Гемофилия А (HA) - это моногенное заболевание, вызванное мутацией гена коагулянтного фактора 8 (F8), расположенного на хромосоме X.¹ По оценкам Всемирной федерации гемофилии (WFH), насчитывается 1 125 000 больных гемофилией мужчин. На долю НА приходится 80-85% всех случаев гемофилии.² Тяжесть клинических проявлений параллельна уровню биоактивного F8.³ Больные гемофилией определяются как имеющие уровень F8 ниже 40 IU dL^-12. Пациенты с тяжелым состоянием (F8 ниже 1 IU dL^-1) испытывают симптомы рецидивирующих и спонтанных кровотечений, особенно внутренних кровотечений в суставы, мышцы или внутренние органы, что представляет собой огромную проблему для долгосрочного лечения.² В настоящее время лечение в основном заключается в регулярном внутривенном введении рекомбинантного F8.² Однако эти подходы имеют неизбежные недостатки, включая высокие затраты и повышенный риск развития антител, а также последующие побочные эффекты, связанные с иммунитетом, из-за необходимости повторного введения. Генотерапия считается единственным средством лечения гемофилии. Генотерапия на основе AAV достигла значительного прогресса в клинических испытаниях.^4,5 Однако из-за неинтеграционной природы AAV первое поколение испытаний генотерапии гемофилии было ограничено взрослыми пациентами, а со временем клиническая польза лечения уменьшалась.⁶ Появление технологии редактирования генов CRISPR предложило новую стратегию лечения HA.

Недавно технология CRISPR-Cas9 всколыхнула область генотерапии и редактирования генов благодаря своему удобству и доступности. Эта система, созданная на основе бактерий, основана на связывании single-guide RNA (sgRNA) с целевым участком ДНК, прилегающим к последовательности protospacer adjacent motif (PAM), после чего нуклеаза Cas9 вызывает двухцепочечный разрыв в ДНК на 3-4 нуклеотида выше последовательности PAM⁷. В большинстве случаев двухцепочечные разрывы могут быть восстановлены либо с помощью более мутагенного негомологичного соединения концов (NHEJ), что может привести к нарушению работы генов, либо с помощью менее частой, но высокоточной гомологичной направленной репарации, приводящей к вставке генов. Эти методы использовались для лечения мышечной дистрофии Дюшена,⁸ наследственной тирозинемии типа 1,⁹ и различных типов гемофилии.^10-12.

Учитывая моногенную причину, точные биохимические показатели и клинические проявления, гемофилия А является идеальной моделью заболевания для гено-редактирующей терапии. Тем не менее, длина белка F8 составляет 2 332 аминокислоты,¹³ что создает гораздо большую проблему для эффективной доставки, чем ген F9 в моделях гемофилии B. В связи с этим исследователи обнаружили, что удаленный домен B F8 (BDDF8) или F8-SQ также является функциональным. Таким образом, BDDF8, размер которого составляет 1 457 аа, широко используется в генной терапии НА.¹⁴

Эффективная доставка трансгена является еще одной проблемой при разработке генотерапии. AAV является наиболее популярным вектором доставки в клинической генотерапии. Однако AAV менее доступен, поскольку для его производства требуются значительные ресурсы. Для сравнения, гидродинамическая инъекция плазмид в хвостовую вену может быть проведена с большой легкостью. Этот подход до сих пор используется в качестве эффективного метода доставки голых ДНК грызунам in vivo для поиска новых методов лечения или создания мышиных моделей,¹⁵ с наибольшей эффективностью в тканях печени.¹⁶ Теоретически, высокообъемное введение bolus (большой объем) (объем разовой дозы ~10% массы тела) быстро увеличивает гидростатическое давление в кровеносных сосудах, непосредственно связанных с нижней полой веной мышей. Высокое давление создает временные поры в эндотелии печеночных синусоидов и расширяет синусоидальные отверстия, позволяя плазмидным векторам проникнуть в гепатоциты.^16,17.

Ранее мы продемонстрировали основанный на CRISPR-Cas9 подход введения BDDF8 в локус альбумина (Alb) посредством гидродинамической инъекции редактирующих плазмид для лечения мышей с НА.¹² Отредактированные мыши показали высокий уровень экспрессии F8 в первую неделю после лечения, за которым последовало резкое снижение активности F8 в последующие пару недель из-за трансген-специфического гуморального иммунного ответа. Это явление неоднократно отмечалось в других методах генотерапии, связанных с эктопической экспрессией генов,^18-21 представляя собой барьер для генотерапии.

Гидродинамическая инъекция использовалась в более чем 2000 исследований,²² но ее влияние на повреждение тканей и последующую иммунную реакцию не было полностью охарактеризовано.²² Мы попытались изучить этот вопрос с помощью анализа цитокинового массива для одновременного измерения относительных уровней экспрессии 40 мышиных цитокинов, участвующих в иммунитете и воспалении, что позволяет получить массу информации для руководства стратегиями иммунной модуляции. Более того, антигенная презентация трансгена кроветворными клетками вызывает клеточный иммунный ответ, который может быть подавлен путем включения целевой последовательности miR-142-3p, микроРНК, специфичной для кроветворных клеток.²³ Эта стратегия была успешно использована для обхода экспрессии F9 в кроветворных клетках, обеспечивая устойчивую экспрессию трансгена после введения лентивирусных векторов.²⁴ Поэтому нам интересно было оценить, работает ли эта стратегия в нашей системе. Более того, до сих пор остается неясным, можно ли использовать большое количество иммунодепрессантов, разработанных за последние десятилетия, для предотвращения иммунного отторжения трансгенов, связанного с гидродинамической инъекцией.

В данном исследовании мы выявили дюжину цитокинов, уровень которых в печени значительно повышался после гидродинамической инъекции, что могло вызвать мощный иммунный ответ на трансгены. В попытке сдержать иммунную реакцию, мы ввели 10 иммуномодулирующих факторов, но не обнаружили впечатляющего эффекта. Кроме того, хотя miR-142-3pT снижал цитолитический ответ против Cas9, мы не наблюдали заметного влияния на поддержание уровня F8. Поразительно, но мы обнаружили, что временное введение циклофосфамида (CTX) эффективно контролирует уровень F8. Эти результаты имеют важное значение для исследований на основе гидродинамических инъекций.

Все векторы были получены с помощью наборов EndoFree MaxiPrep Kit (Qiagen) или ZymoPURE II Plasmid Maxiprep Kit (Zymo Research). Чтобы убедиться в отсутствии значительного загрязнения эндотоксинами, мы проверили уровень эндотоксинов в полученных плазмидах с помощью реагента Lyophilized amebocyte lysate LAL/TAL (Xiamen Bioendo Technology). Для BDDF8 knockin использовали 5 мкг sgAlb, 5 мкг SpCas9 и 10 мкг плазмиды BDDF8 донора с двойным разрезом.²⁵ Для изучения влияния иммуномодулирующих факторов мы вводили 5 мкг плазмид с избыточной экспрессией трансгена. Для гидродинамической хвостовой инъекции плазмиды разводили до объема 10% от массы тела мыши с помощью раствора Рингера (China Otsuka Pharmaceutica) и вводили через хвостовую вену мыши в течение 5-6 с. Для предотвращения чрезмерного кровотечения каждой мыши вводили 0,5 IU белка F8 (Xyntha; Wyeth Pharmaceuticals).

В данном исследовании для лечения гемофилии А в хорошо изученной мышиной модели использовались плазмиды для редактирования CRISPR-BDDF8. Терапевтический уровень F8 был достигнут в первую неделю после гидродинамической инъекции, но затем последовало резкое снижение до исходного уровня. Мы наблюдали вовлечение как врожденных, так и адаптивных иммунных реакций, среди которых гуморальный ответ против F8 является наиболее преобладающей и постоянной причиной устойчивой потери активности F8. Преходящее повреждение печени наблюдалось в первые 24 часа после инъекции и сопровождалось преимущественным повышением уровня различных воспалительных цитокинов. Мы продемонстрировали, что CTX отдельно или в комбинации с DEX или RA приводит к устойчивому и постоянному снижению активности F8 в течение 1 года у мышей с гемофилией А. Эти результаты также позволяют понять причину низкой эффективности редактирования генов при использовании плазмидных векторов в генотерапии на основе CRISPR-Cas9.

Генотерапия гемофилии убедительно продемонстрировала значительное повышение уровня белка F8, который предотвращает кровотечение в клинических условиях.^59-63 Однако точная продолжительность такого терапевтического эффекта в ходе прогрессирования заболевания остается неясной. В данном исследовании была использована простая и мощная платформа редактирования генов CRISPR-Cas9 для опосредованной интеграции гена BBDF8 в локус Alb у мышей с гемофилией A. Нокаут трансгенов происходит преимущественно по механизму NHEJ в контексте гепатоцитов, как мы сообщали ранее¹² , а экспрессия обеспечивается промотором Alb¹².

Гидродинамическая доставка олой ДНК считается безопасной и эффективной для редактирования генов in vivo.^64,65 Однако инъекция под высоким давлением влияет на морфологию и функцию печени, вызывает иммунную активацию и повреждение органа.^28,66 Используя цитокиновый массив мыши для обнаружения 40 цитокинов, мы наблюдали всплеск уровня нескольких цитокинов в печени вскоре после воздействия, который вернулся к норме в течение 24 часов. Это динамическое изменение отражает подъем врожденного иммунитета после травматической инъекции,^67-70 который затем активирует адаптивный иммунитет. Когда плазмидные ДНК вводятся в клетки, они распознаются как чужеродные элементы, вызывая провоспалительный ответ cGAS-STING-IRF3.^71-73 Активация этого пути запускает выработку цитокинов интерферона I типа (IFN-I). Таким образом, мы наблюдали почти 40-кратное увеличение IFN.

Наиболее значительное повышение (в 70 раз) после инъекции наблюдалось в отношении IL-13, синтезируемого клетками Th2 и имеющего решающее значение для развития опосредованного Т-клетками гуморального иммунного ответа.⁷⁴ Для сравнения, Miao и др. сообщили, что наиболее значительное повышение наблюдалось в отношении IL-10, затем IL-2 и IFN-γ.¹⁹ Учитывая отсутствие клеточной иммунной реакции против эктопического белка F8, мы предполагаем, что иммунный ответ против трансгена регулируется преимущественно клетками B и Th2. Это предположение частично согласуется с результатами предыдущего исследования, показавшего, что трансген-специфические антитела вырабатываются в основном в ответ на Th2-опосредованную клеточную трансдукцию у мышей с НА.¹⁹

IL-6 играет решающую роль в индукции острой фазы синтеза белка и в одновременном ингибировании выработки альбумина, который быстро вырабатывается в ответ на инфекцию и повреждения тканей.⁷⁵ Соответственно, мы наблюдали поразительный подъем уровня IL-6 после травматической инъекции. Аналогично, сывороточные IFN-γ и IL-6 достигали пика на 1-й день после гидродинамической передачи генов.⁷⁶

Одним из значительных препятствий для генотерапии является иммунный ответ против векторов доставки и терапевтических генных продуктов.^77-79 Наша система подтвердила, что экспрессия белка Cas9 Streptococcus pyogenes (SpCas9) и белка F8 в организме мышей вызывает клеточный и гуморальный иммунные ответы, соответственно, что ставит под угрозу эффективность генотерапии. Кроме того, для оценки эффективности генного редактирования мы определяли клеточный иммунный ответ на тандемный димер Tomato (tdTomato), одновременно экспрессируемый маркерный ген. Предыдущие исследования показали, что белок GFP может вызывать иммунный ответ Т-клеток против GFP+ клеток.^80,81 Продолжая исследование этого открытия, мы определили tdTomato как источник иммунного ответа. Этот результат поможет выбрать подходящие маркерные гены в доклинических исследованиях.

К настоящему времени мы изучили основные причины снижения активности F8 в нашей системе лечения. Гидродинамическое повреждение печени и трансфекция плазмид могли вызвать врожденный иммунный ответ, что привело к высвобождению различных цитокинов в течение 24 часов, таких как IFN-I, IFN-γ, IL-2, IL-6, активируя адаптивный иммунный ответ. Более того, экспрессия чужеродных белков SpCas9, tdTomato и F8 вызывала клеточный и гуморальный иммунный ответ, выявленный с помощью ELISPOT и ELISA (или анализа на ингибитор F8). Эти результаты подчеркивают важность управления иммунным ответом при CRISPR-опосредованной генотерапии.

Чтобы добиться надежного и длительного терапевтического эффекта, мы применили ряд стратегий для противодействия иммунному ответу. Во-первых, мы обнаружили, что одновременная поставка плазмид, экспрессирующих способствующий заживлению или иммуносупрессивный фактор, не оказывает впечатляющего воздействия на повышение терапевтической эффективности. Во-вторых, чтобы избежать иммунного ответа против белка Cas9, мы включили в Cas9-экспрессирующий вектор с последовательностью miR-142^82-84, направленную на кроветворные клетки, чтобы предотвратить экспрессию Cas9 в антиген-презентирующих клетках. В результате клеточный ответ на белок Cas9 был подавлен, но снижение активности F8 осталось неизменным. Наконец, мы обнаружили, что CTX способен поддерживать активность F8. Miao и др. предприняли аналогичную попытку предотвратить сильный гуморальный ответ после доставки плазмиды pBS-HCRHPI-hFVIIIA. Используя иммунодепрессанты RAP, MMF, CSA+MMF, RAP+MMF и антитела MR1 с мышиным Ctla4Ig или без него, им удалось поддержать экспрессию F8 при не определяемом уровне анти-HF8 антител.¹⁹ Наши результаты добавляют новое оружие в арсенал борьбы с иммунной реакцией после инъекции под давлением. Этот результат также может иметь значение в клинических условиях, поскольку иммунный ответ, вызванный трансгеном, не зависит от вида.³⁸

Данное исследование имеет ограничения. Гидродинамическая инъекция плазмид вредна для пациентов, что препятствует ее клиническому переводу. В будущих клинических испытаниях для доставки компонентов редактирования будут использоваться AAV или наночастицы.

Подводя итог, мы наблюдали массивное увеличение воспалительных факторов после вызванного гидродинамической инъекцией повреждения печени, что вызвало иммунные реакции против трансгенов. Однако введение CTX в течение короткого периода преодолевает этот негативный эффект. Эта стратегия может быть использована в других ситуациях, связанных с гидродинамической инъекцией плазмид или других агентов.