностью (18). Кроме того, было показано, что вне-целевое действие нуклеазы Cas9 снижается при использовании мутантных SpCas9 с высокой точностью воспроизведения (high-fidelity) (19-21). Другая стратегия минимизации вне-целевой активности заключается в использовании никаз Cas9 - мутированной версии Cas9, в которой нуклеазный домен RuvC (эндонуклеазный белок E. coli) или HNH (гистидин-аспарагиновый-гистидиновый мотив) был инактивирован путем введения мутации D10A или H840A, соответственно. Никаза Cas9 приводит к меньшему количеству indels, чем нуклеаза Cas9, поскольку индуцированные одноцепочечные разрывы (SSBs) эффективно восстанавливаются путем эксцизионной репарации оснований (22). Ранее Ran и др. и Mali и др. (23, 24) сообщили, что в сочетании с парой PAM (protospacer-adjacent motif)-out sgRNAs на расстоянии от 38 до 68 пар оснований (bp), никлаза Cas9D10A (далее Cas9n) создает смещенные двойные зарубки (nicks), которые индуцируют сайт-специфические DSBs, называемые далее double-nick подход. Подход с двойными nicks приводит к эффективным событиям HDR и NHEJ при одновременном снижении эффектов вне мишени в 50-1000 раз (23, 24). Ограничением этой стратегии является то, что DSB все еще индуцируются в целевом локусе, что приводит к частым indels и нонсенс-мутациям в целевом гене (25).

Идеальный подход к коррекции генов для терапевтического применения сохраняет эффективность HDR и, что еще более важно, минимизирует неблагоприятные эффекты, такие как непреднамеренные мутации внутри и вне мишени. Для достижения этой цели и противодействия внесению DSBs мы разработали подход, обозначенный ниже как "spacer-nick", который сочетает Cas9n с парой PAM-out sgRNAs на удаленном (более 200 п.н.) расстоянии от спейсера. Таким образом, на первом этапе Cas9n направляется с помощью spacer-nick sgRNAs к двум целевым последовательностям на противоположных нитях и прорезает обе нити ДНК на оптимальном расстоянии для сохранения эффективного HDR при минимизации событий NHEJ. Затем мы объединили эту систему с донорскими шаблонами на основе AAV6 для создания методов генной коррекции для исправления мутантных "горячих точек", возникающих в генах HBB, ELANE, IL7R и PRF1 в первичных человеческих HSPC и Т-клетках. С помощью независимых подходов к оценке внецелевого воздействия мы подтвердили, что spacer-nick приводит к значительно меньшему количеству непреднамеренных мутаций, как внутри, так и вне мишени, чем классический CRISPR-Cas9.

Для количественной оценки эффективности HDR и NHEJ в человеческих HSPCs и Т-клетках мы разработали репортерную систему таргетинга, вставив кодирующие последовательности саморасщепляющегося пептида, соединенного с флуоресцентным маркером mCherry, в последний экзон локусов B2M и CD48 человека. Затем мы сконструировали sgRNA, нацеленные на эти гены рядом со STOP-кодоном, названные в дальнейшем sgB2M-1 или sgCD48-2, соответственно (рис. 1, A и B). Для создания "double-nick" sgRNAs мы сконструировали PAM-out sgRNA с расстоянием 47 п.н. до sgB2M-1 и 59 п.н. до sgCD48-2. Чтобы оценить, мы сконструировали несколько PAM-out sgRNA, целевая последовательность которых находилась на расстоянии от 123 до 459 п.н. от последовательности первой sgRNA (рис. 1, А и Б). На основании анализа ICE (Inference of CRISPR Edits) и анализа T7EI все sgRNAs приводили к эффективному редактированию целевого сайта до ~80% в HSPC, которые были electroporated соответствующими sgRNAs/Cas9 RNPs (таблица S1). Затем активированные HSPC и Т-клетки были заражены RNPs, содержащими Cas9 и одну или две sgRNA, или Cas9n с парами sgRNA, а затем клетки были инфицированы соответствующими донорскими шаблонами в AAV6 (рис. S1A). На основании экспрессии репортера (mCherry), определяемой методом проточной цитометрии через 3 дня после нацеливания, spacer-nick приводил к эффективности HDR (~40%), которая была аналогична наблюдаемой в контроле на основе Cas9- или двойного nick . Однако в обоих типах клеток и локусах увеличение расстояния между двумя sgRNAs коррелировало со снижением эффективности HDR (рис. 1, C-F). Для генетической количественной оценки событий HDR и NHEJ мы амплифицировали и секвенировали целевые последовательности из геномной ДНК целевых HSPC. Этот анализ показал, что подходы, основанные на двойных никс и Cas9, привели к эффективному NHEJ на ~40% (B2M) и ~30% (CD48), тогда как подход, основанный на spacer-nick с длинным более 200 п.н.) спейсерным расстоянием, привел почти исключительно к событиям HDR (рис. 1, G и H, и рис. S1B). В соответствии с репортерной системой, сходные показатели HDR наблюдались в клетках, обработанных spacer-nick-, Cas9- и double-nick, а увеличение расстояния между спейсерами spacer-nick sgRNA приводило к значительному снижению HDR в HSPCs и Т-клетках (рис. 1, C-H, и рис. S1, C и D). Таким образом, расстояние между спейсерами в 200-350 п.н. в системе спейсер-nick минимизирует частоту NHEJ-зависимых indels на мишени и обеспечивает эффективное HDR в человеческих HSPC и Т-клетках. Аналогичные наблюдения были сделаны в индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клетках человека и клеточных линиях с использованием подходов in trans и tandem paired nicking, сочетающих Cas9n с sgRNAs, которые вызывают ДНК-nicks как в целевой последовательности, так и в двухцепочечной ДНК донорской плазмиды. Метод парных nicks in trans-положении индуцирует nicks ДНК в последовательности-мишени и один или два nicks в плазмиде-доноре ДНК. При тандемном парном nicking два nicks вводятся в одну из нитей целевого гена и донорской плазмиды ДНК, соответственно (26-28). Чтобы сравнить эти методы со спейсер-никированием в человеческих HSPC, мы ввели ники в двухцепочечную область самокомплементарных (sc) векторов AAV и использовали их в качестве донорных шаблонов для вставки T2A-mCherry в локус B2M.

Неожиданно, как транс-, так и тандемный метод парного никелирования привели к очень низким показателям HDR (<1%) в человеческих HSPCs в отличие от ~30-кратного увеличения показателей HDR, достигнутых с помощью spacer-nick (рис. S2B и S3). Эти данные позволяют предположить, что метод spacer-nick уникален тем, что приводит к эффективному HDR и низкому количеству событий on-target NHEJ в человеческих HSPC.

FIG. 1. Cas9n and distant sgRNAs lead to HDR and minimal NHEJ in human HSPCs and T cells.

(A and B) Targeting strategy to insert T2A-mCherry into human B2M and CD48 loci. Donor templates with the indicated homology arms (HAs) flanking T2A-mCherry fragments were used. Common sgB2M-1 and sgCD48-2 are indicated as red arrows; PAM-out sgB2M-47 and sgCD48-59 are indicated as dark blue arrows; and spacer-nick sgB2M-123, sgB2M-220, sgB2M-346, sgB2M-459, sgCD48-155, sgCD48-200, sgCD48-229, sgCD48-264, sgCD48-346, and sgCD48-427 are indicated as light blue arrows. Primers used to amplify the wild-type (WT)/NHEJ and HDR sequences are indicated as horizontal blue arrows. (C and D) Fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of the percentages of mCherry+ HSPCs and T cells targeting the B2M and CD48 loci 3 days after editing. (E and F) Summary of frequencies of mCherry+ HSPCs and T cells after targeting the B2M and CD48 loci. Data are shown as means ± SD based on three independent experiments. (G and H) Pie charts of the frequencies of WT (gray), NHEJ (blue), and HDR (orange) sequences in the targeted HSPCs treated with the indicated RNPs targeting the B2M and CD48 loci and AAV donor vectors. Data represent the average of three independent experiments.

Коррекция генов на основе CRISPR-Cas9 имеет большой потенциал для генотерапии с целью лечения моногенных заболеваний. Несмотря на интенсивное развитие и совершенствование, безопасность системы остается главной клинической проблемой. С помощью spacer-nick мы создали точный и безопасный подход к коррекции генов, основанный на использовании Cas9n и пары sgRNAs на расстоянии от 200 до 350 п.н.. В сочетании с донорскими шаблонами AAV6, эта система привела к эффективному восстановлению генов с минимальным нежелательным редактированием в и вне мишени в человеческих HSPCs и Т-клетках.

В соответствии с предыдущими сообщениями, классическая система CRISPR-Cas9 в наших экспериментах вызывала частые вне-целевые мутации и нежелательные генетические изменения (2, 11-15, 17). Наши результаты, основанные на Cas9n, согласуются с предыдущими исследованиями, в которых никелирование Cas9 с парой коротких (от 38 до 68 п.н.) PAM-out сгРНК значительно уменьшало вне-целевые эффекты (23, 24). Хотя этот последний подход с двойным никелированием индуцировал эффективный HDR и предотвращал вне-целевое редактирование, два расположенных рядом SSB все еще могут быть обращены в DSB, которые преимущественно восстанавливаются с помощью пути NHEJ, что приводит к нежелательным мутациям и потенциально дисфункциональным генным продуктам (25). Такие нежелательные on-target indels могут приводить к активирующим и/или доминантным мутациям в онкогенах, таких как NOTCH1, или к усеченным доминантно-негативным генным продуктам и тем самым вызывать опухолевый генез или аномальное кроветворение.

Чтобы избежать возникновения в мишени indels, безопасный подход к коррекции генов для терапевтического применения должен минимизировать непреднамеренные DSB в мишени, сохраняя при этом скорость HDR. Хотя подходы с транс- и тандемным парным никированием достигли этого в iPS-клетках и клеточных линиях человека (26-28), их эффективность в HSPC человека, судя по нашим результатам, низка, что может быть связано с особым механизмом репарации indels в ДНК, активным в этих клетках. Используя пару удаленных sgRNA в spacer-nick (от 200 до 350 п.н.), мы значительно уменьшили количество DSBs в мишени и indels, которые мы наблюдали при двойном никировании. Из-за их удаленности эти SSB, по-видимому, преимущественно восстанавливаются путем эксцизионной репарации оснований, что приводит к уменьшению количества DSB-опосредованных indels в мишени (22). В присутствии матриц (донорских шаблонов) в AAV6 удаленные SSB могут восстанавливаться альтернативным путем HDR (43). Точный механизм пути репарации ДНК, активного в спейсер-нике, еще предстоит выяснить.

Поиск эффективной пары PAM-out sgRNAs с расстоянием между спейсерами от 200 до 350 п.н. имеет решающее значение для достижения эффективного HDR при минимизации событий NHEJ при использовании подхода spacer-nick. Чтобы найти лучшие пары, мы создали пулы PAM-out sgRNAs , фланкирующих два потенциальных целевых сайта, разделенных 200-350 п.н., и выбрали лучшие пары sgRNAs с высокой и одинаковой эффективностью редактирования (более 80%). В комбинации с парой PAM-out sgRNAs Cas9n создает два удаленные друг от друга nicks с расстоянием между ними от 200 до 350 п.н. на противоположных нитях ДНК мишени . Последовательность между двумя никами может служить в качестве мини-HA (так называемая мини-гомологичная последовательность), которая потенциально может привести к частичной гомологичной рекомбинации в присутствии шаблонов ДНК-донора. Чтобы уменьшить длину этой мини-гомологичной последовательности и избежать частичной гомологичной рекомбинации, мы создали донорные шаблоны ДНК, содержащие 5' и 3' HA длиной не менее 800 п.н. за пределами каждого сайта никирования. Кроме того, мы модифицировали кодирующие последовательности внутри мини-гомологичных последовательностей путем введения молчащих мутаций (HBB и ELANE) или частичного удаления этих последовательностей (IL7R и PRF1) в шаблонах ДНК-доноров.

В качестве доказательства принципа мы использовали spacer-nick для разработки универсальных систем коррекции генов, позволяющих исправлять горячие точки мутаций, возникающих в генах HBB, ELANE, IL7R и PRF1. В этих локусах мы достигли от 20 до 50% эффективности коррекции генов в человеческих HSPC и Т-клетках. Мы предлагаем стандартизированный рабочий процесс для оценки эффективности генной коррекции и вне-целевой активности после редактирования генов в клинических условиях. Эти данные показывают, что система spacer-nick является безопасным и эффективным методом редактирования генов, который может быть использован в терапии бета-талассемии, тяжелой врожденной нейтропении, тяжелого комбинированного иммунодефицита, семейного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза и других моногенных заболеваний крови.