WMZ: Z191701361450 WMR: R209318204033 |
Moving toward genome-editing therapies for cardiovascular diseases | |
---|---|
The rapid invention of genome-editing technologies over the past decade, which has already been transformative for biomedical research, has raised the tantalizing prospect of an entirely new therapeutic modality. Whereas the treatment of chronic cardiovascular diseases has heretofore entailed the use of chronic therapies that typically must be taken repeatedly and frequently for the remainder of the lifetime, genome editing will enable the development of "one-and-done" therapies with durable effects. This Review summarizes the variety of available genome-editing approaches, including nuclease editing, base editing, epigenome editing, and prime editing; illustrates how these various approaches could be implemented as novel therapies for cardiovascular diseases; and outlines a path from technology development to preclinical studies to clinical trials. Although this Review focuses on PCSK9 as an instructive example of the various genome-editing approaches under active investigation, the lessons learned will be broadly applicable to the treatment of a variety of diseases. |
Редактирование генома способно произвести революцию в лечении хронических сердечно-сосудистых заболеваний, таких как ишемическая болезнь сердца. В то время как все существующие фармакологические методы лечения ишемической болезни сердца требуют ежедневного приема таблеток или инъекций каждые несколько недель или месяцев - в течение всей жизни, чтобы получить полный терапевтический эффект - редактирование генома приводит к постоянным изменениям на уровне ДНК и открывает возможность "одноразовой" терапии, которая обеспечит длительную защиту от болезни. Такая терапия имеет двойное преимущество: максимальный терапевтический эффект (отсутствие пропущенных доз) и устранение недостаточной чувствительности к лекарствам (чрезвычайно распространенное явление) как препятствия для здоровья. За последние несколько лет было получено множество многообещающих данных, указывающих на будущее, в котором многие пациенты получат пользу от терапии, основанной на редактировании генома. Помимо описания разнообразных подходов к редактированию генома, которые сегодня доступны для использования, данный обзор посвящен гену, в отношении которого было проведено наибольшее количество доказательных исследований - PCSK9, регулятору уровня холестерина в крови и фактору риска ишемической болезни сердца, - с целью проиллюстрировать читателю различные пути развития геномной терапии сердечно-сосудистых заболеваний.
Genome-editing approaches Любое обсуждение методов лечения с помощью редактирования генома должно начинаться с описания разнообразия инструментов редактирования, доступных в настоящее время для использования. Первое поколение инструментов, известных как инженерные нуклеазы, обладает двумя типами функциональности: способностью искать и специфически связываться с целевой геномной последовательностью и способностью генерировать двунитевой разрыв ДНК в этой последовательности. Новые инструменты появились благодаря разделению этих двух типов функций и объединению способности к поиску и связыванию с любым из множества видов генной модификации: химическая модификация оснований ДНК (редактирование оснований), модификация экспрессии генов (редактирование эпигенома) и обратная транскрипция для введения новых последовательностей ДНК, скопированных с шаблонов РНК (редактирование праймеров) (1).
Нуклеазное редактирование. Существует четыре основных типа инженерных нуклеаз: нуклеазы с цинковымb пальчиками (ZFNs), нуклеазы с эффектором, подобным активатору транскрипции (TALENs), мегануклеазы и кластерные регулярно перемежающиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR)/CRISPR-ассоциированные (Cas) системы. Каждая из них обладает способностью искать определенные геномные последовательности и вносить двунитевые разрывы ДНК, хотя механизмы, с помощью которых они выполняют эти задачи, совершенно разные. В данном обзоре основное внимание будет уделено системам CRISPR/Cas, поскольку они являются наиболее широко используемым классом нуклеаз и имеют наилучшие перспективы для внедрения в сердечно-сосудистую терапию в ближайшем будущем.
Системы CRISPR/Cas бактериального происхождения, которые широко используются для редактирования генома - CRISPR/Cas9 и CRISPR/Cas12 - состоят из двух компонентов: белка Cas и направляющей РНК (2). Направляющая РНК обеспечивает способность поиска и связывания, закодированную в самой последовательности РНК, в то время как белок Cas обладает способностью вызывать двухцепочечный разрыв, используя один или два расщепляющих домена для разрезания двух нитей ДНК. Streptococcus pyogenes Cas9, или SpCas9, был первой системой CRISPR/Cas, которая была адаптирована для редактирования генома в клетках млекопитающих (рис. 1 и ссылки 3-7). Его направляющая РНК длиной около 100 нуклеотидов кодирует специфичность нацеливания на ДНК в первых 20 нуклеотидах, называемых спейсером. SpCas9 связывается с остальными 80 нуклеотидами, и комплекс белок-РНК сканирует все двухцепочечные молекулы ДНК, с которыми он вступает в контакт. По мере разворачивания и сканирования ДНК SpCas9 делает паузу на мотиве NGG (N - любой нуклеотид), после чего позиционирует спейсер направляющей РНК напротив нити ДНК, не содержащей мотив NGG, называемой целевой нитью (мишенью). Если последовательность целевой нити и последовательность спейсера идеально (или, в некоторых случаях, почти идеально) комплементарны, между ДНК и РНК происходит обширное сопряжение оснований по Уотсону-Крику, которое активирует SpCas9, приводя к двухцепочечному разрыву вблизи третьей пары оснований выше по течению от мотива NGG. Последовательность ДНК на нецелевой нити, соответствующая спейсерной последовательности РНК, называется протоспейсером, который представляет собой 20-нуклеотидную последовательность непосредственно перед мотивом NGG. Мотив NGG называется protospacer-adjacent motif (PAM).
Figure 1 CRISPR/Cas9 nuclease editing. The protospacer-adjacent motif (PAM) in the DNA and spacer sequence in the guide RNA direct CRISPR/Cas9 to a specific genomic site. There, it generates a double-strand break (indicated by red arrows pointing to DNA strands) that is repaired by one of two repair mechanisms: non-homologous end joining (NHEJ) or homology-directed repair (HDR). In NHEJ, free DNA ends are ligated together, which can restore the original DNA sequence or introduce insertions or deletions. This strategy is suitable for disrupting genes or non-coding elements in the genome. HDR enables more precise changes but requires the addition of a template, which reduces its efficiency. Adapted with permission from the Journal of the American College of Cardiology (58). SpCas9 стал самым популярным инструментом редактирования генома благодаря легкости перенаправления SpCas9 на любую желаемую геномную последовательность путем простого изменения в 20 основаниях спейсера направляющей РНК, а также более высокой эффективности редактирования по сравнению с другими инструментами редактирования генома (8). Тем не менее, белки Cas9, адаптированные из других видов бактерий, также используются для редактирования генома, особенно Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9), который имеет двойное преимущество: он меньше SpCas9 и имеет другую последовательность PAM, NNGRRT (R - либо G, либо A), что дает ему особый диапазон нацеливания (9). Белковая инженерия SpCas9 и SaCas9 позволила получить варианты, распознающие новые последовательности PAM (10, 11). По меньшей мере три других белка Cas, все из семейства Cas12, также доказали свою эффективность в качестве редакторов генома: Cas12a/Cpf1, Cas12b/C2c1 и Cas12e/CasX (12-14).
Конечный результат нуклеазного редактирования зависит от попытки каждой клетки восстановить вызванный нуклеазой двунитевой разрыв. Стандартным механизмом восстановления является негомологичное соединение концов (NHEJ), при котором свободные концы ДНК соединяются вместе (рис. 1 и ссылки 15, 16). Хотя исходная последовательность ДНК часто восстанавливается, NHEJ - это процесс, подверженный ошибкам, в результате которого может произойти вставка или делеция (indel-мутация) - чаще всего одной или нескольких пар оснований, но в некоторых случаях десятков, сотен или даже тысяч пар оснований. Поскольку indel мутации происходят полу-случайным образом, разные клетки будут приобретать разные indels . Несмотря на непредсказуемость мутагенеза, если целью является простое разрушение гена или не-кодирующего элемента - а именно такая стратегия подходит для различных сердечно-сосудистых заболеваний, таких как атеросклеротическая болезнь сосудов и транстиретиновый амилоидоз - NHEJ хорошо подходит для этой задачи, достигая в некоторых случаях до 100% эффективности редактирования. Если целью является точное изменение с помощью нуклеазного редактирования, например, исправление мутации, вызывающей заболевание, то вместо этого необходимо прибегнуть к другому клеточному механизму репарации - гомологически-направленной репарации (HDR) (рис. 1 и ссылки 15, 17). HDR имеет ряд существенных ограничений: он требует дополнительной матрицы для восстановления ДНК наряду с белком Cas и направляющей РНК, что усложняет доставку в клетки; его эффективность обычно намного ниже, чем у NHEJ, во многих случаях менее нескольких процентов; и он менее активен в не-пролиферирующих клетках по сравнению с пролиферирующими, что делает его менее практичным для использования в ключевых органах, вовлеченных в сердечно-сосудистые заболевания, таких как сердце и печень. К счастью, новые подходы к редактированию генома, такие как редактирование оснований и праймеров, способны обеспечить точность HDR, преодолевая при этом его недостатки, как описано ниже.
Редактирование нуклеазой в контексте терапевтического применения может иметь нежелательные последствия двух видов: непреднамеренное редактирование мишени, например, очень большие indel мутации и даже хромосомные аномалии; и редактирование вне мишени, обусловленное тем, что нуклеаза может связываться с участками, которые не полностью соответствуют спейсеру направляющей РНК, что приводит к indel мутациям в местах, отличных от целевого сайта. Теоретически, если в гене-супрессоре опухоли или онкогене произойдет нецелевая правка, это может привести к повышенному долгосрочному риску развития рака. Изменения либо белка Cas, либо направляющей РНК могут уменьшить внецелевое редактирование, хотя часто ценой уменьшения целевого редактирования (18-20).
Редактирование оснований. Редактирование оснований (а также редактирование эпигенома и прайминга) использует тот факт, что CRISPR/Cas9 может быть направлен на нужный участок генома, даже если домены расщепления Cas9 изменены таким образом, что он может разрезать только одну нить ДНК (nickase Cas9, или nCas9) или ни одну из нитей ДНК (dead Cas9, или dCas9). Присоединение дополнительных доменов к белку nCas9 или dCas9 может добавить различные типы функциональности к системе CRISPR/Cas9.
Существует два основных класса редакторов оснований: редакторы оснований цитозина, которые могут вызывать замену С на нити ДНК другим основанием (обычно Т, но в некоторых случаях G) (21, 22) и редакторы оснований аденина, которые могут вызывать замену А на G (23) (рис. 2). Если nCas9 сливается с любым из множества встречающихся в природе доменов цитидиндеаминазы (например, из белка APOBEC1 или белка AID), деаминаза может потенциально действовать на любой С в пределах окна редактирования на нецелевой нити ДНК. (Разматывание нити ДНК с помощью Cas9 и гибридизация целевой нити (мишени) с направляющей РНК создают структуру, известную как R-петля, которая превращает часть не-гибридизованной, нецелевой нити в одноцепочечное вздутие ДНК, доступное для действия домена деаминазы - таким образом определяется окно редактирования, степень которого зависит от конкретного используемого ортолога Cas9). Деаминирование превращает C в U (урацил), который обычно восстанавливается обратно в C под действием урацил-ДНК гликозилазы; слияние еще одного домена с nCas9, ингибитором урацил-ДНК гликозилазы, предотвращает это восстановление. nCas9 оставляет зазубрины (nick) только на целевой нити; устранение зазубрин подразумевает удаление нуклеотидов вокруг места зазубрины (nick) с последующей заменой нуклеотидов через комплементарность к нецелевой нити. Для любого U, присутствующего в нецелевой нити, A переходит в комплементарное положение в результате nick клетка заменяет нестандартный U (обычно встречающуюся только в РНК) на стандартный Т. Таким образом, пара оснований C-G заменяется на пару оснований T-A.
Figure 2 Base editing and epigenome editing. (A) Base-editing strategies offer the advantages of precision editing without the inefficiency that complicates the use of HDR. With base editing, only one strand is cut (or nicked), nucleotides around the site of the nick are replaced, and the nick is repaired. The specific nucleotides that undergo replacement are determined by the selection of the base editor. (B) In epigenome editing, catalytically dead Cas9 (dCas9) can be directed to a gene promoter or transcriptional enhancer to modify gene expression. This strategy can be used to either enhance or repress target gene expression. It does not make a change to the DNA sequence. Adapted with permission from the Journal of the American College of Cardiology (58). Поскольку в природе не существует аденозиндезаминазы, действующей на одноцепочечную ДНК, эволюция белков была использована в лаборатории для создания новой ДНК-дезаминазы (23). Слияние этого эволюционировавшего домена деаминазы с nCas9 позволяет редактировать адениновые основания, что работает аналогично редактированию цитозиновых оснований. В окне редактирования на нецелевой нити A преобразуется в I (инозин), а на целевой нити происходит репарация nick, C переходит в целевую нить напротив I, и в конечном итоге нестандартное I заменяется на стандартное G. Таким образом, пара оснований A-T редактируется в пару оснований G-C.
Редакторы оснований цитозина и аденина ограничены в типах правок, которые они могут производить: однонуклеотидные изменения, в основном переходные мутации. Но если желаемая правка (например, введение нонсенс-мутации для нарушения работы гена или исправление мутации болезни) совместима с редактированием оснований, она может быть достигнута с очень высокой эффективностью даже в неделящихся клетках, в некоторых случаях приближающейся к 100%. Вне-целевое редактирование может иметь место, хотя оно обычно ограничивается однонуклеотидными изменениями, возникающими в результате активности деаминазы.
Редактирование эпигенома. Если dCas9 направлен на последовательность в промоторе гена или в энхансере транскрипции, он может стерически вмешиваться в факторы, которые обычно взаимодействуют с этой последовательностью (24). Это явление называется CRISPR-интерференцией - по аналогии с РНК-интерференцией, опосредованной короткими шпилечными РНК, хотя по механизму оно совершенно иное - и может быть использовано для подавления экспрессии определенных генов. CRISPR-интерференция более эффективна, если dCas9 сливается с доменом, таким как KRAB (Krüppel-associated box), который активно репрессирует экспрессию генов, изменяя локальную структуру хроматина (рис. 2 и ссылка 25). Противоположное явление, называемое активацией CRISPR, достигается либо путем присоединения к dCas9 доменов, усиливающих экспрессию генов (например, транскрипционного активатора VP16), либо путем расширения последовательности направляющей РНК на ее 3 ' конце с помощью РНК-аптамеров, которые привлекают активационные домены (рис. 2 и ссылка 26). При CRISPR-интерференции или CRISPR-активации последовательность ДНК не изменяется, и эффект экспрессии генов сохраняется только до тех пор, пока присутствует редактирующий белок, т.е. эффект является преходящим.
Отдельный тип редактирования эпигенома включает изменение состояния метилирования последовательностей ДНК, особенно цитозиновых оснований в динуклеотидных последовательностях CpG. Метилирование вблизи сайта начала транскрипции обычно связано с подавлением генов, тогда как отсутствие метилирования связано с активацией генов. Присоединение доменов метилтрансферазы или деметилазы к dCas9 может снижать или повышать экспрессию генов, соответственно, а изменения метилирования могут сохраняться длительное время и быть обратимыми, если на тот же геномный участок позднее нанести редактор эпигенома с противоположным эффектом (27).
Другие типы редактирования. Праймерное редактирование было недавно разработано с целью преодоления ограничений в типах изменений, которые могут быть получены путем редактирования оснований, а также в условиях ограничений HDR (28). nCas9 сливается с обратной транскриптазой, которая может создавать нить ДНК, комплементарную одноцепочечному субстрату РНК. Субстрат обеспечивается удлинением направляющей РНК на ее 3' конце с последовательностью РНК, которая комплементарна нецелевой нити ДНК, но также включает желаемую мутацию. Praimer extended guide RNA (pegRNA). nCas9 перерезает нецелевую нить, и 3' конец pegRNA гибридизируется с нецелевой нитью с одной стороны от перерезания (направление 5'), образуя РНК-ДНК дуплекс, который служит матрицей для обратной транскриптазы, которая, в свою очередь, синтезирует последовательность ДНК с желаемой мутацией в средней части pegRNA (рис. 3). Эта новая нить ДНК может заменить часть нецелевой нити, что приводит к устойчивому включению мутации в мишень. Хотя эффективность такого редактирования ниже, чем нуклеазного NHEJ-редактирования или редактирования оснований (хотя и выше, чем HDR-редактирования), редактирование праймеров может точно вводить широкий спектр мутаций: однонуклеотидные изменения любого типа, а также indels мутации различных размеров длиной до десятков пар оснований и потенциально даже больше. Степень внецелевого редактирования вне мишени с помощью прайм-редакторов еще предстоит определить.
Figure 3 Prime editing. Prime editing overcomes limitations inherent to base editing and HDR by fusing nickase Cas9 to a reverse transcriptase (RT) that can build a DNA sequence with a desired mutation into an extended guide RNA (referred to as pegRNA). Though its efficiency tends to be lower than NHEJ or base editing, prime editing enables single-nucleotide changes of any kind as well as indel mutations of various sizes. Adapted with permission from the Journal of the American College of Cardiology (58). Редактирование РНК - это ортогональный подход к редактированию, использующий семейство белков Cas13 (29). Как и CRISPR/Cas9 и CRISPR/Cas12, системы CRISPR/Cas13 имеют белковые и РНК-компоненты, но они действуют на целевые РНК, а не на целевые ДНК. РНК-редакторы могут использоваться либо для деградации целевых РНК (29), либо для внесения поправок оснований (правок A-to-I или C-to-U) в целевые РНК мишени (30, 31). Поскольку молекулы РНК недолговечны, сохранение эффекта РНК зависит от длительности присутствия редактора РНК, чтобы он продолжал действовать на все вновь транскрибируемые молекулы РНК.
Therapeutic genome editing: the example of PCSK9 Для лечения сердечно-сосудистых заболеваний практически все терапевтические методы редактирования генома, которые сейчас активно изучаются, будут применяться внутри тела пациентов, в таких органах, как сердце и печень - in vivo, а не в клетках, взятых из организма, где редактирование происходит вне организма, а клетки затем пересаживается обратно в организм - ex vivo. Многие из доказательных исследований терапевтического редактирования генома in vivo были посвящены генам, тесно связанным с хорошо известным, модифицируемым причинным фактором риска атеросклеротических сердечно-сосудистых заболеваний, а именно low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C). Особенно выделяется один ген: ген proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9). Поскольку этот ген преимущественно экспрессируется в гепатоцитах печени, а его белковый продукт выделяется в кровь, где он оказывает свое основное действие - повышает концентрацию LDL-C в крови, он стал популярным геном-мишенью для тестирования новых технологий редактирования генома. Печень является органом, на который можно воздействовать с помощью различных методов доставки, а уровень белка PCSK9 в крови и уровень LDL-C в крови представляют собой легко измеряемые фармакодинамические маркеры редактирования гена PCSK9. Таким образом, концентрация обсуждения в данном обзоре на опубликованных исследованиях по редактированию PCSK9 позволяет получить полный обзор прогресса в области терапевтического редактирования генома и проиллюстрировать ключевые решения, которые необходимо принять при разработке терапии с помощью редактирования генома, поскольку ни один другой ген (как вовлеченный в сердечно-сосудистые заболевания, так и в другие болезни) в настоящее время не имеет такого количества данных.
PCSK9, конечно же, является геном, представляющим большой интерес для разработчиков сердечно-сосудистой терапии по своим достоинствам в качестве мишени для лекарств. PCSK9 был идентифицирован как причина семейной гиперхолестеринемии (генетически повышенного уровня LDL-C в крови) у пациентов, у которых была обнаружена единичная копия гена с мутацией избыточности функции (32), тогда как у людей с единичной копией нонсенс-мутации PCSK9 (с потерей функции) уровень LDL-C в крови значительно снижается, а риск развития ишемической (коронарной) болезни сердца снижается на 88% (33) без каких-либо серьезных негативных последствий для здоровья (34). Более того, сообщалось о нескольких людях с полным нокаутом PCSK9 благодаря потери функции двх мутаций (35, 36). Эти наблюдения сделали PCSK9 привлекательной лекарственной мишенью для лечения и профилактики ишемической болезни сердца. Три препарата, нацеленных на PCSK9, уже одобрены для применения у пациентов - алирокумаб (alirocumab) (моноклональные антитела, связывающие белок PCSK9 в крови), эволокумаб (evolocumab) (моноклональные антитела, связывающие белок PCSK9 в крови) и инклизиран (inclisiran) (малая интерферирующая РНК, снижающая уровень мРНК PCSK9 в гепатоцитах), а также ряд других препаратов, находящихся в стадии разработки.
В первой демонстрации высокоэффективного редактирования генома млекопитающих in vivo аденовирусный вектор, включающий ядерную ДНК, кодирующую SpCas9, и направляющую РНК, нацеленную на последовательность в экзоне 1 гена Pcsk9 мыши, был использован для уничтожения Pcsk9 в печени мыши путем введения мутаций с потерей функции через NHEJ (37). Аденовирусные векторы обычно не используются для лечения пациентов из-за риска тяжелых и потенциально опасных для жизни иммунных реакций на векторы; адено-ассоциированные вирусные (AAV) векторы предпочтительнее, поскольку они лучше переносятся иммунологически и поэтому более подходят для клинического использования. Одним из недостатков векторов AAV является их ограниченная грузовая емкость (менее 5 кб экзогенной последовательности), в которую не помещается большинство инструментов редактирования генома. Например, генетически кодируемый SpCas9 составляет около 4,2 кб, а кассета экспрессии направляющей РНК - около 500 пар оснований, что оставляет минимальное пространство для последовательности промотора для экспрессии SpCas9 и последовательности полиаденилирования. Благодаря гораздо большей грузоподъемности аденовирусные векторы были выбраны для первоначального исследования редактирования генома in vivo с помощью CRISPR/Cas9. Исследователи вводили вектор SpCas9 или контрольный вектор мышам дикого типа. Через несколько дней наблюдалось более 50% редактирования всей печени в целевом сайте PCSK9; наиболее распространенными изменениями были удаления или вставки 1 или 2 пар оснований, а изменения размером в десятки пар оснований встречались гораздо реже. Редактирование PCSK9 сопровождалось снижением уровня белка PCSK9 в крови примерно на 90% и уровня холестерина в крови на 35%-40%, почти так же, как снижение холестерина на 36%-52%, наблюдаемое у зародышевых Pcsk9-нокаутных мышей (38). Это первоначальное исследование не выявило никаких признаков редактирования в нескольких сайтах-кандидатах на внецелевое редактирование.
В последующем исследовании другая группа исследователей воспроизвела те же результаты редактирования у мышей, обработанных аналогичным аденовирусным вектором с SpCas9 и той же направляющей РНК Pcsk9 (39). Исследователи провели тщательную оценку вне-целевого редактирования в печени с помощью двухэтапной стратегии. Сначала они провели скрининг кандидатов на вне-целевые сайты с помощью биохимического метода CIRCLE-Seq, в котором циркулирующие фрагменты геномной ДНК мыши смешивались с белком SpCas9 и направляющей РНК Pcsk9 in vitro, после чего проводилось секвенирование следующего поколения для выявления линеаризованных фрагментов ДНК. Эта процедура позволила получить список из 182 сайтов-кандидатов. На втором этапе исследователи провели ПЦР-амплификацию сайтов-кандидатов и глубокое секвенирование следующего поколения ампликонов из образцов геномной ДНК печени мышей, обработанных SpCas9. Они не наблюдали редактирования ни в одном из сайтов, что говорит о том, что можно подобрать реагенты для редактирования генома с достаточной специфичностью редактирования, чтобы не было обнаружено мутагенеза вне мишени in vivo.
Несмотря на обнадеживающие результаты этих исследований, они не имеют прямого отношения к тому, что может произойти при редактировании PCSK9 у пациентов-людей, в свете трех основных различий между мышами и людьми. Во-первых, существуют существенные различия между последовательностями генов Pcsk9 мыши и PCSK9 человека, так что выявление эффективной направляющей РНК, подходящей для обоих видов, является непосильной задачей. Во-вторых, имеются существенные различия между геномами мыши и человека, поэтому профилирование вне-целевого редактирования генома мыши не может предсказать внецелевое редактирование генома человека. В-третьих, существуют существенные физиологические различия между гепатоцитами мыши и человека, поэтому результаты редактирования генов могут значительно отличаться между этими двумя типами клеток.
Для более адекватной оценки эффективности и безопасности потенциальной терапии, редактирующей PCSK9 человека, чем это можно сделать на мышах дикого типа, было проведено исследование на химерных мышах с гуманизированной печенью - модельной системе, в которой эндогенные гепатоциты мыши заменяются пересаженными гепатоцитами человека (40). Гуманизированную печень мышей обрабатывали аденовирусным вектором, кодирующим SpCas9 и направляющую РНК, нацеленную на последовательность в экзоне 1 гена PCSK9 человека. В гуманизированной печени наблюдалось около 50% NHEJ-опосредованного редактирования аллелей PCSK9 человека, при этом не наблюдалось редактирования в нескольких сайтах-кандидатах, не являющихся мишенями, а уровень белка PCSK9 человека в крови снизился примерно на 50%.
Следующая серия исследований была посвящена переходу от аденовирусных векторов к подходам доставки, более удобным для клинического применения. В первом исследовании с использованием AAV для достижения высокоэффективного редактирования генома млекопитающих in vivo, SaCas9 вместе с одной из двух направляющих РНК, нацеленных на последовательности в гене Pcsk9 мыши, был закодирован в одном векторе AAV (9). Любой из векторов AAV при введении мышам дикого типа давал 40-50% редактирования Pcsk9, опосредованного NHEJ в целой печени, со снижением уровня белка PCSK9 в крови более чем на 90% и уровня холестерина в крови примерно на 40%, что очень похоже на эффекты, наблюдаемые в вышеупомянутых исследованиях с аденовирусной доставкой SpCas9.
За успешным использованием AAV последовало применение невирусных методов доставки CRISPR/Cas9 в печень in vivo. В первом исследовании с доставкой CRISPR/Cas9 в печень исключительно невирусным методом, липидными наночастицами ( LNPs), содержащие либо мРНК SpCas9, либо синтезированную направляющую РНК, нацеленную на последовательность в Pcsk9, последовательно вводились мышам дикого типа, что привело к снижению уровня белка PCSK9 в печени на 40-50% (41). В последующем исследовании LNPs содержащие либо мРНК SpCas9, либо смесь двух синтезированных направляющих РНК, нацеленных на различные последовательности Pcsk9, с химическими модификациями, направленными на повышение стабильности РНК in vivo, вводились мышам дикого типа (42). Обработка LNP привела к более чем 80% редактированию гена во всей печени, причем очень высокий уровень редактирования был обусловлен чрезвычайно эффективной делецией, опосредованной NHEJ, между участками, на которые нацелены две направляющие РНК (рис. 1). В результате редактирования в крови не обнаруживался белок PCSK9, а уровень холестерина в крови снижался на 35%-40%. В легких и селезенке редактирование не происходило, что говорит о том, что либо LNP нацелены именно на печень, либо локус Pcsk9 доступен для действия SpCas9 только в клетках печени.
Следующая серия исследований использовала развитие новых типов редактирования генома, начиная с редактирования оснований, эпигеномного редактирования и заканчивая таргетингом РНК. Цитозиновые редакторы оснований могут напрямую вводить нонсенс-мутации в гены через изменения C-to-T или G-to-A (последнее происходит в результате редактирования C-to-T на анти-смысловой нити) в определенных кодонах. Аденовирусный вектор, кодирующий цитозиновый редактор оснований BE3 вместе с направляющей РНК, нацеленной на триптофан-159 кодон Pcsk9 (TGG, для которого изменения G-to-A одного или обоих G приводит к образованию стоп-кодона), вводили мышам дикого типа (43). В результате лечения около 30% аллелей Pcsk9 в печени были отредактированы, в основном в желаемые стоп-кодоны, но с некоторыми побочными правками, приводящими к миссенс-мутациям, а также к мутациям indels в количестве 1-2%. Соответствующее снижение уровня белка PCSK9 в крови составило около 60%, а уровня холестерина - до ~ 30%.
Та же стратегия редактирования оснований в Pcsk9 была использована в одной из первых демонстраций редактирования генома плода у мышей. По аналогии с фетальной хирургией, при которой пациентов с опасными для жизни анатомическими дефектами лечат еще в утробе матери, редактирование генома плода будет предназначено для пациентов с тяжелыми генетическими нарушениями, вызывающими повреждения на пренатальной стадии и приводящими к высокой заболеваемости и смертности после рождения. Аденовирусный вектор, экспрессирующий редактор оснований BE3, нацеленный на Pcsk9, был введен в печень эмбриональных мышей путем инъекции в вителлиновую вену, предшественницу воротной вены (44). Эта пренатальная процедура привела к постоянному снижению уровня PCSK9 и холестерина в крови после рождения. (Обратите внимание, что гиперхолестеринемия - это не то состояние, которое при любых обстоятельствах требует пренатального лечения, а исследование на мышах было проведено только в качестве доказательства концепции редактирования генома плода. В том же исследовании также сообщалось о редактировании гена Hpd, что привело к успешному лечению наследственной тирозинемии типа 1 у эмбрионов мышей).
В демонстрации редактирования эпигенома каталитически мертвый SaCas9 был слит с репрессорным доменом KRAB; редактор и направляющая РНК, нацеленная на последовательность в промоторе Pcsk9, были закодированы в двух отдельных векторах AAV (45). Векторы AAV были совместно введены мышам дикого типа, что привело к снижению экспрессии гена Pcsk9 в печени примерно на 50% и снижению уровня белка PCSK9 в крови примерно на 80%, наряду с соответствующим снижением уровня LDL-C в крови. Примечательно, что терапевтический эффект ослабевал в течение нескольких месяцев, что позволяет предположить, что по мере ослабления экспрессии редактора эпигенома ослабевала и репрессия Pcsk9. В другом исследовании было продемонстрировано использование редактора РНК CasRx (Cas13d), доставленного вектором AAV, для подавления экспрессии Pcsk9 (46). Как и в случае с редактированием эпигенома, терапевтический эффект, как ожидается, будет длиться только до тех пор, пока сохраняется экспрессия редактора. И редактирование эпигенома, и целенаправленное воздействие РНК, вероятно, потребуют повторных введений препаратов для поддержания хронического терапевтического эффекта, в отличие от эффекта "один раз и все", который возможен при редактировании нуклеазой или редактировании оснований.
Последние исследования были посвящены ключевому шагу в переводе терапевтического редактирования генома у пациентов: демонстрации эффективности и безопасности на не-человеко-образных приматах. В первом исследовании для нацеливания на ген PCSK9 использовались мегануклеазы, а не редактор CRISPR (47, 48). Исследователи использовали вектор AAV, кодирующий мегануклеазу, специфичную для последовательности в экзоне 7 PCSK9 и экспрессируемую сильным промотором, специфичным для печени. При внутривенном введении макакам-резусам в различных дозах самая высокая доза вектора AAV привела к редактированию PCSK9 во всей печени на 46%, что привело к снижению уровня белка PCSK9 в крови на 85% и уровня холестерина LDL-C на 56%. (Более низкие дозы AAV привели к значительному снижению уровня редактирования). Снижение уровня сохранялось в течение как минимум 3 лет (48).
Несмотря на успех исследования мегануклеазы на не-человекообразных приматах, следует отметить несколько аспектов исследования, которые имеют отношение к клиническому использванию. Во-первых, имело место непреднамеренное целевое редактирование. Хотя целью было разрушение гена PCSK9 посредством NHEJ, что привело бы к небольшим indels мутациям, на самом деле наиболее частым событием редактирования была интеграция последовательностей вектора AAV в геном в месте двунитевого разрыва в гене PCSK9, с неясными последствиями для безопасности. Во-вторых, обработка мегануклеазой привела к значительному мутагенезу вне мишени в многочисленных геномных сайтах как в печени обезьян in vivo, так и в гепатоцитах человека in vitro. В-третьих, наблюдался значительный иммунный ответ Т-клеток как против вектора AAV, так и против мегануклеазы, что привело к умеренному повышению уровня трансаминаз в крови у всех обезьян через несколько недель после лечения, что соответствует иммуноопосредованной гибели гепатоцитов. Эти подъемы спонтанно разрешились в течение нескольких недель или месяцев без каких-либо очевидных долгосрочных последствий для здоровья или ослабления редактирования PCSK9 или снижения уровня PCSK9 и LDL-C в крови. Несмотря на эти проблемы, данное исследование показало осуществимость редактирования генома у приматов по принципу "раз и готово", причем терапевтический эффект сохраняется в течение нескольких лет и, вероятно, на протяжении всей жизни леченных животных.
В двух недавних исследованиях на не-человекообразных приматах две группы исследователей использовали редактирование адениновых оснований для нокаута PCSK9 у макак cynomolgus (49, 50). Для доставки редактора в печень использовались LNPs содержащие мРНК редактора адениновых оснований и синтетическую направляющую РНК, нацеленную на донор сплайсинга в конце экзона 1 PCSK9. В то время как одно исследование продемонстрировало относительно скромный эффект - 26% редактирования PCSK9 в печени, 32% снижения уровня PCSK9 в крови и 14% снижения уровня LDL-C в крови через 1 месяц после лечения (49) - другое исследование продемонстрировало более значительные фармакодинамические эффекты, более актуальные для клинического применения - 66% редактирования PCSK9 в печени, около 90% снижения уровня PCSK9 в крови и около 60% снижения уровня LDL-C в крови, сохраняющиеся более 8 месяцев в текущем исследовании (50). Эти исследования отличаются от вышеупомянутого исследования мегануклеазы на приматах по нескольким параметрам. Поскольку в подходе LNP не использовались компоненты ДНК, не было риска интеграции последовательности вектора в геном, а использование редактирования оснований привело к определенному изменению пары оснований в PCSK9, в отличие от полу-случайных indels и вставок последовательности вектора AAV, индуцированных мегануклеазой. При редактировании оснований не было обнаружено заметного вне-целевого редактирования ни в одном из большого числа сайтов-кандидатов в гепатоцитах человека, и низкоуровневое вне-целевое редактирование только в одном сайте-кандидате в печени обезьяны, причем вне-целевое редактирование ограничивалось изменениями одной пары оснований (а не indels). Наконец, обработка LNP привела к немедленному, преходящему повышению уровня трансаминаз в крови, которое спонтанно разрешилось через 1-2 недели, без последующего трансаминита, что свидетельствует об устойчивом иммунном ответе - хотя, что примечательно, повторное введение LNP некоторым животным в одном из исследований вызвало развитие антител против редактора оснований.
Prospects for translation in the near future На основании всех вышеупомянутых исследований, редактирование PCSK9, по-видимому, готово к клиническим испытаниям на пациентах с гиперхолестеринемией и ишемической болезнью сердца. Терапевтический потенциал редактирования генома при сердечно-сосудистых и других заболеваниях, конечно, выходит за рамки PCSK9 (Таблица 1). Доклинические исследования установили перспективы лечения гомозиготной семейной гиперхолестеринемии путем воздействия на ген ANGPTL3 в печени (51). Хотя это не исключительно сердечно-сосудистые заболевания, ускоренная смертность у пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна или синдромом Хатчинсона-Гилфорда-Прогерии обусловлена сердечно-сосудистыми осложнениями, возникающими в сердце или сосудистой системе, и доклинические исследования продемонстрировали снижение сердечно-сосудистых фенотипических проявлений с помощью редактирования нуклеазой Cas9 и редактирования оснований (52-55).
Table 1 Genes with reported evidence of efficacy of genome editing in large-animal preclinical studies or in clinical trials Наиболее многообещающим является то, что уже проводится клиническое испытание I фазы, в котором редактирование генома используется для лечения транстиретинового амилоидоза с полинейропатией путем воздействия на ген TTR (кодирующий транстиретин, белок для переноса тироксина и ретинола) в печени (56). Промежуточные результаты применения у шести пациентов единичных доз LNPs содержащих мРНК Cas9 и синтетическую направляющую РНК, нацеленную на TTR, продемонстрировали успешное снижение уровня транстиретина в крови на 96% через 1 месяц после лечения (57). Хотя объем редактирования TTR и длительность терапевтического эффекта еще предстоит установить, а данное клиническое исследование направлено на лечение полинейропатии, можно предположить, что наблюдаемая высокая степень снижения уровня транстиретина принесет пользу пациентам, страдающим кардиомиопатией, вызванной транстиретиновым амилоидозом.
Вполне вероятно, что в ближайшем будущем начнутся клинические испытания терапии с редактированием генома для лечения других сердечно-сосудистых заболеваний. Примечательно, что почти вся работа, которая легла в основу этих клинических испытаний, была проделана всего лишь за последнее десятилетие, и мы, несомненно, можем ожидать, что в следующем десятилетии темпы развития подходов к редактированию генома будут столь же необычайно высокими, что в конечном итоге принесет пользу пациентам во всем мире.
|