Основной целью генотерапии является редактирование и исправление генетической мутации в контексте хромосомы человека. Хотя основополагающая работа началась много лет назад¹ , прорывная технология CRISPR-Cas усилила оптимизм в отношении того, что генетическое исправление точечных мутаций может наконец стать клинической реальностью. Прямая терапевтическая перспектива прямой генной репарации заключается в устранении генетических нарушений, вызванных точечными мутациями, таких как серповидно-клеточная болезнь (SCD). Хотя "хирургическая" форма генной репарации, несомненно, является прямым путем к лечению и излечению, текущий ландшафт научной работы в этой области в отношении точной генной коррекции остается неясным и полным значительных препятствий. Наиболее заметная проблема связана с разнообразием генетических результатов, которые были получены в результате сложных попыток исправить мутацию одного основания с помощью редактирования генов на основе CRISPR. Наши работы^2-4 и других авторов^5-7 показали, что хотя успешное исправление точечных мутаций может быть достигнуто, оно почти всегда связано со значительным количеством неточного редактирования, особенно в целевых сайтах, для которых был разработан комплекс CRISPR-Cas, т.е. мутагенез на месте.

Наша лаборатория ранее работала над исследованием точной коррекции точечной мутации одного основания, ответственной за SCD, с использованием комплекса рибонуклеопротеина (RNP) CRISPR-Cas9 и одноцепочечного олигонуклеотидного (ssODN) донорского репаративного шаблона². Мы были среди многих лабораторий, которые проанализировали эффективность редактирования генов в локусе бета-глобина в соматических клетках и четко продемонстрировали преобразование одного основания в целевом сайте. В то время как наблюдалось успешное исправление мутаций одного основания, непреднамеренные изменения на сайте были также обнаружены с тревожно высокой частотой. Мы также подтвердили первоначальные наблюдения других лабораторий о преобладании нежелательных генетических изменений после редактирования генов с помощью CRISPR-Cas в CD34+-клетках^4,8,9.

Для решения этих проблем многие лаборатории сосредоточены на повышении точности и активности системы CRISPR-Cas путем генетической перестройки белка Cas^10-13 или изучения возможности изменения химического состава и молекулярных особенностей шаблонов для репарации ДНК^14-6. Значительное повышение эффективности и точности еще не достигнуто, что отчасти может объяснить, почему многие клинические испытания не направлены на исправление точечных мутаций в контексте хромосомы. Для SCD становятся распространенными разумные обходные стратегии реактивации экспрессии фетального гемоглобина (HbF) для противодействия последствиям этого заболевания^17-19. Инновационный подход, применяемый для лечения наследственного транстиретинового амилоидоза (hATTR), позволяет избежать коррекции, а скорее направлен на отключение экспрессии генов, чтобы у пациентов полностью прекратилась выработка дефектного белка²⁰. Аналогичная стратегия используется для CRISPR-направленного редактирования генов солидных опухолей²¹. Исследовательские группы также использовали подход ex vivo для лечения некоторых видов рака, собирая Т-клетки пациента и нацеливая их на CRISPR-Cas перед повторным введением отредактированной популяции обратно в организм пациента²².

Наша лаборатория использовала другую стратегию для понимания репарации точечных мутаций, сосредоточившись на разработке моделей для изучения и понимания биохимических и молекулярных факторов, влияющих на точное и неточное редактирование генов. Ранее мы создали несколько основополагающих модельных систем реакции редактирования генов для изучения и выяснения молекулярных механизмов и регуляторных схем, которые окружают CRISPR-направленное редактирование генов в клетках млекопитающих. Мы сообщили о создании бесклеточной системы и успешно воспроизвели группу реакций CRISPR-направленного редактирования генов, включая вставку ДНК, замену сегмента гена и сайт-специфическую делецию^23,-25. В значительной степени эта система поддерживает микросреду, в которой свободно функционируют как негомологичное соединение концов (NHEJ), так и пути гомологичной направленной репарации (HDR), что позволяет методично манипулировать отдельными компонентами реакции. Эти модельные реакции позволили нам определить доминирующий путь (пути), регулирующий активность CRISPR, сравнить активность редактирования генов между различными Cas белками, измерить gRNA гетерологичной толерантности для потенциального вне-целевого разреза, определить оптимальную структуру и характеристики донорских шаблонов, которые могут помочь направить репарацию ДНК, и выяснить факторы, влияющие на баланс между NHEJ и HDR^23-27. Эти открытия помогли внести ясность в механику реакции и направить стратегии, разработанные для повышения точности редактирования генов.

В настоящее время широко известно, что при существующем наборе инструментов редактирования генов генетический результат исправления точечных мутаций в соматических или клетках предшественниках все еще далек от точности. Неточное редактирование оставляет генетический след, который в конечном итоге может привести к изменениям в экспрессии генов и негативно повлиять на клеточный метаболизм и/или рост. Было заявлено, что коррекция точечной мутации SCD считается клинически значимой, если эффективность коррекции составляет не менее 20%²⁸, поэтому, хотя эффективность исправления точечных мутаций не обязательно должна быть невероятно высокой, она должна быть точной. Таким образом, необходимо разработать и использовать трансляционную модельную систему для оценки регуляторных факторов и подходов к повышению точности таких реакций. Здесь мы используем редукционистский подход и расширяем полезность системы бесклеточного экстракта, создавая модель для биохимического, методического молекулярного анализа Homology Directed Correction (HDC), репарации точечных мутаций и создавая новый инструмент для идентификации важных регуляторных факторов, контролирующих эффективность и точность репарации точечных мутаций.



Figure 1 Homology Directed Integration (HDI) and Homology Directed Correction (HDC) reactions. Illustrations show the HDR integration template-directed HDI reaction used to generated NotI-MT plasmids (left) and HDR correction template-directed HDC reaction used for point mutation repair of NotI-MT plasmids (right).



Figure 7 NGS analysis of HDC repair outcomes. DNA recovered after HDC reactions were sequenced via NGS to examine repair profiles of 3?NotI-MT (top) and 5?NotI-MT (bottom) at the (a) 1228 and (b) 1364 target sites. For each profile, a reference WT sequence of each NotI-MT plasmid is shown in alignment with the individual repair outcomes beneath. The predicted Cas12a cleavage site is shown as a vertical dashed line. The frequency at which each unique indel event was detected is shown to the right as a percentage of the total reads for each NGS reaction. Modifications are shown in bold, insertions within red boxes and deletions with dashed horizontal lines. NGS analysis was done using CRISPResso2 (see "Materials and Methods").

Эволюция редактирования генов CRISPR-Cas дала исследователям новый инструмент, с помощью которого можно отключать неправильно функционирующие гены или исправлять мутации одного основания, ответственные за болезни человека. Простота конструкции в сочетании с высокой эффективностью может обеспечить широкий спектр терапевтического применения^29-31. Хотя значительные успехи в области редактирования генов продолжают накапливаться, в основном эти положительные результаты связаны с направленным нокаутом генов или внедрением экзогенных фрагментов ДНК в определенные целевые участки. Тем не менее, эффективное и точное исправление одиночных ошибок оснований, исправляемых CRISPR-Cas, остается труднодостижимым, и даже когда исправление достигается, оно часто сопровождается неточностью, которая препятствует клинической разработке.

В данной работе мы расширяем фундаментальные возможности бесклеточной системы, которая уже позволила нам выяснить детали механизма действия направленной делеции, замены генов и вставки фрагментов^23-27. Эта система помогла разработать оптимальные донорные шаблоны для катализа HDR и выяснить условия реакции, способствующие точному и эффективному редактированию генов в заданной мишени. Теперь мы сосредоточили свое внимание на системе и стратегии, направленной на исправление точечных мутаций, разработав модель гомологичной направленной коррекции (HDC). Чтобы создать надежную систему, мы использовали реакцию гомологической направленной интеграции (HDI)²⁵ для создания селективных мутантных плазмид, содержащих мутированные сайты фермента рестрикции NotI в области гена lacZ плазмиды pHSG299. Каждая плазмида NotI-MT, названная 3'NotI-MT и 5'NotI-MT, в двух местах вдоль гена lacZ, названных 1228 и 1364, содержала несоответствие одного основания истинному сайту фермента рестрикции NotI на 3' и 5' конце сайта расщепления Cas12a.

В сайте 1364 заметное смещение в сторону точного исправления одиночных оснований наблюдается, когда целевая мутация располагается на 3' конце ступенчатого разреза, в отличие от 5' конца (см. рис. 2). Анализ отдельных клонов с помощью секвенирования Сэнгера (Sanger) (рис. 6a, b) показал, что точное исправление одиночных оснований в сайте 1364 произошло в 59,2% (29 из 49) и 36,7% (18 из 49) клонов 3'NotI-MT и 5'NotI-MT, соответственно. В сайте 1228 исправленные 3' и 5' клоны не показали смещения в общей эффективности исправления или различных профилей репарации, при этом 14,3% (7 из 49) и 13,7% (7 из 51) клонов показали точное исправление одного основания для 3'NotI-MT и 5'NotI-MT, соответственно. Более высокое число положительных по перевариванию NotI клонов, выявленных при первоначальном скрининге колоний для коррекции 3'NotI-MT, коррелирует с более высоким числом точных коррекций для реакции 3' на сайте 1364, выявленных при секвенировании Sanger. Когда мы расширили наш анализ на месте с помощью секвенирования NGS, результаты реакций HDC, включая точные исправления, indels и неизмененные события, повторили наблюдения, зафиксированные в первоначальном, менее масштабном считывании результатов секвенирования Sanger. Отклонение между коррекцией 3' и 5' в сайте 1364, но не в сайте 1228, а также заметное увеличение эффективности коррекции в целом в сайте 1364 по сравнению с сайтом 1228 позволяют предположить, что влияние, определяющее точную коррекцию, не обязательно связано с одним из факторов.

Функциональные связи между путями репарации повреждений ДНК и соответствующими процессами репарации, несомненно, сложны, и на них могут одновременно влиять многие факторы. Нарушенные участки хромосом, предназначенные для репарации, служат субстратами для различных видов репараций, которые могут действовать конкурентно, но на них может влиять наличие шаблонов для репарации, их дизайн и/или среда, в которой происходит репарация. Хотя считается, что направленное изменение генов посредством репарации ssODN осуществляется в основном через HDR и nucleotide excision repair (NER), base excision repair (BER), microhomology mediated end joining (MMEJ) and SSA (single-stranded annealing (одноцепочечный отжиг)) также могут вносить свой вклад^32-34. Эффективность исправления точечных мутаций в системе HDC ниже, чем эффективность, которую мы ранее наблюдали для результатов исправления в других бесклеточных реакциях, таких как инсерции²³, замены сегментов генов²⁴ и реакции HDI²⁵, что важно для корреляции с исследованиями in vivo по исправлению точечных мутаций, которые также демонстрируют более низкие показатели эффективности исправления^1,32,35. Другими словами, описанная здесь система HDC может предсказывать активность in vivo, что еще больше усиливает корреляцию между результатами бесклеточного in vitro и in vivo редактирования генов. Эти исследования создают фундаментальную модель для разработки более точных и эффективных инструментов и дают представление о факторах, которые могут преодолеть низкий уровень и неточность репарации точечных мутаций, катализируемой CRISPR-Cas.