Поскольку CRISPR-Cas9 представляет собой революционную технологию редактирования генов, то её доставка в головной мозг сталкивается с проблемами систем доставки. Лауреат Нобелевской Премии 2020 по химии, CRISPR-Cas9 скомбинировал Cas9 нуклеазу с single-guide RNA (sgRNA), чтобы связывать и целенаправленно воздействовать на ДНК для редактирования генов (1, 2) и использовать для воздействия на генетические нарушения (3, 4). Однако, наиболее современной CRISPR-Cas9 системой доставки в головной мозг являются вирусные векторы, которы обнаруживают, однако, низкий объем упаковки материала и обнаруживают проблемы с надежностью из-за индукции нежелательных генетических мутаций и иммуногенности (5). Вирусные векторы ограничены также в возможности крупно-масштабного производства, необходимого для переноса в клинику (6), тогда как базирующиеся на наночастицах невирусные векторы являются обычно неиммуногенными и делают возможной массовую их продукцию (7). Принимая во внимание, что головной мозг является главным и чувствительным местом возникновения болезней у людей, поэтому многие исследователи сконцентрированы на использовании базирующейся на CRISPR-Cas9 генотерапии болезней головного мозга (8, 9). Предыдущие исследования предоставили терапевтическое подтверждение принципов (10-12), с нежелательным использованием инвазивных инъекций в головной мозг CRISPR-Cas9 комплексов, содержащихся в вирусных векторах или наночастицах, что часто приводит к серьезным побочным эффектам, включая инфекции, воспалительный отек и повреждения тканей (13, 14). Поэтому крайне необходима разработка неинвазивной доставки инкапсулированных в наночастицы CRISPR-Cas9 комплексов для обеспечения генотерапии нарушений головного мозга (15). Ключевым препятствием является обход гемато-энцефалического барьера (BBB), чей фенотип и физическая структура варьируют в зависимости от сосудистого окружения и физиологического состояния головного мозга (16, 17). Поэтому гетерогенность BBB может оказаться полезной в построении проникающих через BBB систем доставки лекарств. Обычно поверхность наночастиц положительно заряжена, поэтому возникает тканевая токсичность и эффекты вне мишени , это добавляет дополнительные проблемы, препятствующие переносу в клинику (18, 19).

Мы обратились к этим проблемам, разработав новую платформу доставки CRISPR-Cas9, которая удовлетворяет следующим критериям: легкость приготовления, загрузка большого содержимого, небольшой и униформный размер, стабильность с длительным периодом жизни в плазме, проницаемость BBB, активное целенаправленное воздействие на головной мозг и опухолевые клетки головного мозга, rбыстрое высвобождение внутри клеток, эффективное редактирование генов и незначительные эффекты вне мишени. Разработана нами платформа представляет собой тонкую полимерную оболочку из поперечно связанных disulfide, декорированную angiopep-2 пептидом [лигандом, который связывает низкой плотности lipoprotein receptor-related protein-1 (LRP-1), т.е. с тем, что экспрессируется на высоком уровне на эндотелиальных клетках BBB и клетках glioblastoma (GBM) ] (20, 21). Эта полимерная оболочка может инкапсулировать комплексы из single Cas9 ribonucleoprotein/sgRNA в небольшие нанокапсулы (~30 nm) с почти нейтральным поверхностным зарядом, чтобы защищать груз от деградации с помощью ribonuclease (RNase) и способствовать их стабильности в крови и плазме, что существенно для неинвазивного проникновения через BBB. Небольшой размер и функционализация angiopep-2 пептида ещё больше способствует проникновению через BBB и доставке внутрь клеток в головном мозге по сравнению с GBM-специфическим воздействием. Инкапсуляция комплексов single Cas9 ribonucleoprotein/sgRNA обеспечивает высокую (почти 100%) загрузку лекарства, поскольку поперечно-связанные disulfide используют очень высокие внутриклеточные состояния glutathione (GSH) опухолевых клеток, чтобы высвобождать груз в местах путем расщепления дисульфидов, приводя нанокапсулы к деградации для осуществления высоко-производительного редактирования генов (22). Мы показали, что anti-Polo-like kinase 1 (PLK1) Cas9/sgRNA , инкапсулированная в наши вновь разработанные нанокапсулы существенно снижает экспрессию белка клеточных митозов PLK1 в GBM с ничтожным редактированием генов вне мишени при использовании двух типичных orthotopic GBM мышиных моделей. Нанокапсулы, лишенные поперечно-связанных disulfide или функционализации angiopep-2 значительо менее эффективны в достижении головного мозга и осуществлении редактирования генов.

FIG. 1. Fabrication, physical properties, and cellular function of Cas9/sgRNA nanocapsules.

(A) In situ free-radical polymerization was used to synthesize disulfide-cross-linked nanocapsules containing Cas9/sgRNA and functionalized with angiopep-2 targeting ligand. (B) Size distribution of ANC _{ANC SS(Cas9/sgRNA) nanocapsules determined by dynamic light scattering. (C) TEM images of ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) with or without GSH treatment. (D) Gel electrophoresis analysis of the ANC ANC SS(Cas9/sgPLK1) or free Cas9/sgPLK1 with or without RNase treatment (1 mg/ml, 30 min). (E) Flow cytometry of U87MG cells following 4-hour incubation with ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) or controls. (F) Confocal laser scanning microscopy (CLSM) images of U87MG cells following 4-hour incubation with ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) or controls. Cas9 was labeled with Alexa Fluor 647 (AF647; red); the cytoskeleton was stained with Alexa Fluor 488 (green), and the nuclei was stained with Hoechst 33342 (blue). For (E) and (F), the AF647-Cas9 concentration was 20 nM. Scale bars, 20 ?m. (G) Luciferase gene editing efficiency in U87MG-Luc cells incubated with ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) or controls for 72 hours. Data are presented as means ± SD (n = 5; *P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001). (H) Indels of the PLK1 gene in U87MG cells transfected with ANC ANC SS(Cas9/sgPLK1) or controls for 48 hours. (I) Schematic of gene editing in the nucleus. (J) Expression levels of PLK1 in U87MG cells after 72-hour incubation with ANC ANC SS(Cas9/sgPLK1) or controls. (K) Apoptosis assay of U87MG cells after 72-hour incubation with ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) and other controls. For (G) to (K), the Cas9 concentration was 20 nM. bp, base pairs; PBS, phosphate-buffered saline.}

Мы затем исследовали проникновение через BBB нанокапсул ANC <sub>ANC SS(Cas9/sgRNA) на in vitro BBB transwell модели путем засеивания эндотелиальных клеток, избыточно экспрессирующих LRP-1 (fig. S6). Полученные результаты показали, что ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) обнаруживают существенно увеличенную проницаемость BBB по сравнению с нецелевым NCSS(Cas9/sgRNA) контролем (Fig. 2A). Мы также оценивали, могут ли ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) нанокапсулы проникать в сердцевину опухоли GBM, используя хорошо известную 3D U87MG опухолевую сфероидную модель. Результаты показали ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) даёт сильную флюоресценцию в опухолевых сфероидах до 100 ?µm в глубину (Fig. 2B and fig. S13). Нанокапсулы ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) обнаруживают продолжительную циркуляцию в крови с периодом полу-жизни (t1/2) в 57 min, в контроле (53 min) в nondegradable контроле (56 min). Свободные Cas9/sgRNA элиминируются быстро (t1/2 = 5 min) (Fig. 2C).



FIG. 2. BBB permeability, pharmacokinetics, deep tumor penetration, and biodistribution of Cas9/sgRNA nanocapsules.

(A) Cumulative transport ratio of ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) nanocapsules across the in vitro BBB barrier at 2, 6, and 12 hours (n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001). (B) Penetration of ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) nanocapsules into U87MG multicellular spheroids after 4 hours of incubation (AF647-Cas9 concentration was 20 nM). Scale bars, 200 ?m. (C) Pharmacokinetics of ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) and controls in tumor-free mice (1.5 mg of Cas9 equiv./kg; n = 3). (D) Illustration of the nanocapsules follow intravenous injection specifically binding to LRP-1 that is overexpressed both on BBB endothelial cells and brain tumor cells. (E) Fluorescence images of orthotopic U87MG-Luc tumor-bearing nude mice following injection of ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) nanocapsules or controls (1.5 mg of Cas9 equiv./kg). (F) Luciferase luminescence and AF647-Cas9 fluorescence from major organs in nude mice bearing orthotopic U87MG-Luc 4 hours after intravenous injection of ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) nanocapsules or controls (1.5 mg of Cas9 equiv./kg). H, heart; Li, liver; S, spleen; Lu, lung; K, kidney; B, brain. Enlarged image: tumor penetration of ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) and controls observed by CLSM. Nuclei were stained with Nuclei were stained with DAPI (blue) and blood vessels with CD31 (green); AF647-Cas9 is red. Dotted lines indicate tumor boundary. N, normal brain tissue; T, tumor. Scale bars, 50 ?m. (G) Quantitation of AF647-Cas9 accumulation in different organs (n = 3; *P < 0.05 and **P < 0.01). (H) Luciferase expression in glioblastoma in mice at 0, 24, 48, and 72 hours after injection of ANC ANC SS(Cas9/sgLuc) or ANC ANC SS(Cas9/sgScr) (1.5 mg of Cas9 equiv./kg). (I) Quantitation of luminescence intensity from U87MG-Luc tumor-bearing mice (n = 3; ***P < 0.001).</sub>

Мы также оценили способность нанокапсул пересекать BBB in vivo после инъекции в хвостовую вену U87MG-Luc tumor-несущих мышей. Внутривенные инъекции NCSS(Cas9/sgRNA) приводили к очень слабой флюоресценции AF647 в головном мозге, подтверждая разрушение BBB, вызываемое опухолью GBM (33-35). Флюоресценция практически отсутствовала при воздействии свободных Cas9/sgRNA. Мы впервые установили, что инфильтрацию у модельных мышей, несущих GSC с LRP-1 receptor-expressed 83NS GSCs (fig. S15). Полученные результаты показали, что ANC <sub>ANC SS(Cas9/sgRNA) обнаруживает прекрасную проницаемость BBB (fig. S16).



FIG. 3. Genome editing efficiency of CRISPR-Cas9 nanocapsule in orthotopic U87MG GBM xenografts.

(A) Schematic showing the timeline of the U87MG orthotopic tumor model study. (B) Quantified luminescence levels of mice using the Lumina IVIS III System following the indicated treatments. Data are means ± SD (***P < 0.001). (C) Body weight changes in mice following the indicated treatments. Data are means ± SD (*P < 0.05). (D) Luminescence images of orthotopic U87MG-Luc human glioblastoma tumor-bearing nude mice following treatment with PBS (left), ANC ANC SS(Cas9/sgPLK1) (middle), or ANC ANC SS(Cas9/sgScr) (right). Mice were intravenously injected at a dose of 1.5 mg of Cas9 equiv./kg on days 10, 12, 14, 16, and 18 after tumor implantation (n = 11). (E) Mice survival rates (n = 7). Statistical analysis: ANC ANC SS(Cas9/sgPLK1) versus ANC ANC SS(Cas9/sgScr) or PBS, (Kaplan-Meier analysis, log-rank test). (F) Indel frequency of PLK1 gene in tumor tissues excised from mice on day 20. (G) H&E staining of whole brain excised on day 20 from euthanized U87MG-Luc-bearing mice treated with different nanocapsule formulations as described above. (H) Western blot of PLK1 protein expression in tumor tissues excised on day 20. β-Actin was used as a reference. (I) Quantitation of Western blotting of PLK1 protein expression relative to β-actin. Data are means ± SD (n = 3; **P < 0.01). (J) Sequencing results of PLK1 gene editing in U87MG-bearing mice treated with ANC ANC SS(Cas9/sgPLK1) (1.5 mg of Cas9 equiv./kg).</sub>

FIG. 4. Genome editing efficiency of CRISPR-Cas9 nanocapsule in GSC CSC2 xenografts.

(A) Schematic of patient-derived xenograft (PDX)-derived GBM GSCs orthotopic model establishment. (B) Luminescence levels of mice over the 10-day treatment period measured with a Lumina IVIS III system. Data are means ± SD (***P < 0.001). (C) Luminescence images of orthotopic CSC2-Luc GSC tumor-bearing mice following treatment with ANC _{ANC SS(Cas9/sgPLK1), ANC ANC SS(Cas9/sgScr), or PBS. Mice were intravenously injected at a dose of 1.5 mg of Cas9 equiv./kg on days 10, 12, 14, 16, and 18 after tumor implantation (n = 11). (D) Body weight changes over the 10-day treatment period in mice receiving ANC ANC SS(Cas9/sgPLK1) (1.5 mg of Cas9 equiv./kg), ANC ANC SS(Cas9/sgScr), or PBS. Data are means ± SD (*P < 0.05). (E) H&E staining of brain excised from CSC2-Luc GSC tumor-bearing mice treated with different nanocapsule formulations on day 20 after tumor implantation. (F) Mice survival rate curves (n = 7). Statistical analysis: ANC ANC SS(Cas9/sgPLK1) versus ANC ANC SS(Cas9/sgScr) or PBS, ****P < 0.0001 (Kaplan-Meier analysis, log-rank test). (G) Indel frequencies of PLK1 gene in tumor tissues from mice treated with ANC ANC SS(Cas9/sgPLK1) (1.5 mg of Cas9 equiv./kg), ANC ANC SS(Cas9/sgScr), or PBS on day 20 after tumor implantation. (H) PLK1 protein expression in tumor tissues excised from mice receiving different nanocapsule formulations on day 20 after tumor implantation. (I) Quantification of Western blotting of PLK1 expression relative to ?-actin. Data are means ± SD (n = 3; **P < 0.01). (J) DNA sequencing results of PLK1 gene editing in GSC tumors excised from mice treated with ANC ANC SS(Cas9/sgPLK1) (1.5 mg of Cas9 equiv./kg).}

FIG. 5. Evaluation of the safety of CRISPR-Cas9 nanocapsules in vivo.

Mutation frequencies of off-target sites (tumor, normal brain tissue, liver, and kidney) in (A to D) U87MG and (E to H) CSC2 GSC tumor-bearing mice treated with ANC _{ANC SS(Cas9/sgPLK1) (1.5 mg of Cas9 equiv./kg). Each value was determined from a single deep-sequencing library prepared from genomic DNA. Blood biochemistry analysis (I to L), blood parameter analysis (M to O), and body weight changes (P) of healthy BALB/c mice treated with ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) or PBS at 24, 48, 72, or 96 hours after nanocapsule injection. Data are presented as means ± SD (n = 5). N.S. represents nonsignificance. ALB, albumin; ALP, alkaline phosphatase; ALT, plasma alanine aminotransferase; AST, aspartate aminotransferase; PLT, platelet; RBC, red blood cell; WBC, white blood cell.}

Технология редактирования генов CRISPR-Cas9 позволяет быстро создавать мутации, вставки и делеции в геноме клеток-мишеней (44, 45). Хотя эта технология уже использовалась для лечения заболеваний мозга с помощью внутримозговых инъекций (3, 46), дальнейшее клиническое применение генотерапии при заболеваниях мозга сдерживается отсутствием неинвазивных, эффективных и безопасных систем доставки CRISPR-Cas9 в мозг через BBB для воздействия на больные клетки в мозге (47). Существующие подходы к доставке CRISPR-Cas9 в мозг включают доставку вирусных векторов (лентивирусы и адено-ассоциированные вирусы) (45) и невирусную синтетическую доставку (золото, липиды и полимеры) (48, 49). Хотя эти подходы обеспечили ценное доказательство принципа in vivo, эти методы не идеальны для клинического применения у человека. Доставка вирусных векторов, например, может вызвать высокорискованные иммунные реакции и осложнения, связанные с эффектом "вне мишени", а также сложна для крупномасштабного производства (50). С другой стороны, существующие невирусные системы доставки ограничены низкой эффективностью загрузки, не-целенаправленностью, проблематичным выведением из мозга, риском нейровоспаления и отсутствием быстрого высвобождения лекарства (51). Они также серьезно ограничены в проникновении через ВВВ и не нацелены на конкретные очаги заболеваний мозга (52). Однако эти свойства важны, поскольку они позволяют осуществлять внутривенное введение и тем самым избегать риска травмы мозга, возникающего при прямом местном введении в мозг или внутримозговой доставке (14, 53).

В этом исследовании мы разработали невирусную систему доставки CRISPR-Cas9, ANC _{ANC SS(Cas9/sgRNA), используя angiopep-2-функционализированные биоразлагаемые нанокапсулы, которые инкапсулируют и защищают белок Cas9 и sgRNA для неинвазивного, целенаправленного нокдауна генов. По своей конструкции наши новые нанокапсулы ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) обладают свойством самоинкапсуляции одиночного рибонуклеопротеина Cas9/sgRNA, что приводит к высокой эффективности загрузки почти 100% (комплексов рибонуклеопротеина Cas9/sgRNA). Кроме того, инкапсуляция одиночной Cas9/sgRNA приводит к образованию небольшой однородной нанокапсулы диаметром ~30 нм, что благоприятно для проникновения через BBB и последующего глубокого транспорта в мозг и опухоль. Следующим ключевым элементом дизайна было включение дисульфидных связей (-SS-) в оболочку нанокапсулы, что имеет две важные функции: защита комплекса Cas9/sgRNA от ферментативной деградации в крови и возможность быстрого высвобождения Cas9/sgRNA при столкновении с высокой внутриклеточной восстановительной средой, где высокая концентрация GSH (от 2 до 10 мМ), присутствующая в опухолевых клетках, способна разрушить дисульфидную связь для биодеградации нанокапсулы (рис. 1С). Следующий ключевой элемент дизайна включает стратегию "два зайца - один камень" путем функционализации внешней оболочки нанокапсул Cas9/sgRNA пептидом angiopep-2, который специфически связывается с рецептором LRP-1, высоко экспрессированным как на эндотелиальных клетках ВВВ, так и на клетках GBM, наделяя нанокапсулы ANC ANC SS(Cas9/sgRNA) как высокой проницаемостью в ВВВ, так и способностью нацеливаться на GBM.}

Чтобы успешно достичь целевых участков глиобластомы в глубине мозга, терапевтические агенты должны оставаться неповрежденными в кровотоке достаточно долго для достаточного проникновения через BBB и накопления в GBM. Наши нанокапсулы ANC _{ANC SS(Cas9/sgRNA) демонстрировали длительное время циркуляции в крови с периодом полувыведения 57 мин, что приводило к проникновению в BBB через рецептор-опосредованный трансцитоз и тем самым использовали нарушенную структуру BBB благодаря гетерогенности BBB (54) в GBM для заметного накопления в опухоли, достигая максимальной концентрации (11,8% от ID) через 4 часа после инъекции. Учитывая, что большинство других систем доставки лекарств на основе наночастиц достигают накопления только от 1 до 5% от ID в мозге (55-57), наша стратегия разработки обеспечивает явный прогресс, который был продемонстрирован достижением высокоэффективного редактирования гена PLK1 (до 38,1% нокдауна гена). Насколько нам известно, это самая высокая эффективность редактирования генов in vivo на основе CRISPR-Cas9, о которой уже сообщалось для невирусной системы доставки при внутривенном введении. Эти обнадеживающие результаты, вероятно, объясняют заметное торможение роста опухоли глиобластомы и примерно трехкратное увеличение средней продолжительности выживания под действием нанокапсул ANC ANC SS(Cas9/sgPLK1) (68 дней против 24 дней в модели GBM U87MG и 55 дней против 21 дня в модели CSC2).}

Учитывая, что вне-целевые эффекты, вызываемые CRISPR-Cas9, могут привести к нежелательным хромосомным перестройкам и представляют собой серьезное ограничение для CRISPR/Cas9, серьезно затрудняющее клиническое применение, важно было систематически оценить потенциальный вне-целевой эффект ANC _{ANC SS(Cas9/sgPLK1) как в GBM, так и в других нормальных тканях. Обнадеживает то, что неинвазивное введение ANC ANC SS(Cas9/sgPLK1) вызвало незначительные побочные эффекты (<0,5%; рис. 5), что в основном объясняется инкапсуляцией рибонуклеопротеина Cas9, а не плазмиды или мРНК (58), нейтральным зарядом поверхности, специфическим нацеливанием и контролируемым внутриклеточным высвобождением Cas9/sgRNA. Еще одним фактором, способствующим снижению эффектов вне мишени, является то, что экспрессия рецептора LRP-1 и целевого гена PLK1 значительно ниже в нормальной ткани мозга по сравнению с GBM.}

Для продвижения клинического применения для лечения GBM наши нанокапсулы могут быть усовершенствованы следующим образом: (i) Учитывая, что опухоли мозга имеют сложный патогенез, редактирование одного гена вряд ли сможет полностью уничтожить опухоль (как показано в данном исследовании). В будущих исследованиях мы будем инкапсулировать две или несколько sgRNA с Cas9 для нацеливания и редактирования нескольких патогенных генов одновременно для достижения более эффективного лечения опухолей мозга. (ii) Можно разработать более специфические лиганды для нацеливания, чтобы еще больше увеличить поглощение клетками GBM по сравнению с нормальными клетками мозга, тем самым уменьшая эффект "вне мишени". (iii) Эти нанокапсулы могут быть адаптированы для нокаута генов апоптоза [P53 (59) и PTEN (60)] в клетках GBM для индукции апоптоза опухоли.

В заключение, мы разработали angiopep-2-декорированную, GSH-реактивную одиночную CRISPR-Cas9 нанокапсулу [ANC _SS(Cas9/sgRNA)] в качестве неинвазивной системы доставки в мозг и системно продемонстрировали, что она обладает превосходными свойствами, включая высокую загрузку CRISPR-Cas9 и способность высвобождения в зависимости от внутриклеточной среды, отличные способы нацеливания на мозг и опухоль, выдающаяся эффективность редактирования генов и незначительный эффект вне мишени на хорошо зарекомендовавших себя животных моделях, успешно устраняя узкие места (низкое проникновение через BBB, слабое нацеливание на больную ткань, низкая эффективность редактирования генов in vivo и нежелательный вне-целевой эффект) в доставке CRISPR-Cas9 в мозг для эффективного и безопасного подхода к генотерапии GBM. Эта новая система доставки CRISPR-Cas9 в мозг является универсальной и мощной платформой для лечения глиобластомы и других заболеваний мозга.