Эпилепсией страдает 1% населения (50 миллионов человек во всем мире), и 30% пациентов обнаруживают лекарственную устойчивость, при этом вариантов лечения не так много [1]. Новые противосудорожные препараты не оказали значительного влияния на устойчивые к лекарствам эпилепсии; таким образом, новые методы лечения являются неотложной неудовлетворенной клинической потребностью [2]. Генотерапия и редактирование генов обещают стать рациональным методом лечения эпилепсии. Последние разработки в области редактирования генов дают новую надежду пациентам, и клинические испытания с использованием CRISPR для лечения заболеваний уже начались или находятся в стадии подготовки [3, 4].

Эпилепсия - сложное нейрологическое расстройство, которое характеризуется высокой наследуемостью, причем генетический вклад оценивается в 70-80% [5, 6]. В генетическую структуру эпилепсии вносит вклад большое количество индивидуально редких моногенных подтипов, в основном обусловленных мутациями de novo. Предполагается, что более распространенные формы эпилепсии вызываются сложным взаимодействием индивидуально редких и более распространенных вариантов в многочисленных генах предрасположенности, но это остается спекулятивным [5]. За последние два десятилетия геномная революция привела к идентификации почти 1000 генов, связанных с эпилепсией и имеющих менделевское наследование (OMIM). На мутации, происходящие в ионных каналах, приходится ~25% случаев моногенной эпилепсии [7]. Большой процент случаев также вызван мутациями в генах, связанных с синаптической передачей, развитием коры головного мозга и метаболической функцией [8].

Важно отметить, что была зарегистрирована зависимость заболеваемости эпилепсией от возраста, при этом наибольшая вероятность молекулярного диагноза отмечается в возрасте до 5 лет [8]. В большинстве случаев диагностируются редкие, высоко деструктивные варианты, сосредоточенные в небольшом количестве повторяющихся генов (например, PRRT2, SCN1A, KCNQ2, CDKL5, SCN2A, STXBP1, SLC2A1 и PCDH19), причем на 10 наиболее представленных генов приходится ~ 80% случаев моногенной эпилепсии [8, 9]. Мутации в этих генах часто приводят к развитию эпилептической энцефалопатии (DEE), которая характеризуется частыми припадками, тяжелыми сопутствующими нарушениями нервного развития и лекарственной устойчивостью в более чем 50% случаев [10]. В совокупности DEE являются наиболее распространенными редкими моногенными эпилепсиями (1:2000 новорожденных) [5], которые вызывают наибольшую долю резистентной к лекарствам от эпилепсии и имеют худшие исходы, и поэтому очень выиграют от применения целенаправленной генотерапии.

Насколько осуществим подход целенаправленного редактирования генов для DEEs? DEEs характеризуются высокой степенью фенотипической, меж- и внутри-генной гетерогенности, что может сделать сложным подход к действительно персонализированной медицине. Широкий спектр мутаций de novo в одном и том же гене может вызывать DEE, что делает мутационно-специфический подход к прецизионной медицине сложным и финансово неподъемным. Кроме того, следует учитывать, что взаимосвязь генотип-фенотип является сложной: различные фенотипы могут возникать в результате различных мутаций в одном и том же гене, примером чего являются мутации в SCN1A, где фенотипический спектр может варьироваться от генерализованной эпилепсии с фебрильными судорогами плюс (GEFS +) до синдрома Драве (Dravet) [11]. Такая фенотипическая плейотропия, в которую вносят вклад генетический фон и гены-модификаторы заболевания, вероятно, повлияет на терапевтические результаты после манипуляций с одним геном у разных пациентов.

Несмотря на гетерогенность мутаций и фенотипов, связанных с отдельными генами, существуют генетические инструменты, которые потенциально могут быть использованы для устранения мутаций, приводящих либо к потере функции (LOF), либо к усилению функции (GOF), либо к доминантно-негативному способу действия [12].

С момента своего недавнего открытия как части адаптивной иммунной системы у бактерий/археи, система CRISPR/Cas была быстро адаптирована для геномной инженерии в клетках млекопитающих [3]. Редактирование генов осуществляется с помощью РНК-направляемой, CRISPR-ассоциированной (Cas) ДНК-эндонуклеазы, которая точно генерирует двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) в локусе мишени ДНК [13]. Способность к программируемости белка Cas путем создания короткой (20 нуклеотидов) последовательности направляющей РНК (sgRNA) открыла возможность целенаправленно воздействовать на полный набор генов в геноме человека с разрешением в одну пару оснований, так что редактирование генома CRISPR/Cas в настоящее время считается золотым стандартом точной медицины.

Эндонуклеаза Cas9 естественного происхождения из системы CRISPR типа II наиболее часто используется для редактирования генома, и было разработано множество модифицированных вариантов Cas9 с различными возможностями редактирования, специфичностью, диапазонами нацеливания и размерами для облегчения вирусной доставки (обзор сделан в Anzalone et al. [13]). Тип и место желаемого редактирования определяют выбранный инструмент. Обычные желаемые правки для лечения генетических заболеваний включают исправление точечных мутаций (редактирование оснований/prime редактирование); удаление пар оснований (эндонуклеаза Cas9), вставку пар оснований (гомолог-независимая целевая интеграция, HITI) или комбинацию вышеперечисленного [13].

Тип геномных изменений, которые происходят после индукции разрывов ДНК, в значительной степени зависит от эндогенных клеточных путей репарации ДНК, которые имеют две ветви: гомологически-зависимая репарация (HDR) и негомологичное соединение концов (NHEJ) [14]. HDR использует ДНК матрицу для точного восстановления DSBs, в то время как NHEJ - это подверженный ошибкам путь восстановления без шаблона, при котором концы ДНК быстро соединятся, часто со стохастической вставкой или делецией (indels) пар оснований в месте разрыва. NHEJ является наиболее активной репарацией в пост-митотических клетках млекопитающих, таких как нейроны [14, 15]. Поэтому ниже мы ограничиваем наше обсуждение агентами редактирования и результатами, которые полагаются на NHEJ.

CRISPR/Cas9 чаще всего используется для эффективного и избирательного разрушения экзонов, кодирующих белок, путем образования indel после NHEJ, что может привести к сдвигу рамки считывания, что приводит к преждевременной остановке транскрипции из-за возникновения стоп-кодонов [14]. Нарушение работы генов в качестве терапевтической стратегии еще не было использовано для лечения эпилепсии, предположительно потому, что большинство генов эпилепсии находятся под жестким регуляторным контролем, и их нокаут в подавляющем большинстве случаев будет пагубным. Однако если технология аллель-специфического целенаправленного воздействия будет усовершенствована [16], то NHEJ можно будет использовать для уничтожения варианта гена, который действует доминантно или доминантно-негативно, в условиях, когда гаплонедостаточность генного продукта приводит к менее тяжелому фенотипу [17]. Возможностью для генетической эпилепсии и пока еще не проверенной стратегией может быть использование CRISPR для разрушения сайта сплайсинга недавно открытого в poison экзоне (20 N) в SCN1A, чтобы постоянно повышать экспрессию SCN1A при синдроме Драве [18, 19]. Принципиальное доказательство такого подхода было продемонстрировано с помощью технологии Targeted Augmentation of Nuclear Gene Output (TANGO), которая использует анти-смысловой олигонуклеотид, направленный на poison экзон Scn1a, чтобы уменьшить малопродуктивное событие альтернативного сплайсинга [20]. Технология TANGO смогла повысить уровень функциональных транскриптов Scn1a и белка WT Nav1.1 за счет снижения уровня непродуктивной мРНК и уже находится в фазе I/II клинических испытаний [20].

Однако при наличии матрицы из двухцепочечной ДНК NHEJ может быть использовано для вставки последовательностей в процессе, называемом гомологически независимой направленной интеграцией (HITI), или терминальным микрогомологическим соединением концов (MMEJ), когда микрогомология существует между концами матрицы и геномной мишени [21]. HITI может использоваться для повторной вставки удаленных последовательностей [22] или для вставки полных кодирующих последовательностей, блокирующих экспрессию мутировавших генов [23]. Генетические эпилепсии, вызванные делециями, например, в NRXN1 [24] и в отдельных случаях PCDH19 [25], потенциально можно лечить с помощью этих подходов. Такой подход также может быть использован для обхода экспрессии доминантного мутантного белка GOF [23].

В последние годы инструментарий CRISPR расширился за счет появления редакторов оснований (обзор сделан в статье Rees и Liu [26]). Редакторы оснований образуются путем слияния Cas9-никазы, которая представляет собой вариант Cas9 с мутировавшим нуклеазным доменом, вносящим одноцепочечные разрывы, а не DSBs, с помощью деаминазы оснований. Редакторы оснований способны точно катализировать мутации перехода пары оснований без необходимости HDR, что делает их пригодными для коррекции точечных мутаций в нейронах [27]. В настоящее время существует два класса редакторов оснований: редактор оснований цитозина (CBE), который преобразует C.G в T.A, и редактор оснований аденина (ABE), который преобразует A.T в G.C [27, 28]. Описанные в настоящее время редакторы оснований могут ревертировать все возможные переходные мутации, которые, по современным оценкам, составляют 25% всех патогенных точечных мутаций человека [26, 29]. Важно отметить, что уже выявлено более 14 282 патогенных миссенс- и нонсенс-вариантов, связанных с генетической эпилепсией [30].

В настоящее время нет сообщений об использовании редактирования оснований в нейронах центральной нервной системы (ЦНС) [26]. Однако его применение для лечения генетической эпилепсии должно быть тщательно рассмотрено. Рецидивирующая точечная мутация в гене эпилепсии была бы оптимальным условием для применения редактирования оснований. Ярким примером является удивительно пенетрантный вариант прогрессирующей миоклонической эпилепсии KCNC1 (c.959 G > A) [31, 32]. Рецидивирующие мутации также были выявлены в SCN1A [33, 34] и SCN8A [35], хотя их частота невелика. Доминантно-негативные мутации, такие как мутация GABRG2 Q390X [36, 37], в принципе, могут быть устранены с помощью редактирования оснований, поскольку другие подходы, такие как добавление генов, не подходят из-за доминантно-негативного действия мутантного белка.

Недавно было разработано Prime редактирование как еще один метод точного определения точечных мутаций и специфических последовательностей в генах [38]. Хотя о его использовании еще не сообщалось для нейронов in vivo, этот подход способен переписывать, вставлять и удалять последовательности ДНК без индукции двухцепочечных разрывов или необходимости в донорской матрице, что увеличивает возможность устранения большинства мутаций, приводящих к генетической эпилепсии. Действительно, было подсчитано, что с ее помощью можно исправить 89% известных генетических вариантов [29]. Примечательно, что эти технологии имеют преимущество в снижении генотоксичности, клеточных стрессовых реакций и вероятности крупных хромосомных перестроек по сравнению с подходами на основе нуклеазы Cas9, поскольку они не вносят DSBs.

Эндонуклеазы CRISPR/Cas постоянно изменяют генетический код, предлагая потенциал необратимого лечения заболеваний, но также увеличивая вероятность генотоксичности [39]. Поэтому специфическая и обратимая модуляция экспрессии генов открывает возможность применения системы CRISPR/Cas. Модуляция генов достигается с помощью сконструированного белка dCas, не обладающего функцией эндонуклеазы, связанного с эффекторными белками, обладающими регуляторными функциями [21, 38, 40, 41]. Связывание dCas с регуляторным геномным локусом приводит к привлечению эндогенных клеточных факторов, которые способствуют или подавляют экспрессию генов, стратегии, называемые активацией CRISPR (CRISPRa) и интерференцией CRISPR (CRISPRi), соответственно.

Гаплонедостаточность, обусловленная мутациями LOF, является молекулярной причиной в подавляющем большинстве случаев для десяти самых распространенных генов детской эпилепсии. Пациенты гетерозиготны по таким мутациям [9], что позволяет проводить терапевтическое вмешательство путем повышения регуляции активности аллеля WT с помощью CRISPRa. Терапевтическая польза такого подхода была недавно продемонстрирована для синдрома Драве, где CRISPRa использовалась для повышения экспрессии аллеля WT Scn1a на ~ 50% и улучшения эпилептического фенотипического проявления [42]. Эта "универсальная" стратегия на основе промотора выгодна в контексте моногенной эпилепсии, поскольку значительная часть мутаций возникает de novo.

Другая стратегия манипулирования экспрессией генов заключается в изменении эпигенома [43]. Были разработаны редакторы эпигенома, которые изменяют структуру хроматина посредством метилирования и ацетилирования (обзор в [43]). Разработка редакторов эпигенома расширила диапазон целенаправленного воздействия CRISPR, поскольку эти инструменты не ограничиваются целенаправленным воздействием вблизи сайта начала транскрипции (TSS) [43, 44] и могут активировать элементы энхансера, которые более устойчивы к элементам CRISPRa (dCas9-VP64) [45]. Учитывая, что последовательности, кодирующие белки, составляют всего 1-2% генома, а не менее 8% генома состоит из известных регуляторных областей [46], эти новые редакторы обладают огромным терапевтическим потенциалом. Эпигеномные редакторы уже применялись для лечения генетической эпилепсии. Например, недавно было продемонстрировано устранение Х-сцепленных мутаций в CDKL₅ с помощью dCas9, слитого с TET1, фактором деметилирования. Деметилирование промотора CDKL5 с помощью целенаправленного воздействия Cas9-TET1 способно реактивировать замалчиваемый Х-аллель WT in vitro [47].

GOF-мутации также часто встречаются при генетической эпилепсии, например, в SCN2A, SCN8A и KCNT1 [48, 49], а также в механистической мишени рапамицина (mTOR) [50]. Ионный канал "GOF" чаще всего используется для обозначения мутаций, которые приводят к увеличению общего тока ионов; однако он также может охватывать множество потенциальных изменений в кинетике канала, изменяя активацию, инактивацию или деактивацию канала [51], что может изменить свойства нейронов таким образом, что не поддается лечению путем снижения общей экспрессии канала.

В некоторых случаях можно рассмотреть как общий подход с использованием CRISPRi или dCas9-метилтрансферазы, направленной на промотор этих генов для снижения экспрессии генов. В поддержку этой стратегии недавние данные показали, что целенаправленное воздействие анти-смыслового олигонуклеотида на мРНК Scn8a способно устранить эпилептический фенотип в генетических моделях мышей с GOF [52]. Более того, фокальная кортикальная дисплазия, являющаяся самым распространенным показанием для хирургического лечения эпилепсии у детей [53], в подавляющем большинстве случаев вызвана соматическими мутациями LOF, которые приводят к общей GOF-активности пути mTOR [54]. Лекарственные препараты [55] и анти-смысловая олигонуклеотидная терапия [56], направленные на ключевые компоненты пути mTOR, продемонстрировали эффективность в ослаблении проявлений припадков в животных моделях и у пациентов. Подход CRISPRi для лечения этих патологий может быть потенциально применим.

Гаплонедостаточность затрагивает гены, которые проявляют чувствительность к дозировке, когда наличие меньшего чем 50% количества белкового продукта вызывает заболевание. Дозовая чувствительность также представляет собой модель, в которой наличие большего, чем 50% количества генного продукта также может быть вредным [57]. Это хорошо видно на примере расстройств нейрального развития с эпилепсией [12], где на долю вариантов числа копий (CNVs) приходится более 14% случаев [58]. Было показано, что дозировка MECP2, транскрипционного репрессора, имеет фундаментальное значение, поскольку как LOF, так и дупликация гена приводят к различным нейрологическим заболеваниям [59, 60]. Чувствительность к дозировке также наблюдается для натриевых каналов SCN1A, SCN2A и SCN8A, которые демонстрируют различные фенотипы заболеваний, когда мутации являются LOF или GOF [48].

Традиционные стратегии генотерапии гаплонедостаточности включают замену генов, при которой ген WT доставляется в клетку с помощью вирусного вектора. Однако чувствительность многих генов эпилепсии к дозировке, а именно ионных каналов, предполагает, что эти расстройства не выиграют от терапии замещения генов в смысле избыточной экспрессии. Подходы CRISPR, модулирующие экспрессию эндогенных генов, имеют множество преимуществ перед стратегиями замены генов, поскольку они позволяют получать множество изоформ сплайсинга и контролировать экспрессию генов в зависимости от типа клеток [41]. Кроме того, CRISPR позволяет обойти трудности, связанные с доставкой кодирующих последовательностей, которые слишком велики для упаковки в адено-ассоциированный вектор (AAV) - средство генной терапии, выбранное для применения в ЦНС, - таких как SCN1A.

Восстановление активности транскрипции гаплонедостаточных генов до физиологического уровня может оказаться сложной задачей. Однако расширяющийся инструментарий CRISPR может позволить тонкую настройку экспрессии генов. Различные перестановки платформы CRISPRa, возникающие в результате слияния dCas9 с различными эффекторными доменами, повышают экспрессию генов на разные порядки [41]. Например, dCas9-VP64 является одним из самых "слабых" транскрипционных активаторов, для достижения значительной активации часто требуется несколько целенаправленно воздействующих sgRNA [61]. Активаторы второго поколения dCas9, такие как VP64-p65-Rta (VPR) и медиатор синергической активации (SAM), оказываются намного сильнее, часто требуя только одной целенаправленно воздействующей сгРНК из-за усиленного рекрутирования множественных слитых активирующих элементов [62, 63]. SunTag, который использует белковый каркас для усиления рекрутирования эффекторов в локус, связываемый dCas9, является самым мощным активатором на сегодняшний день и даже способен реактивировать области гетерохроматина [64]. Рациональный дизайн целенаправленного воздействия CRISPRa также, вероятно, будет иметь важное значение для настройки экспрессии генов. Например, в стратегии CRISPRa для лечения синдрома Драве потребовалась всего одна сгРНК для достижения примерно двукратного увеличения уровня мРНК с помощью dCas-VP64 [42], тогда как другой подход с использованием того же активатора потребовал 4 сгRNA для достижения терапевтического воздействия [65]. Целью первого исследования был участок, расположенный непосредственно перед местом начала транскрипции (TSS) в проксимальном промоторе гена Scn1a, в то время как в последнем исследовании - дистальный промотор.

Альтернативной стратегией поддержания физиологической дозировки генов является использование редакторов эпигенома, по которым существует обширная литература по их применению in vivo [41]. В отличие от CRISPRa/i агентов, редакторы эпигенома не отменяют функцию промотора и могут поддерживать эндогенные механизмы регуляции экспрессии генов, например, зависимость от активности [44].

Большинство нейрональных генов находятся под жестким регуляторным контролем, обеспечиваемым рядом элементов с различным аддитивным или негативным вкладом в общий результат деятельности промотора. Понимание регуляторного ландшафта генов эпилепсии окажется важным в будущем при разработке таких стратегий генной терапии, а также может облегчить целенаправленное воздействие на конкретный тип клеток, поскольку было показано, что гены, которые не являются конститутивно экспрессируемыми, находятся под строгим регуляторным контролем со стороны энхансеров и, как правило, имеют более специфические для конкретного типа клеток паттерны экспрессии [66], например, SCN1A [67]. Систематическое сравнение различных CRISPR-агентов для модуляции экспрессии генов может быть необходимо для лучшего понимания их коллективного и индивидуального клинического потенциала.

Важность дозировки отражает решающее свойство ионных каналов и синаптических белков в гомеостатическом контроле возбудимости нейронов и их жесткую регуляцию на уровне транскрипции и трансляции [68, 69]. Этот феномен лежит в основе синергии между различными ключевыми игроками в поддержании надлежащих заданных значений возбудимости, несмотря на физиологические и патологические изменения в экспрессии генов [70]. Такой гомеостатический контроль интегрирован как на уровне отдельных клеток, так и на уровне сетей [71, 72]. Поэтому экспрессия ионных каналов и синаптических белков динамична и тесно связана с активностью сети.

Зависимая от активности экспрессия нескольких генов имеет ключевое значение для формирования крепких зрелых нейронных сетей во время развития, это является чувствительной фазой для большинства моногенных эпилепсий [73]. Изменения в потоке ионов, опосредованные мутацией одного гена, встроенного в гомеостатический узел, могут привести к более широким изменениям в экспрессии генов и белков, способствуя аберрантной активности сети и, возможно, формированию эпилептического головного мозга [74]. В качестве примера можно привести выявление сети коэкспрессии из 320 генов (M30), которые, как оказалось, обычно нарушены при некоторых эпилепсиях различной этиологии, это показывает, что мы должны рассматривать генетическую эпилепсию не как единичный эффект мутации гена, а как результат глобальных изменений в экспрессии генов [75]. Важно отметить, что ионные каналы, связанные с генетической эпилепсией, функционально взаимосвязаны. Например, баланс между Nav1.1 (гаплонедостаточность приводит к синдрому Драве) и Kv3.1 (доминантно-негативный, приводит к PME и изменениям нейрального развития) [76] имеет решающее значение для предопределения быстропиковой (fast-spiking ) природы интернейронов [77], причем потеря одного из этих компонентов может серьезно изменить функцию другого. Недавно это было показано на примере потери Nav1.2, которая парадоксальным образом приводит к увеличению внутренней возбудимости за счет предотвращения эффективной реполяризации AP с помощью калиевых каналов [78]. Другим примером является недавнее открытие, что PRRT2 действует как отрицательный модулятор Nav1.2/1.6, что, возможно, объясняет, почему пациенты с мутациями PRRT2 хорошо реагируют на блокаторы натриевых каналов [79]. Кроме того, недавно было показано, что лечение анти-смысловыми олигонуклеотидами для снижения экспрессии Scn8a (Nav1.6) было достаточным для устранения фенотипов заболевания в модели синдрома Драве с гаплонедостаточностью Scn1a [52]. Эти результаты подтверждают функциональную взаимосвязь различных классов белков в контроле возбудимости нейронов, мутации которых приводят к генетическим эпилепсиям.

Более того, недавно мы показали, что повышение уровня Kcna1 в приобретенной эпилептической сети не только снижает возбудимость нейронов и частоту приступов, но и может восстановить патологически измененный транскриптом и устранить когнитивные сопутствующие заболевания [80]. Этот вывод подчеркивает, что регуляция генов и активность сети тесно коррелируют, и иллюстрирует, как небольшое изменение в экспрессии генов может привести к более глубоким глобальным эффектам [72].

Способность редактирования генов устранять глобальные транскриптомные эффекты мутации одного гена еще предстоит выяснить. Известно, что нейроны и нейронные сети со временем компенсируют потерю функции генов [81-83]. Например, было показано, что у мышей с гаплонедостаточностью по гену Scn1a наблюдается преходящие нарушения fast-spiking PV-интернейронов коры головного мозга, с нормализацией возбудимости на стадии P35 [82]. Однако на этом этапе у мышей все еще наблюдаются припадки, что вызывает вопрос: каков основной механизм возникновения припадков при этой генетической эпилепсии?

Важные вопросы, связанные с редактированием генов для лечения эпилепсии, остаются без ответа. Каков идеальный промежуток для вмешательства по исправлению мутировавшего гена? Достаточно ли просто восстановить физиологический уровень экспрессии гена и может ли редактирование генов спасти развитие и устранить когнитивные сопутствующие заболевания? Некоторые исследования уже показали, что существует промежуток вмешательства для полного спасения фенотипов, связанных с генетическими эпилепсиями. Некоторые из этих исследований указывают на важность раннего вмешательства, например, в случае синдрома Ангельмана [84] и синдрома эпилепсии, связанного с KCNQ2/KCNQ3 [85]. Однако другие исследования показали, что и более позднее вмешательство в зрелом возрасте может быть достаточным для устранения тяжелых фенотипов, т.е. припадков и нарушений памяти, как в случае гаплонедостаточности SYNGAP1 [86]. Ответы на такие вопросы для других генетических эпилепсий позволили бы разработать более эффективные терапевтические вмешательства [87]. Дальнейшее развитие и характеристика инструментов CRISPR в соответствующих моделях заболеваний может дать ответы на эти важные вопросы.

Хотя CRISPR/Cas имеет преимущества перед классическими методами генной терапии, ограничения, связанные с доставкой в ЦНС, низкой эффективностью редактирования и эффектами вне мишени, могут препятствовать его быстрому внедрению в клинику (см. другие обзоры: [4, 88]). Другие ограничения включают сложность упаковки некоторых инструментов CRISPR (например, редакторов оснований и праймеров) в используемые в настоящее время векторы AAV из-за ограничений в размере генетической полезной нагрузки, а также трудности с доставкой этих инструментов в мозг человека, как по причинам безопасности (например, возможные иммунологические реакции на белки CRISPR), так и по техническим причинам (например, как мы можем обойти гематоэнцефалический барьер и достичь высокой эффективности трансдукции) [4, 12, 21, 88]. Постоянно появляются новые инструменты и технологии, направленные на преодоление этих фундаментальных ограничений для трансляции, что, однако, позволяет предположить, что эти проблемы будут решены в ближайшем будущем.

Что касается конкретно эпилепсии, то низкая эффективность CRISPR-опосредованного редактирования может приводить к генетическому мозаицизму, который сам по себе может привести к аберрантной сетевой активности и нарушающим адаптацию компенсациям. Безусловно, мозаицизм сам по себе является патогенным при некоторых эпилепсиях, например, Х-сцепленные мутации в PCDH19 [89]. Мозаицизм также характерен для CDKL5, SCN2A и SCN1A [90], и точное мутационное бремя, необходимое для формирования эпилептической сети, до сих пор не до конца понятно. Интересно, что в недавнем исследовании этот вопрос был рассмотрен для мутации Scn8a. Было показано, что наличие GOF-мутации в Scn8a n у более 16% нейронов достаточно для снижения судорожного порога, в то время как мутация у более 50% нейронов формировала эпилептическую сеть, предполагая, что для лечения этой генетической эпилепсии потребуется высокоэффективная CRISPR-терапия [91].

Несмотря на эти ограничения, использование CRISPR для коррекции и модуляции экспрессии генов при генетической эпилепсии является фундаментальной ступенькой для лучшего понимания и лечения этих разрушительных и угрожающих жизни патологий.

В настоящее время мы располагаем разнообразными генетическими инструментами на основе CRISPR, способными потенциально лечить все мутации, приводящие к генетической эпилепсии (рис. 1). Для продвижения к клинике необходим надлежащий анализ основных эпилептогенных механизмов, соответствующей дозы гена, временного окна для вмешательства и потенциальных изменений в молекулярной сети. С другой стороны, параллельно должны происходить улучшения в доставке, эффективности и внецелевых эффектах инструментов CRISPR, чтобы ускорить их применение при генетических эпилепсиях и других нейрологических заболеваниях. На сегодня мы имеем разнообразные базирующиеся на CRISPR генетические инструменты, которые способны в принципе лечить все мутации, приводящие к генетической эпилепсии (Fig. 1). Улучшения в доставке, эффективности и устранение эффектов вне мишени CRISPR инструментов будут появляться параллельно с потребностью в их использовании при генетической эпилепсии и др. нейрологичеких болезней.



Fig. 1 CRISPR/Cas-based strategies for genetic epilepsies. The impact of different types of epilepsy mutation is represented as a % of protein function, with each allele contributing 50% towards total protein function under normal physiological conditions. Reduced protein function, as a result of loss-of-function mutations or dominant negative repression of WT protein function, results in? 50% towards protein functionality. Gene editing/modulation strategies allow for the 'normalisation' of protein function to physiological levels by either increasing or decreasing the functional output of the WT or mutant allele. Abbreviations: Indels insertions or deletions, HITI homology-independent targeted integration, dCas9 catalytically deactivated Cas9, CRISPRa CRISPR activation, CRISPRi CRISPR interference, WT wild-type, MUT mutant