Рекомбинантный адено-ассоциированный вирус (rAAV) при генотерапии обладает потенциалом для долгосрочного улучшения состояния ряда моногенных генетических заболеваний после однократного введения. Успех такого лечения зависит не только от величины терапевтического эффекта, но и от его продолжительности. Длительность терапевтического эффекта зависит от поддержания экспрессии трансгена в течение длительного времени.

Появляются доказательства того, что эффект от генотерапии rAAV может сохраняться в течение длительного времени. Восстановление у модели болезни Паркинсона у обезьян было продемонстрировано через 15 лет после введения генотерапии на основе rAAV в putamen.¹ У людей стабильная терапевтическая экспрессия factor IX (FIX) у людей с тяжелой формой гемофилии B наблюдалась в течение 8 лет после системного введения вектора на основе rAAV8, по состоянию на 2018 год.² Кроме того, экспрессия FIX была обнаружена в мышечной ткани человека после генотерапии, направленной на мышцы, в течение 10 лет после введения.³ По первым двум одобренным rAAV генотерапиям человека - alipogene tiparvovec для лечения семейного дефицита липопротеинлипазы и voretigene neparvovec для лечения врожденного амавроза Лебера - продолжительность ответа достигала 6 и 4 лет, о чем сообщалось в публикациях с 2016 по 2009 год соответственно.^4-6 Важно отметить, что указанные здесь сроки не являются пределом продолжительности лечения, а скорее тем, что наблюдалось и было опубликовано на сегодняшний день. В своем обзоре voretigene neparvovec за 2019 год Национальный институт здравоохранения и медицинского обслуживания Великобритании (NICE) отметил наличие данных, свидетельствующих об устойчивом терапевтическом эффекте до 7,5 лет, хотя они еще не были опубликованы в рецензируемом журнале.⁷

Однако, сообщалось также о потере ранее установленной экспрессии трансгенов как у животных, так и у людей.^8-12 Из этих исследований следует, что длительность экспрессии трансгенов после генотерапии rAAV является сложной и многофакторной, хотя время потери экспрессии может дать важные подсказки относительно причины (рис. 1).



Figure 1. Factors that may reduce durability Non-immunological (orange) and immunological factors (green) that may affect durability over weeks, months, and years post-gene therapy administration. CpG, 5'-cytosine-phosphate-guanine-3?; dsRNA, double-stranded RNA.

По мере того, как все больше генотерапий будет внедряться в клинику, уверенность в стойкости эффекта будет иметь первостепенное значение для всех заинтересованных сторон, включая пациентов и их семьи, опекунов, врачей, исследователей, промышленность, а также плательщиков и регулирующие органы, и будет иметь ключевое значение для определения ценности, которую каждая группа заинтересованных сторон придает генотерапии. По этим причинам важно выяснить факторы, лежащие в основе долговечности, чтобы можно было оптимизировать терапию и долгосрочное наблюдение за пациентами для обеспечения долговечной экспрессии трансгенов.

AAV, парвовирус, репликация которого зависит от совместной инфекции с другими вирусами, является одним из наиболее изученных на сегодняшний день in vivo средств доставки генов¹³. Однако, после первого применения в 1995 году,^14,15 до сих пор существуют лишь ограниченные временные рамки для оценки долговечности трансгенов у человека. rAAV, имеющий диаметр 25 нм¹⁶ и лишенный белок-кодирующей вирусной ДНК (гены rep и cap), свойственной AAV дикого типа, представляет собой нано-частицу на основе белка, способную преодолевать клеточную мембрану и доставлять ДНК трансгена, которую он несет, в ядро клетки.¹³ Векторы rAAV могут быть сконструированы таким образом, чтобы изменить их тканевой тропизм и уклониться от иммунитета хозяина, обеспечивая тем самым более эффективную трансдукцию целевой ткани и успешную экспрессию трансгена.¹⁷

AAV преимущественно не интегрируется, в отличие от других вирусных векторных платформ, таких как лентивирус.^18,19 Сохранение терапевтического эффекта после лечения зависит от формирования и поддержания циркулярных эписом в неделящихся клетках.^13,20 Хотя инвертированные терминальные повторы (ITRs), которые обычно фланкируют геном AAV, явно функционируют как начало репликации ДНК, а также как сигналы упаковки в клетках-продуцентах rAAV, их роль в сохранении эписом недостаточно хорошо описана. ITRs служат праймерами для синтеза второй нити в ядрах клеток-реципиентов, а затем становятся мишенями для факторов репарации ДНК, которые либо соединяют их вместе, образуя круг, либо соединяют их с другими линейными геномами rAAV, образуя конкатемеры, либо с предсуществующими хромосомными двунитевыми (ds) разрывами, что приводит к относительно редким событиям интеграции.^21,22. Хотя шпилечные структуры ITRs, по-видимому, влияют на то, какие факторы репарации ДНК необходимы для формирования колец, неясно, почему этот процесс более эффективен или приводит к большей долговечности, чем простое повреждение концов dsDNA.^23,24

В тканях с низким клеточным оборотом эписомная ДНК может сохраняться в течение многих лет, о чем свидетельствует длительная экспрессия трансгенов, наблюдаемая в исследованиях на животных и людях.^2,25,26 На рисунке 2 представлены основные этапы после введения rAAV генотерапии, которые должны быть достигнуты для установления экспрессии трансгенов.



Figure 2. From rAAV administration to long-term transgene expression The rAAV vector binds to receptors on the target cell surface (1) and is taken into the cell by endocytosis (2). rAAV traffics from early to late endosomes (3) and is delivered to the nucleus. Once inside the nucleus, the capsid is removed (uncoating) (4), releasing the genetic material. The transgene, if single-stranded, undergoes second-strand synthesis before forming a double-stranded DNA episome (5), which is maintained in the nucleus of the cell where it can be expressed (6), resulting in the production of the protein of interest (7).

Несколько не-иммунологических параметров могут влиять на долговечность экспрессии трансгенов, передаваемых rAAV, в долгосрочной перспективе. Возможно взаимодействие между некоторыми не-иммунологическими и иммунологическими факторами. Например, выбор промотора, серотипа rAAV, характеристик трансгена и способа введения могут привести к иммунной активации при введении rAAV.

В настоящее время генотерапия rAAV ограничивается нацеливанием на клетки, которые долго живут. Повторное введение препарата путем системной доставки в настоящее время не представляется возможным из-за иммунного ответа хозяина на первоначальную терапию,^27-30 поэтому обеспечение длительной экспрессии трансгена имеет большое значение. Различные популяции клеток имеют разную скорость клеточного оборота (Таблица 1). Поскольку считается, что эписомы не наследуются дочерними клетками и, скорее всего, будут потеряны во время митоза, скорость оборота клеток будет определять долговечность экспрессии трансгена в ткани-мишени.



Table 1. Human cell turnover of select cell types in various organ systems

Было предпринято несколько попыток измерить клеточный цикл гепатоцитов человека, но полного анализа не существует, и поэтому трудно сделать твердые выводы о продолжительности жизни клеток печени человека. Кроме того, печень состоит из множества различных типов клеток, которые, вероятно, имеют разную продолжительность жизни. Существующие данные по терапии rAAV, направленной на печень, показывают продолжительность жизни, значительно превышающую общепринятую продолжительность жизни гепатоцитов человека, это указывает на то, что либо продолжительность жизни некоторых трансдуцированных клеток превышает эту цифру, либо эписомы поддерживаются с помощью какого-то неизвестного механизма с достаточной скоростью для поддержания постоянного терапевтического эффекта.

Скорость оборота клеток также может меняться в зависимости от возраста. Например, по мере роста печени у детей клетки обновляются с гораздо большей скоростью, чем в зрелом возрасте.^34,36,37 Неизвестен механизм наследования эписом rAAV дочерними клетками, хотя при определенных условиях это может происходить. Эписома может случайно сегрегрироваться с одним из дочерних ядер и сохраняться там до следующего деления клетки. В качестве альтернативы, поскольку многие гепатоциты являются полиплоидными или многоядерными, они могут подвергаться нескольким способам деления клеток во время развития или регенерации.³⁸ Таким образом, многоядерная клетка, несущая эписому rAAV в одном ядре, может делиться без вступления в S-фазу и более эффективно передавать эписому дочерней клетке. Аналогичным образом, гепатоциты могут проходить S-фазу без вступления в М-фазу, что потенциально позволяет эписоме оставаться связанной с ядром, а значит, долговечность терапевтического эффекта не будет ограничена одним сроком жизни.³⁸ Планируются испытания на детях, которые дадут представление о степени и скорости потери эписом в печени детей, а значит, и о долговечности после направленной на печень генной терапии rAAV.³⁹

Миофибриллы медленно обновляются, и дети были включены в исследования по терапии, направленной на мышцы. У людей направленная на мышцы rAAV-терапия дефицита α-1-антитрипсина (AAT) до сих пор демонстрировала стабильную экспрессию трансгенов в течение 5 лет после дозирования вектора.⁴⁰ Нейроны также имеют очень низкую скорость оборота, что должно поддерживать долговечность направленной на нейроны rAAV-терапии, с помощью такой как onasemnogene abeparvovec для лечения спинальной мышечной атрофии. Согласно публикации 2021 года, onasemnogene abeparvovec продемонстрировал продолжительность действия до 5,6 лет после дозированного введения⁴¹.

Следует отметить, что даже если rAAV может быть сконструирован для более специфического воздействия на определенные ткани, тропизм не является полностью избирательным, и трансдукция нецелевых тканей будет иметь место, что может привести к экспрессии трансгена. Использование ткане- и клеточно-специфических промоторов может помочь ограничить экспрессию интересующими тканями и популяциями клеток¹³; однако это не полностью предотвратит экспрессию в нецелевых тканях.

Поскольку доставленные с помощью rAAV трансгены существуют преимущественно в виде не-интегрирующихся эписом, а случайные события интеграции наблюдаются с разной частотой,^19,42-44, вероятно, что эписомы со временем будут разбавлены, поскольку клетки проходят многократные раунды репликации. Это может привести к снижению экспрессии трансгена и уровня интересующего белка, и этот процесс будет ускорен в тканях с высокой скоростью клеточного оборота. Хотя не-интегрирующая природа AAV обычно рассматривается как преимущество в плане безопасности, применение терапии на основе rAAV в настоящее время ограничено долгоживущими клетками, тогда как существует гипотеза, что степень интеграции может обеспечить более длительную экспрессию в тканях с высокой скоростью клеточного оборота.

В культуре клеток было показано, что AAV дикого типа предпочтительно интегрируется в локус на хромосоме 19 человека или аналогичные участки, содержащие элементы связывания Rep.^45,46 Интеграция геномов вектора rAAV была отмечена в исследованиях на животных, но она не была направлена на конкретный локус.⁴⁷ В 10-летнем наблюдении за собаками с гемофилией А были отмечены признаки интеграции rAAV. Интересно, что эти изменения были связаны с повышением уровня экспрессии белка, что указывает на то, что определенная степень интеграции может давать долговременные преимущества. Ни у одной из собак не было обнаружено признаков злокачественной опухоли, и до сих пор не сообщалось о подобных результатах у людей.²⁶ Естественно, интеграция и возможность инсерционного мутагенеза остаются областями для постоянного изучения и бдительности в клинических исследованиях.

Промоторы различаются по своей способности поддерживать долгосрочную экспрессию трансгена в определенных клеточных популяциях, а выключение промотора ассоциируется со снижением экспрессии трансгена.^48-50 Существует тенденция к выключению некоторых промоторов в клетках, в которых они обычно не активны.⁵¹ Например, промотор цитомегаловируса (CMV), используемый в некоторых векторах rAAV, склонен к выключению в печени в течение 5 недель после введения.⁵² Такое же явление наблюдается и в центральной нервной системе, где первоначально промотор CMV обеспечивает высокий уровень нейронной экспрессии, которая замолкает к 10 неделям в мышином спинном мозге и ганглиев дорсальных корешков.⁵³ Несколько исследований показали, что включение нейрон-специфических промоторов приводит к более эффективной трансдукции мозга по сравнению с векторами, несущими промотор CMV.^48,50,54,55.

Метилирование ДНК является одной из основных эпигенетических регуляторных систем, модулирующих экспрессию генов^.56 У млекопитающих гиперметилирование 5'-цитозин-фосфат-гуанин-3' (CpG) динуклеотидов промоторов ассоциирует с инактивацией экспрессии генов и было идентифицировано как знак замалчивания трансгенов после трансдукции вирусного вектора мышиной лейкемии.^57,58. Однако доказательства роли метилирования ДНК, приводящего к выключению промотора, при генотерапии rAAV менее очевидны. В исследовании rAAV, направленном на мышцы у не-человекообразных приматов (NHP), не было обнаружено никаких признаков метилирования промотора, что позволяет предположить, что наблюдаемое снижение экспрессии белка не связано с метилированием генома rAAV.⁵⁹ Роль метилирования ДНК в экспрессии трансгенов rAAV и то, будет ли метилирование варьировать в зависимости от ткани-мишени, еще предстоит выяснить.

Векторы rAAV являются наиболее часто изучаемым подходом при разработке in vivo генотерапии лизосомных заболеваний с неврологическим поражением, поскольку они эффективно трансдуцируют делящиеся и неделящиеся клетки в ЦНС. Продукт трансгена, в данном случае лизосомные ферменты, может быть избыточно экспрессирован после генотерапии. Данные на животных свидетельствуют о том, что существует предел допустимой степени избыточной экспрессии.⁶⁰ У обезьян, получавших прямые внутричерепные инъекции вектора rAAV, кодирующего β-N-ацетилгексозаминидазу (Hex), развивались неврологические симптомы в зависимости от дозы. Гистологическое исследование тканей мозга показало потерю клеток с резким увеличением активности Hex в таламусе.⁶⁰ Ни у одного из животных не было выработано антител против Hex, что указывает на не-иммунную причину неврологического повреждения.⁶⁰ Возможные механизмы потери клеток включают переполнение путей транспортировки белков, реакцию развернутого белка и неправильное гликозилирование.

Эндоплазматический ретикулум (ER) является местом сворачивания (упаковки) секретируемых и мембранных белков в эукариотических клетках. Неправильно свернутые белки удерживаются в ER до их стабилизации, а непоправимо неправильно свернутые белки направляются на протеасомную деградацию.61,62 Избыточная экспрессия трансгена может перегрузить систему контроля качества ER, привести к накоплению неправильно свернутых белков и вызвать стресс ER. Стресс ER может запустить реакцию развернутого белка, каскад, включающий снижение трансляции белка, и может привести к гибели трансдуцированных клеток.^61,62

Высокий уровень экспрессии белка фактора VIII (FVIII) может вызвать реакцию развернутого белка в гепатоцитах. Это явление не наблюдается после введения мышам нулевого вектора или вектора, экспрессирующего FIX, что позволяет предположить, что причиной реакции является уровень FVIII.⁶³ Возможно, что эктопическая продукция FVIII гепатоцитами, а не эндотелиальными клетками синусоидов печени, может вызвать этот ответ, который может привести к прекращению клеточной трансляции и апоптозу, и, в конечном итоге, к снижению экспрессии трансгена.

По мере того, как не-иммунологические факторы, влияющие на долговечность генной терапии, становятся более понятными, изучаются методы повышения долговечности. Эти подходы все еще находятся в стадии изучения, поэтому данные, подтверждающие их применение у людей, ограничены.

Выбор промоторов, ограничивающих экспрессию клеткой-мишенью, позволяет избежать воспалительной реакции, которая может привести к уничтожению трансдуцированных клеток в тканях-мишенях. Оптимизация выбора промотора может также снизить вероятность выключения промотора в органе-мишени и обеспечить стабильную и эффективную активность в тканях-мишенях.^55,64,65 Укороченные промоторные последовательности также успешно использовались для ограничения экспрессии в клетках-мишенях в ЦНС млекопитающих.^66,67.

Intronic recombinase sites enabling combinatorial targeting (INTRSECT), используют векторы, содержащие интроны для обеспечения экспрессии, которая зависит от присутствия нескольких рекомбиназ для нацеливания экспрессии генов на определенные клеточные популяции.^68,69

Поскольку векторы rAAV не обладают интегразной активностью, применение генотерапии rAAV при заболеваниях, требующих длительного лечения, ограничено окончательно дифференцированными тканями. Чтобы преодолеть это ограничение, геномы rAAV могут быть снабжены областями прикрепления к каркасу/матрице, которые обеспечивают эписомную репликацию и тем самым позволяют поддерживать экспрессию трансгенов в пролиферирующих клетках.⁷⁰

Персистенция трансгенов может быть усилена с помощью программируемой нуклеазы для интеграции ДНК в целевой геномный локус. После этого гомологически-направленный репарационный путь клетки-хозяина может использовать геном rAAV в качестве донорского шаблона, что приводит к наследственной вставке терапевтической генной кассеты в геном хозяина.^71-73.

Другая исследуемая стратегия (GeneRide) использует вектор rAAV для доставки корректирующего трансгена, который способен интегрироваться без использования промоторов или нуклеаз. Трансген фланкируется гомологичными нитями ДНК, которые распознаются механизмом репарации ДНК клетки, что позволяет интегрировать его в определенный участок генома хозяина.^74,75

Аналогичный подход, о котором сообщают Smith et al., использует платформу редактирования генов, основанную на классе AAV, полученных из гемопоэтических стволовых клеток, относящихся к классу Clade F, в которой редактирование генома осуществляется с помощью гомологических связей без необходимости зависимых от нуклеаз разрывов ДНК. Успешное редактирование генов было продемонстрировано в клетках человека in vitro и in vivo у мышей.⁷⁶

Несмотря на низкую иммуногенность, иммунные реакции на rAAV могут возникать на нескольких стадиях после введения и, как было показано, влиять как на успех первоначальной трансдукции, так и на долгосрочную стойкость экспрессии трансгенов.^77-80 В дополнение к иммунному ответу на капсид rAAV, возможно, что экспрессия терапевтического белка у человека, который не производит белок дикого типа, может привести к идентификации белка как чужеродного и вызвать иммунный ответ.⁷⁸ Иммунный ответ на вектор rAAV или продукт трансгена включает сложный ряд взаимодействий между врожденной и адаптивной иммунными системами (рис. 3).^77,78.



Figure 3. Immune processes affecting the durability of rAAV gene therapy

(A) Immune responses can occur against the rAAV capsid, transgene, or transgene protein. (B) In the case of recipients with prior exposure to rAAV or a similar serotype, NAbs may prevent initial transduction, resulting in low or absent expression of the transgene. Innate immune responses could result in no expression or a rapid loss of expression, but they are more likely to provide important signals to the adaptive immune system, with the potential to reduce or eliminate expression at a later stage after transgene expression has been established. On subsequent exposure, memory cells of the adaptive immune system can respond rapidly, with the release of NAbs against the rAAV capsid. dsRNA, double-stranded RNA; NAbs, neutralizing antibodies; rAAV, recombinant adeno-associated virus.

Поскольку роль нейтрализующих антител (NAbs) в потенциальном предотвращении начальной трансдукции после системной доставки rAAV была хорошо документирована и рассмотрена в других источниках,^30,78,81-83 и NAbs влияют на начальный успех, а не на долговечность, они выходят за рамки данного обзора. Что касается долговечности, то если экспрессия трансгена будет потеряна, то можно предположить, что иммунная память, в частности наличие этих высокоспецифичных NAbs, запретит повторное системное введение того же или аналогичного вектора rAAV.⁸³ Однако стоит признать, что большинство, но не все текущие испытания генотерапии rAAV (NCT03520712, NCT03569891) исключают AAV-серопозитивных участников.⁸⁴ Будет интересно посмотреть, сохранится ли успешная экспрессия трансгена в течение длительного времени у участников, у которых до введения rAAV-генотерапии имелись NAbs к AAV, или же взаимодействие между NAbs и другими аспектами иммунной системы может сыграть более позднюю роль в ограничении длительности экспрессии у этих людей.

В отсутствие предварительного воздействия AAV врожденная иммунная система является первой линией защиты против rAAV и может реагировать как на капсид, так и на геном (рис. 4).^77,78,82 Хотя врожденный иммунный ответ против генотерапии с помощью rAAV считается мягким и преходящим по сравнению с другими вирусными векторами,⁸⁵ существует понимание того, что врожденная иммунная система играет ключевую роль в определении степени последующего адаптивного иммунного ответа,⁷⁷ таким образом, потенциально влияя на долгосрочность экспрессии трансгенов rAAV. В частности, исследования на мышах показывают, что путь Toll-подобный рецептор 9 (TLR9)/миелоидный фактор дифференцировки 88 являются критическим для запуска ответа CD8+ cytotoxic T lymphocyte (CTL) на капсид rAAV и продукт трансгена.^86,87 В отличие от мышей дикого типа, введение иммуногенного капсида AAVrh32.33 в скелетные мышцы мышей с дефицитом TLR9 не привело к ответу CTL, опосредованному интерфероном (IFN)-γ. Более того, истощение CpG в AAVrh32.33 позволило обойти иммунную систему и сохранить экспрессию трансгена у мышей дикого типа.⁸⁶ Более поздние исследования на мышах показали, что истощение CpG в кассете экспрессии AAV1/2 снижает cross-priming капсид-специфических CD8+ Т-клеток у мышей, потенциально снижая, но не полностью подавляя, Т-клеточный ответ против вирусного капсида и терапевтического трансгена.⁸⁸



Figure 4. Mechanisms of rAAV detection by the innate immune response

(1) TLRs are membrane-bound pattern-recognition receptors responsible for detecting pathogen-associated molecular patterns, for example, in the genomes of bacteria and viruses. The rAAV genome, particularly unmethylated CpG motifs, can be detected by TLR9 on the endosomal membranes of dendritic cells following endocytosis and degradation by the endosome. In addition, TLR2, which recognizes microbial protein and glycolipid structures on the dendritic cell surface and within endosomes, has been shown to detect the AAV capsid in circulation.^77,82 TLR2 and TLR9, with the downstream mediator MyD88 are believed to be the key pattern-recognition receptors responsible for initiating an innate immune response against rAAV-mediated gene therapy, triggering the expression of pro-inflammatory cytokines and type I IFNs via downstream signaling pathways involving the transcription factors nuclear factor ?B (NF-κB) and interferon (IFN) regulatory factor (IRF), respectively.^77,82 (2) Following successful transduction, dsRNA can form and be detected by cytosolic RNA sensors, RIG-1 and MDA5, leading to the expression of IFN- β via downstream signaling pathways.⁷⁷ In addition to triggering the destruction of the cell, these mechanisms led to an antiviral state in the surrounding tissue and the recruitment of innate immune cells, as well as providing activation signals for an adaptive immune response.^77,78

В двух клинических испытаниях гемофилии В оптимизация кодонов трансгена привела к введению CpG-мотивов в открытую рамку считывания rAAV кандидатов генотерапии BAX 3359 и DTX101.89 В течение 3 месяцев активность FIX снизилась, что позволяет предположить, что потеря экспрессии трансгена может быть связана с распознаванием олигодезоксинуклеотидов CpG TLR9 и последующим разрушением трансдуцированных клеток.^{9,89, 90} В испытании BAX 335 в фазе I/II один участник достиг длительной экспрессии трансгена, вероятно, из-за мутации в гене рецептора интерлейкина-6 (IL-6R), что сделало его менее восприимчивым к сигналу врожденного иммунитета через IL-6.⁹ Векторы rAAV с удаленными CpG естественного происхождения продемонстрировали длительную экспрессию, без или с управляемыми ответами CTL.⁸⁶

В дополнение к роли рецепторов распознавания образов во врожденном иммунном ответе, система комплемента отвечает за распознавание молекулярных компонентов микроорганизмов через неактивные проферменты в сыворотке крови. Результирующий сигнальный каскад приводит к образованию мембранного атакующего комплекса на поверхности патогена или инфицированной патогеном клетки, отмечая патоген для удаления фагоцитами, а также приводя к лизису клеток-мишеней и высвобождению медиаторов воспаления лейкоцитами.^77,80. Эта критическая связь между врожденной и адаптивной иммунной системой служит в качестве ко-стимулирующего сигнала для увеличения величины ответа антител, а также для поддержания жизнеспособности, пролиферации и дифференцировки Т-клеток.^77,91 Хотя взаимодействие между вектором rAAV и системой комплемента до конца не изучено, считается, что в первую очередь оно происходит под действием антител (по классическому пути);⁹² однако, какие именно иммуноглобулины участвуют в этом ответе, еще не изучено. Возможно, что потенциально высокие дозы вектора rAAV и выбор капсида могут быть вовлечены в активацию комплемента. Более подробную информацию см. в недавнем обзоре Muhuri et al.⁷⁷.

Обычно считается, что система комплемента не играет существенной роли в иммунном ответе на rAAV-опосредованную генотерапию.⁷⁷ Однако активация комплемента была связана с неблагоприятными событиями в клинических испытаниях rAAV9-опосредованной генной терапии мышечной дистрофии Дюшена (МДД; NCT0336250293 и NCT0336874294), а также с иммунными механизмами, способствующими тромботической микроангиопатии после введения onasemnogene abeparvovec.⁹⁵ Профилактические ингибиторы комплемента теперь включены в протокол последнего исследования МДД для последующих пациентов.⁹⁶ Может ли система комплемента влиять на долговечность генотерапии и как именно, пока неизвестно, но поскольку система комплемента играет роль в усилении адаптивных иммунных процессов, она может оказывать долгосрочное влияние на экспрессию терапевтического трансгена.

Менее хорошо изученные механизмы врожденного иммунитета, которые, как считается, не оказывают существенного влияния на успех генотерапии, но могут сыграть непредвиденную роль в модуляции последующих долгосрочных иммунных реакций, которые могут повлиять на долговечность, включают цитозольные ДНК и РНК сенсоры.⁷⁷ ITRs в геноме rAAV обладают присущей им промоторной активностью, что позволяет производить как смысловые, так и анти-смысловые РНК, которые могут образовывать dsRNA в цитозоле.⁹⁷ Эта dsRNA может быть распознана цитозольными РНК-сенсорами (ген 1 [RIG-1], индуцируемый ретиноевой кислотой, и белок 5 [MDA-5], ассоциированный с дифференцировкой меланомы), что приводит к выработке IFN- β (рис. 4). ⁷⁷ Например, у мышей, привитых человеческими гепатоцитами и впоследствии получивших вектор AAV8, экспрессирующий человеческий FIX-Padua (R338L), экспрессия RIG-1 и MDA-5, а также IFN- β была выше на 8-й неделе по сравнению с нелеченым контролем. Более того, блокирование пути врожденного иммунитета dsRNA увеличивало экспрессию трансгена и подавляло экспрессию IFN- β в клетках, трансдуцированных AAV.⁹⁷ Этот процесс может иметь отношение к долгосрочности, поскольку производство и последующее иммунное распознавание dsRNA происходит после успешной трансдукции.^77,97.

Мышиные модели показывают, что распознавание IL-1 через IL-1Rs является критическим для ответа CD8+ Т-клеток на продукт трансгена, особенно при низких дозах. Однако при более высоких дозах другие сигнальные пути оказываются достаточными для того, чтобы вызвать иммунный ответ.⁹⁸ Роль инфламмасом, которые являются важными медиаторами иммунного ответа, вызванного IL-1, также находится в стадии дальнейшего изучения. Нокаутные мыши, по-видимому, демонстрируют реакцию, управляемую CD8+, несмотря на отсутствие механизма инфламмасомы, что позволяет предположить, что активация Т-клеток при генотерапии, направленной на печень, не зависит от инфламмасом.⁹⁹

Ранние клинические испытания rAAV-опосредованной генотерапии подчеркнули влияние адаптивного иммунного ответа на успешную передачу генов.^11,100,101 Адаптивный иммунный ответ считается второй линией защиты, способной вызывать антиген-специфический ответ, который нацелен на патогены и уничтожает их, одновременно развивая иммунологическую память для защиты от последующих инфекций (рис. 5).^79,83 Как упоминалось ранее, адаптивный иммунный ответ тесно связан с врожденным ответом, причем величина ответа, вероятно, зависит от сигналов врожденного иммунитета (рис. 3 и 4).⁷⁷



Figure 5. Mechanisms of the adaptive immune system affecting durable transgene expression

После введения вектора rAAV и успешной трансдукции трансдуцированные клетки представляют эпитопы, полученные из капсида, через MHC класса I на клеточной поверхности. Это запускает потенциальную очистку от трансдуцированных клеток CTLs и привлечение APCs, которые отвечают за представление антигенов на своей клеточной поверхности через MHC классов I и II. Это, в свою очередь, привлекает дополнительные CD8+ CTLs и CD4+ T helper cells, способствует высвобождению антител B-клетками и созданию популяции антиген-специфических Т- и B-клеток памяти.^30,77,83,102 APC - антиген-презентирующая клетка; CTL - цитотоксический T-лимфоцит; MHC - основной комплекс гистосовместимости; rAAV - рекомбинантный адено-ассоциированный вирус.

Адаптивные иммунные реакции возникают после первоначальной врожденной воспалительной реакции, что приводит к потере экспрессии трансгена примерно через 1-3 месяца после проведения генотерапии.^{11,100,101,103} IFN-γ фермент-связанное иммунопоглощающее пятно (ELISpot) и проточная цитометрия могут быть использованы для оценки присутствия специфических для капсида AAV CTL как до, так и после генной терапии, но клеточные реакции определяются реже, чем реакции антител, что, вероятно, связано с низким количеством лимфоцитов, находящихся в циркуляции.⁸³ В первом клиническом испытании генотерапии гемофилии В первый пациент из когорты с самой высокой дозой достиг терапевтического уровня экспрессии трансгена FIX, но в отличие от животных, у которых была достигнута стабильная долгосрочная экспрессия, через 4 недели наблюдался спад, сопровождавшийся транзиторным повышением печеночных трансаминаз и обнаружением капсид-специфических CTL в крови.¹⁰⁰ Аналогичные реакции Т-клеток были выявлены в клинических испытаниях при нервно-мышечных расстройствах, хотя не всегда с соответствующей потерей экспрессии.^104,105 Реакции Т-клеток, подтвержденные IFN-γ ELISpot, после введения rAAV-опосредованной генотерапии, в настоящее время наблюдаются в многочисленных клинических испытаниях и обычно успешно устраняются с помощью реактивного или профилактического введения кортикостероидов.^103,105-107 Введение кортикостероидов может негативно повлиять на созревание В- и Т-клеток.¹⁰⁸ В исследовании генотерапии дефицита липопротеиновой липазы перед введением генной терапии был начат 12-недельный курс стероидов, и хотя были получены капсид-специфические Т-клетки, они оказались лишены цитотоксических свойств.¹⁰⁹ Следует отметить, что клеточный иммунный ответ на генотерапию, опосредованную rAAV, не всегда реагирует на кортикостероиды; например, иммунный ответ на векторы, обогащенные CpG, не всегда реагирует на лечение стероидами.^9,110.

Гепатоцеллюлярное повреждение, на которое указывает повышение alanine aminotransferase (ALT) и aspartate aminotransferase (AST), также обычно хорошо поддается лечению с помощью реактивного или профилактического применения кортикостероидов. Примечательно, что повышение ALT и AST наблюдалось после генотерапии rAAV, направленной на другие ткани; например, после введения onasemnogene abeparvovec для лечения СМА¹¹¹. Исследования биораспределения показали, что при внутривенном введении векторов rAAV значительное количество векторов попадает в печень, даже если они направлены на другой орган.^112-115 Следовательно, гепатоцеллюлярное повреждение связано не только с генотерапией, направленной на печень, и следует ожидать преходящих и часто обратимых эффектов при системной генотерапии rAAV.

Хотя существует связь между дозой и реакцией Т-клеток,¹¹ существуют противоречия между повышением ALT и AST и положительной реакцией на IFN-γ ELISpot,79,83 и они не всегда коррелируют с потерей экспрессии трансгена.^116-119.

Регуляторные Т-клетки (Tregs) жизненно важны для поддержания периферической толерантности и предотвращения аутоиммунных заболеваний, но они также могут препятствовать эффективной очистке от вирусов при хронической инфекции.¹²⁰ Кроме того, при хронической инфекции Т-клетки могут проявлять истощенный фенотип, характеризующийся экспрессией программируемой клеточной гибели 1 (PD-1) и лиганда программируемой гибели 1 (PD-L1), при которой их функциональность сильно нарушена.^120,121. Было выдвинуто предположение, что эти Т-клетки образуют тонко настроенную популяцию, которая способна на определенном уровне контролировать патогены, не вызывая подавляющего иммунного ответа.¹²¹ Этот истощенный фенотип наблюдался в исследовании II фазы (NCT01054339) внутримышечного введения AAV1-опосредованной генной терапии моногенного расстройства дефицита AAT и не был связан со снижением экспрессии.¹²² Более поздние данные этого конкретного исследования поддержали гипотезу о том, что Tregs и истощенные популяции T-клеток могут модулировать ответ CTL на капсид AAV.¹²³

В клиническом испытании II фазы, в котором исследовался вектор rAAV, экспрессирующий человеческий ААТ для лечения дефицита ААТ, наблюдался ответ Т-клеток на капсид rAAV без потери экспрессии трансгена ААТ, что позволило предположить, что, возможно, был задействован механизм иммунной толерантности.¹²⁴ При дальнейшем исследовании было выявлено увеличение количества Tregs in situ, а также Т-клеток с истощенным фенотипом. Группа также выявила интактные капсиды в течение 1 года после введения, что потенциально объясняет постоянное присутствие Tregs и истощенных T-клеток в инъецированной мышце, как это можно было бы ожидать при хронической инфекции.¹²⁴ Через 5 лет у этих пациентов сохранилась экспрессия трансгена AAT и сохранились доказательства инфильтрации Tregs и истощенных CD8+ T-клеток in situ.⁴⁰ Это многообещающий результат с точки зрения долговечности генотерапии, хотя механизм, лежащий в основе этой толерантности, требует дальнейшего изучения, особенно в отношении дозы, трансгена и/или способа введения.^40,120

Почему клеточный иммунный ответ различается у разных людей и часто трудно предсказуем, является предметом дискуссий. Устоявшейся концепцией клеточного иммунитета является требование о наличии ко-стимулирующих сигналов наряду с презентацией антигена для возникновения Т-клеточного ответа¹²⁵. Однако некоторые считают, что может происходить процесс, называемый активацией стороннего наблюдателя, когда пул циркулирующих Т-клеток памяти активируется последующим неродственным вирусом, в отсутствие специфической презентации антигена для исходного вируса, посредством высвобождения цитокинов и агонистов Toll-подобных рецепторов клетками врожденной иммунной системы, что приводит к быстрому уничтожению инфицированных клеток врожденными CTL.^125,126 Это указывает на важность медиаторов врожденного иммунитета и воспаления для последующего ответа Т-клеток на капсид и трансген rAAV. Влияние этого механизма на долговечность генотерапии неизвестно.

Клеточные иммунные реакции против трансгенных белков, хотя и редко, но наблюдались в некоторых клинических испытаниях. Мутационный статус может влиять на риск иммунного ответа, учитывая, что люди с нулевыми мутациями (перекрестно-реактивный иммунологический материал [CRIM] отрицательный) с большей вероятностью распознают трансгенный белок как чужеродный и развивают более серьезные реакции антител и Т-клеток, чем люди, экспрессирующие эндогенный белок в той или иной форме.^127,128 В клинических испытаниях было показано, что дополнительные иммуносупрессивные схемы предотвращают реакцию на трансгенный белок у CRIM-отрицательных людей.^127-130

В исследовании I фазы (NCT00428935) внутримышечной доставки векторов rAAV2, несущих ген мини-дистрофина под контролем промотора CMV для лечения МДД (NCT00428935), ни у одного пациента (N = 6) не было достигнуто длительной экспрессии трансгена (по результатам измерения на 42 или 90 день), что побудило к дальнейшим исследованиям. У двух пациентов до начала генной терапии неожиданно были обнаружены спонтанно праймированные Т-клетки, при этом быстрый ответ Т-клеток наблюдался у одного из двух пациентов после переноса гена, что позволяет предположить, что хотя белок мини-дистрофин был способен вызвать Т-клетки памяти у одного из пациентов, уровень экспрессии был недостаточным, чтобы вызвать ответ у другого¹³¹.

В ходе исследования II фазы (NCT01054339) внутримышечного введения AAV1-опосредованной генотерапии при моногенном заболевании - дефиците ААТ - у одного пациента наблюдался устойчивый и стойкий ответ Т-клеток против продукта трансгена, при этом экспрессия трансгена была ниже, чем у других пациентов, получивших такую же дозу. Была выдвинута гипотеза, что это связано с наличием у этого пациента редкого аллеля человеческого лейкоцитарного антигена (HLA)-C, который эффективно представлял пептид из трансгенного белка. Кроме того, полиморфизмы в белке ААТ, экспрессируемом этим пациентом, могли привести к отсутствию толерантности к трансгену, что в сочетании с воспалительной реакцией на вектор привело к мощному Т-клеточному ответу на трансдуцированные клетки.¹²² Однако в более раннем клиническом испытании II фазы, в котором исследовался вектор rAAV, экспрессирующий человеческий ААТ, Т-клеточный ответ на один пептид ААТ был обнаружен у одного пациента, при этом не было никаких доказательств клинического эффекта (симптомы, реакция на антитела, аномальные тесты функции печени или концентрация ААТ)¹¹⁶.

В моделях NHP стойкая экспрессия наблюдалась более 6 лет, по состоянию на 2005 год, после внутримышечного введения вектора rAAV, кодирующего индуцибельный трансген эритропоэтина, и не наблюдалось никакой реакции на эритропоэтин или регуляторные белки ни в исследованиях конститутивной, ни регулируемой экспрессии генов¹³². Совсем недавно длительная экспрессия наблюдалась у NHP через 5 лет после внутривенной локальной региональной инфузии вектора rAAV2/1, кодирующего индуцибельный репортерный ген эритропоэтина, без каких-либо доказательств иммунного ответа на продукт трансгена.^133,134. Эта же группа далее проверила потенциал Т-клеточного ответа на трансгенный белок, доставив высокую дозу самокомплементарного (а не менее иммуногенного одноцепочечного) вектора rAAV8, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (GFP), посредством локальной региональной внутривенной инъекции в иммуногенной модели NHP. Несмотря на то, что группа использовала иммуногенного реципиента и продукт трансгена, была достигнута долгосрочная экспрессия трансгена. Интересно, что анализ показал гуморальный и клеточный иммунный ответ на трансгенный белок GFP, который не повлиял на уровень экспрессии.¹³³ Из этого доклинического исследования можно сделать два важных вывода: во-первых, способ введения влияет на возможность развития пагубного иммунного ответа после генотерапии, возможно, из-за повышенного риска воспалительной реакции; во-вторых, Tregs могут играть роль в регулировании ответа CTL на капсид AAV и продукт трансгена, помогая поддерживать стабильную экспрессию трансгена.¹³³.

Несмотря на то, что CTL-ответы на трансгены наблюдались у NHP после системной доставки направленной на печень генной терапии AAV, до сих пор не сообщалось об иммунных ответах против трансгенных белков в клинических испытаниях направленной на печень генной терапии,^103,106,118 что, возможно, объясняется толерантным эффектом экспрессии в этом органе.⁸³ В действительности, в моделях гемофилии A и B на собаках, подверженных антителам к FVIII или FIX, генотерапия rAAV, направленная на печень, как было показано, обладает толерантным эффектом и способностью уничтожать предсуществующие антитела против терапевтического белка (ингибиторы).^135-137.

Степень и последствия иммунного ответа на генотерапию часто трудно предсказать⁸³ и они могут варьироваться в зависимости от характеристик реципиента (например, основной мутации/приоритетного воздействия трансгенного белка или HLA-фенотипа), характеристик вектора и трансгена, включая примеси, внесенные в процессе производства, пути введения и дозы, а также популяции клеток-мишеней.^79,122

Различные капсиды AAV отличаются по иммуногенности,⁸³ причем те, которые нацелены на анти-генпрезентирующие клетки (APCs), скорее всего, активируют более мощный ответ CTL.⁸² Было показано, что небольшие различия в последовательности аминокислот могут оказывать значительное влияние на величину ответа CTL на капсид AAV.^121,138,139. Например, преобразование аминокислот RGNR в SGNT в гепарин-связывающем мотиве rAAV2 снижает ответ CTL на капсид.¹³⁹ Таким образом, выбор вектора и модификации могут влиять на продолжительность лечения.

Примеси в препаратах вектора rAAV могут влиять на иммуногенность генной терапии. Присутствие пустых капсидов увеличивает вирусную нагрузку без преимущества доставки интересующего трансгена, увеличивая количество антигенного материала и, таким образом, вероятность врожденного или адаптивного иммунного ответа, что потенциально может повлиять на продолжительность лечения.^140,141 Некоторые предполагают, что пустые капсиды могут быть использованы в качестве приманки, чтобы уменьшить влияние предсуществующих NAbs на вектор rAAV;¹⁴² однако в исследовании генотерапии гемофилии В было показано, что удаление пустых капсидов из конечного препарата не увеличило частоту иммунных ответов^.2 Также вероятно, что эта стратегия увеличит риск врожденного или клеточного адаптивного ответа, включая активацию комплемента, без каких-либо терапевтических преимуществ.¹⁴¹ Как именно пустые капсиды влияют на потенциальный иммунный ответ на генотерапию rAAV, остается предметом научных дебатов.

Для управления или предотвращения иммунного ответа на генотерапию rAAV с целью повышения уровня экспрессии и долговременной стойкости используется несколько подходов, как указано ниже.

Существует ряд иммуносупрессивных методов лечения, и фармакологические механизмы, лежащие в основе различных подходов к иммуносупрессии, подробно описаны в других источниках.¹⁴³ Мы сосредоточимся на некоторых подходах, используемых вместе с генотерапией rAAV.

Обычно используемая стратегия борьбы с Т-клеточным ответом в клинических испытаниях включает применение кортикостероидов преднизолона или преднизона, либо в ответ на повышение печеночных ферментов, либо профилактически; ^{9,89,103,105,106} однако этого не всегда достаточно для восстановления экспрессии трансгенов.^9,89 В ходе испытания I/II фазы, в котором исследовался DTX101, AAVrh10, экспрессирующий оптимизированный по кодонам ген FIX без CpG-редукции (96 CpG-мотивов в открытой рамке считывания),⁹⁰ для лечения гемофилии B, у двух пациентов, у которых повышение ALT первоначально купировалось с помощью стероидов, после окончания курса стероидов наблюдалось последующее слабое повышение ALT, что привело к потере экспрессии FIX.⁸⁹

Рассматривались другие иммунодепрессанты, кроме кортикостероидов, в том числе в испытании I фазы (NCT02362438) интратекальной доставки вектора rAAV для лечения гигантской аксональной невропатии (сиролимус и такролимус),⁸³ в испытании I фазы (NCT03369444) FLT180a, синтетического AAV-вектора, содержащего оптимизированный по кодонам ген F9, для лечения гемофилии B (такролимус),¹⁴⁴ и в испытании I/II фазы SPK-8016, rAAV-вектора, содержащего кассету экспрессии F8 с удаленным B-доменом, для лечения гемофилии A (azathioprine и tacrolimus у двух пациентов). ¹⁴⁵ Оба испытания по лечению гемофилии продолжаются, и иммуномодулирующие режимы все еще оптимизируются.^144,145.

Антигенные пептиды представлены на молекулах главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I после протеасомной деградации капсида rAAV;¹⁹ поэтому разумно предположить, что ингибиторы протеасомы могут быть использованы для блокирования ответов CTL путем предотвращения разрушения капсида и презентации антигена на MHC класса I.¹⁴⁶ Совместное введение bortezomib, клинически одобренного ингибитора протеасом, с rAAV-векторами в гепатоциты человека привело к увеличению трансдукции in vitro и дозозависимому ингибированию уничтожения CTL трансдуцированных клеток, что соответствует снижению презентации пептидов MHC на поверхности клеток. Использование ингибиторов протеасомы в клинических исследованиях еще предстоит определить.

Еще одним новым подходом к иммуносупрессии является использование синтетических наночастиц, инкапсулирующих sirolimus, которые при совместном введении с векторами rAAV ранее облученным мышам и NHP смогли подавить инфильтрацию CTL в печени и ответы Т-клеток памяти¹⁴⁷.

Рассматривались и другие иммуносупрессивные режимы, например, используемые для пациентов, перенесших трансплантацию, но они, по-видимому, связаны с увеличением количества CTL и/или снижением количества антиген-специфических CD4+ Tregs.^148,149 В исследовании NHP, получавших вливание rAAV2-человеческого (h)FIX через печеночную артерию, антител IL-2R (daclizumab) было включено как часть режима иммуносупрессии. Отмена иммунодепрессантов привела к усилению иммунного ответа у леченных животных, что позволяет предположить, что блокирование IL-2R могло предотвратить активацию CD4+/CD25+ Tregs.¹⁴⁸

Важно учитывать как тип, так и время использования иммуносупрессии для поддержания долгосрочной стойкости экспрессии, особенно после окончания режима иммуносупрессии.

Способ введения является важным фактором, определяющим степень иммунного ответа на вектор rAAV. Введение в иммунопривилегированные места, такие как ЦНС и глаз, может защитить вектор и продукт генной терапии от обнаружения иммунной системой и повысить продолжительность по сравнению с другими путями введения.^79,150 Было показано, что локальное региональное внутривенное введение уменьшает воспалительный и последующий ответ Т-клеток по сравнению с внутримышечным введением, что может повысить долговечность по сравнению с прямым введением в ткани.¹³³

Доза также является важным фактором, поскольку более высокие дозы вектора с большей вероятностью будут обнаружены иммунной системой, что приведет к потере экспрессии из-за элиминации трансдуцированных клеток, а также к возможности серьезных неблагоприятных событий, включая смерть, вероятно, из-за врожденного иммунного ответа.^83,107,151.

Существуют различные методы преобразований капсида и генома rAAV, причем некоторые подходы направлены на то, чтобы лишить вектор иммунной системы.^72,82 Например, как упоминалось ранее, не-метилированные CpG-мотивы могут распознаваться врожденной иммунной системой, а инженерия генома rAAV для удаления этих CpG-мотивов может повысить долговечность путем уклонения от экспрессии MHC II и ответов Т-клеток.⁸⁶ CpG-мотивы присутствуют как в кассете экспрессии, так и в ITRs. Иммунный ответ может быть индуцирован присутствием одного CpG-мотива.¹⁵² Поэтому удаление CpG-мотивов из ITR может еще больше снизить иммуногенность AAV. Недавний отчет об исследовании на мышах показывает, что CpG-мотивы могут быть удалены из ITRs без ущерба для биологической активности вектора.¹⁵² Альтернативная стратегия, известная как маскировка TLR9, заключается во включении коротких олигонуклеотидов ДНК (TLR9i) в геном вектора для противодействия активации TLR9, потенциально конкурируя с CpG-мотивами.¹⁵³

Другим вариантом является использование цис-действующих регуляторных элементов в трансгене rAAV для настройки тканевой специфичности и уровня экспрессии трансгена.¹⁵⁴ Промоторы являются основным цис-элементом, который может быть использован для нацеливания на иммунопривилегированные участки, такие как ЦНС, или толерогенные ткани, такие как печень, что может предотвратить обнаружение иммунной системой или вызвать иммунную толерантность, соответственно, и может привести к улучшению долговечности по сравнению с другими тканями.^{13,79,83,154,155}. Например, AAV1- и AAV8-опосредованная доставка трансгена иммуноглобулина G1 привела к реакции антител у макак-резусов, получавших векторы rAAV под контролем промоторов, специфичных для мышц, но не для печени¹⁵⁶.

Оптимизация промотора также может быть использована для снижения необходимой дозы вектора и, следовательно, вирусной нагрузки. Например, использование сильного усиливающего элемента перед тканеспецифическим промотором может обеспечить сильную экспрессию трансгена в нужной ткани.^{100,154,157,158} Совсем недавно in silico инженерия специфического для мышц промотора Sk-CRM4/Des в самокомплементарном векторе AAV9 привела к 173-кратному увеличению экспрессии трансгена люциферазы у мышей по сравнению с промотором CMV, без признаков апоптоза или инфильтрации Т-клеток.¹⁵⁹. Также можно использовать конструкции с высокой экспрессией или высокой специфической активностью для увеличения экспрессии при меньших дозах; например, встречающийся в природе вариант FIX-Padua с высокой специфической активностью широко используется в генотерапии гемофилии В.^106,160.

Кроме того, элементы микро (mi)РНК могут быть использованы для de-target экспрессии в определенных типах клеток, таких как APCs, что может быть полезно для предотвращения адаптивных иммунных ответов.^82,161,162 Этот подход был впервые продемонстрирован на лентивирусных векторах, содержащих целевые последовательности для miR-142-3p, которые обеспечивали экспрессию трансгена в не-гемопоэтических клетках и подавление экспрессии во внутрисосудистых и внесосудистых кроветворных линиях у мышей.¹⁶¹. Затем сайты связывания miR-142 (BSs) были добавлены к векторам rAAV для подавления ко-стимулирующих сигналов в дендритных клетках, что значительно ослабило ответ CTL против трансгена и устранение трансдуцированных клеток, и, таким образом, обеспечило устойчивую экспрессию высоко иммуногенного трансгенного белка овальбумина (OVA) в скелетных миобластах у мышей¹⁶². Впоследствии было показано, что комбинация miR-142BS и miR652-5pBS дополнительно блокирует активацию Т-клеток и высвобождение антител против трансгена OVA, подавляя активацию Т-хелперов (Th) 1 и Th17 клеток более эффективно, чем только miR-142BS.¹⁵³ В настоящее время существует несколько миРНК-регулируемых векторов AAV, исследуемых для генной терапии, особенно для предотвращения экспрессии в сердце (miR-1), или печени и/или скелетных мышцах (miR-122).^163,164.

В качестве альтернативы, имитация стратегии, используемой вирусами - экспрессия небольших белков, препятствующих презентации антигена (VIPRs) - может помочь вектору rAAV уклониться от иммунного обнаружения.¹⁶⁵ Например, в мышиных моделях введение векторов AAV, содержащих трансгены белков AAT/OVA или мини-дистрофина, слитых с VIPR ICP47, приводило к ингибированию антиген-специфических ответов CTL против капсида по сравнению с контролем без VIPR, причем для векторов AAV-AAT/OVA была достигнута стабильная экспрессия трансгенов¹⁶⁵.

Другой исследуемый метод использует мощный иммуносупрессивный механизм, специфичный для трансгена, экспрессируемого в глазу, известный как субретинально-ассоциированное иммунное ингибирование.¹⁶⁶ Он включает в себя введение пептидов из продукта трансгена в субретинальное пространство, чтобы вызвать системную антиген-специфическую иммуносупрессию.¹⁶⁶ У мышей совместное введение пептида антигена самца HY с вектором AAV8, содержащим трансген HY, подавляло как CD8+ CTL, так и CD4+ T-клеточные специфические первичные ответы и ответы клеток памяти против HY по сравнению с введением вектора AAV8-HY без пептида.^167,168.

Основываясь на наблюдаемом толерогенном профиле печени и роли Tregs в иммунном гомеостазе, некоторые группы исследуют возможность получения толерантности людей к вектору rAAV.^83,169-171 Один из подходов заключается в воздействии на чужеродный антиген, при этом используется сиролимус для вызывания анергии или удаления Т-клеток, а также ингибирования стимуляции дендритных клеток и механической мишени рапамицин-независимой сигнализации Treg, что приводит к образованию пула антиген-специфических CD4+CD25+FoxP+ Tregs.^169,170. В мышиной модели гемофилии B (с целевой делецией F9) 1-месячный протокол, включающий многократное введение IL-10, сиролимуса и специфического пептида hFIX перед внутримышечным введением AAV1-CMV-hFIX, привел к удалению эффекторных Т-клеток и индукции Tregs, что привело к низкому или не-обнаружимому уровню антител к hFIX (ингибиторов) и более высокой экспрессии hFIX по сравнению с не-толерантными мышами¹⁷¹. Далее группа показала, что сочетание сиролимуса, FMS-подобного лиганда тирозинкиназы 3 и антигена FVIII у мышей с гемофилией А привело к снижению титра ингибиторов по сравнению с не-леченными мышами после еженедельного внутривенного введения FVIII. Они также показали, что сиролимус был необходим для индукции толерантности.¹⁷⁰ Другой подход к толерантности заключается в пероральном введении антигенов. Например, профилактическое пероральное введение высокоиммуногенного белка OVA перед внутримышечным введением AAV-OVA смогло предотвратить образование антител и реакцию CTL на продукт трансгена, что привело к улучшению долгосрочной персистенции и экспрессии трансгена¹⁷².

В другом исследовании, используя преимущества фетальной иммунной системы, внутривенное введение AAV-rh10 OVA-2A-GFP новорожденному NHP с последующим введением AAV9 OVA-2A-GFP в 4 месяца привело к устойчивой экспрессии трансгена в течение более 1 года, демонстрируя, что оперативная толерантность к закодированным трансгеном белкам возможна у NHP с иммунной системой, развитой при рождении так же, как у новорожденного человека¹⁷³. Аналогичным образом, в исследовании NHP, изучавшем генотерапию rAAV9 при мукополисахаридозе типа I, животные, толерантные при рождении к вектору AAV8, экспрессирующему человеческую α-1-идуронидазу (IDUA), сохраняли экспрессию трансгена в спинномозговой жидкости (CSF) по сравнению с нетолерантными животными, у которых антитела привели к потере уровня IDUA в CSF.¹⁷⁴ Можно ли применять эти стратегии толерантности для улучшения долговечности генной терапии у людей, еще предстоит выяснить.

Остается много неизвестных вопросов о долговечности генотерапии rAAV, и невозможно сделать твердые выводы, пока не пройдет достаточно времени с достаточно большой когортой пациентов для каждого из предложенных применений. Хотя полученные данные многообещающие: в различных исследованиях сообщалось о стойких ответах до 10 лет после введения препарата,^2,3 еще предстоит выяснить, как это проявится в реальном мире в долгосрочной перспективе.

Хотя мы сосредоточились здесь на биологии векторов rAAV, существует ряд соображений, касающихся образа жизни и других факторов пациента, которые также могут повлиять на долговечность. Например, чрезмерное употребление алкоголя после генной терапии, направленной на печень, может привести к уничтожению большого количества трансдуцированных гепатоцитов после терапии, направленной на печень. В некоторых исследованиях пациенты должны воздерживаться от алкоголя в течение 1 года после инфузии.¹⁷⁵ Пациенты, которые живут в течение многих десятилетий после генной терапии, будут подвержены такому же риску заболеваний старения, как и население в целом, и потенциальное влияние этих заболеваний на долгосрочную экспрессию трансгенов еще предстоит изучить.

В целом, терапия на основе rAAV, скорее всего, будет представлена на одобрение регулирующих органов до того, как будет продемонстрирована полная долговечность. В отсутствие данных о долгосрочной долговечности, полученных в ходе клинических испытаний, одним из вариантов, который можно изучить, является моделирование данных. Рекомендуя voretigene neparvovec, британский NICE рассмотрел смоделированные данные о долговечности, предоставленные производителем, и пришел к выводу, что расчетное значение долговечности в 40 лет является "неопределенным, но разумным "⁷.

Кроме того, после одобрения препарата регулятором важно дополнить данные клинических исследований реальными фактами. Для сбора долгосрочных данных о долговечности, реальной эффективности, а также безопасности генотерапии rAAV необходимо создать реестры, которые собирают согласованные данные о пациентах, получивших генотерапию. Все заинтересованные стороны, включая группы пациентов, врачей, исследователей, политиков, плательщиков и промышленность, должны работать вместе для решения оставшихся неизвестных проблем.