Более половины генов человека экспрессируются в нервной системе [1]. Возможно, именно по этой причине генетические заболевания человека часто проявляются неврологическими проблемами. Исследовано множество нейродегенеративных заболеваний, и одной из наиболее распространенных причин являются дефекты в структуре генов. Как правило, гены, влияющие на большинство двигательных расстройств, гетерогенны. В результате один успех в генетическом исследовании трудно применить к другому расстройству, несмотря на тщательную разработку новых лекарств.

Однако болезнь Хантингтона (HD) - хорошо известное заболевание, которое может стать идеальной моделью, поскольку это аутосомно-доминантное прогрессирующее нейродегенеративное двигательное расстройство с единственной генетической мишенью. Дефект проявляется в экспансии тринуклеотидного повтора (CAG) гена IT15, что приводит к образованию полиглутаминовой нити на N-конце. Согласно центральной догме генетический код ДНК определяет РНК, которая транскрибируется в дополнение к ДНК; затем эта РНК транслируется в белок, выполняющий определенную функцию в клетках. CAG-повторы, присутствующие в гене, приводят к тому, что транслируемый белок Huntingtin (Htt) содержит повторяющиеся участки глутамина, которые делают его склонным к неправильной укладке и в конечном итоге вызывают агрегацию белка [2,3], который затем теряет свою первоначальную функцию. Этот мутантный белок вызывает такие клинические симптомы, как хорея, дистония, нарушения координации, снижение когнитивных способностей и поведенческие трудности.

Клеточные функции Htt до конца не изучены. Htt перемещается в ядро, но обычно он активен в цитоплазме, играет роль в транспорте везикул и может регулировать экспрессию генов. Когда в белке Htt возникает аномальная конформация, он приобретает токсические функции, которые влияют на центральную нервную систему (ЦНС), непосредственно вызывая массовую гибель нейронов стриатума в головном мозге. Может произойти потеря до 95% γ-aminobutyric acid- releasing (GABAergic) средней величины шипов на проекционных нейронах, с выборочным щажением некоторых крупных промежуточных нейронов, которые проецируются на globus pallidus и substantia nigra [3].

Благодаря техническому прогрессу, перенос генов был опробован для лечения нескольких нейрогенетических заболеваний, и теперь генотерапия, такая как анти-смысловые олигонуклеотиды (ASOs) для лечения спинальной мышечной атрофии, уже одобрена Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) для клинического применения. Надеемся, что в скором времени будет одобрено лечение HD с помощью ASO или других новых достижений генотерапии. Пока что список одобренных FDA препаратов для генной терапии довольно короткий, что свидетельствует об экспериментальности подходов к исследованию генотерапии.

Основной задачей генотерапии является избирательная замена, восстановление или контроль экспрессии мутантных генов путем переноса генетического материала в клетки-мишени, ответственные за каждое заболевание. Векторы для доставки генов при генотерапии можно классифицировать как вирусные и невирусные [4,5].

На сегодняшний день в большинстве клинических испытаний используются вирусные векторы, поскольку такие вирусы, как адено-ассоциированный вирус (AAV), лентивирус (LV), аденовирус (Adv) и ретровирусы могут экспрессировать полноразмерные гены, что позволяет заменять гены [5]. Вирусы можно легко использовать для разработки более целенаправленных методов лечения, поскольку они обладают тропизмом к определенным тканям и типам клеток [6]. Из-за отсутствия побочных эффектов для человека AAV стал наиболее распространенным типом вируса, используемым в качестве вектора в генотерапии человека. Adv - это икосаэдрический капсидный вирус размером 70-100 нм, и лишь немногие исследования использовали Adv в качестве вектора для генотерапии, поскольку он имеет особенности, ограничивающие перенос генов. Adv вызывает временную экспрессию трансгенов, поскольку они не способны вставлять свой ген в геном хозяина [7,8]. Кроме того, у человека имеется врожденный иммунный ответ на Adv, что ограничивает терапевтический потенциал Adv для генотерапии ЦНС [7,9]. Однако он обладает отличным профилем безопасности [8]. В отличие от Adv, ретровирусы и LVs могут обеспечить более стабильную и длительную экспрессию трансгенов путем обратной транскрипции, что позволяет им вставлять свою ДНК в геном хозяина. Однако следует отметить, что генотоксичность и инсерционный мутагенез должны быть тщательно рассмотрены перед использованием ретровирусов и LVs для генной терапии [8].

Хотя вирусные векторы широко используются для генотерапии, широкий тропизм, ограниченная загрузочная способность, сложность производства векторов и воспалительные реакции хозяина являются критическими недостатками, которые ограничивают применение вирусных векторов в генотерапии [10-12]. Невирусные векторы могут стать альтернативой для переноса генов, преодолевая некоторые из этих проблем, поскольку они относительно свободны от проблем безопасности [13-15]. Невирусные векторы, включая наночастицы, липосомы, экзосомы и т.д., можно разделить на векторы на основе липидов и полимерные векторы в зависимости от их состава [8].

Векторы на основе липидов являются наиболее распространенным типом невирусных векторов [16], и их можно разделить на нейтральные липиды, такие как холестерин, диолеоилфосфоэтаноламин (DOPE) и 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DSPE), и катионные липиды, такие как 1, 2-диолоил-3-триметиламмоний пропан (DOTAP), 1,2-диолоил-3-диметиламмоний пропан (DODAP), N-[1-(2,3-диолоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмоний хлорид (DOTMA) и 3b(N-(N',N'-диметиламиноэтан) карбармоил)-холестерин (DC-холестерин). Нейтральные липиды помогают липосомным компонентам улучшить стабильность и способность к трансфекции [17], а катионные липиды имеют интересные характеристики, которые делают их перспективными векторами для генотерапии: гидрофобные хвосты, связывающие группы и катионные cap-группы [13,18]. Однако неудовлетворительная фармакокинетика биораспределения и цитотоксичность из-за неспецифического связывания и быстрого удаления катионных липидов ограничивают их возможности переноса генов [13,19]. Поэтому были проведены исследования по оптимизации значений pKa катионных липидов [14,16]. Другой тип невирусных векторов - катионные полимеры - обладает губчато-протонным эффектом, тонкой сферической архитектурой и большим разнообразием функциональных групп. Высокая степень свободы при создании функциональных групп, таких как гидрофобные модификации или добавление нафталимидных единиц или молекул aneN3 к катионным липидам, позволяет им иметь большую способность к эндосомальному/лизосомальному выходу, что делает их перспективными кандидатами для векторов генотерапии [16,20-22]. Липидоиды (липидоподобные материалы) и экзосомы также потенциально могут стать векторами генотерапии нейродегенеративных заболеваний [23,24].

Экзосомы - это мельчайшие мембранные везикулы (40-1 100 нм), обладающие способностью к межклеточному обмену веществами [25-27]. Экзосомы образуются в результате отпочкования эндосом внутрь с образованием мультивезикулярных телец, которые сливаются с мембранами и высвобождают экзосомы в окружающую среду [28,29]. Экзосомы, в зависимости от их родительского происхождения, содержат различные белки, липиды, не-кодирующие РНК, мРНК и миРНК, в совокупности называемые "грузом". Благодаря своей грузовой способности, экзосомы представляют собой новую форму внутриклеточной коммуникации между клетками, которая не требует прямого контакта между клетками. Экзосомы избирательно поглощаются окружающими или дистальными клетками и могут перепрограммировать клетки-реципиенты благодаря содержанию активного груза [30,31].

Недавно стало известно, что нанокомплексы CRISPR/Cas9, нацеленные на расщепляющий фермент 1 (BACE1) белка-предшественника амилоида, могут модулировать патологически е проявления болезни Альцгеймера, включая когнитивные нарушения и накопление амилоида. Поэтому разработка векторов, несущих комплекс CRISPR/Cas9, является перспективной стратегией для лечения нейродегенеративных заболеваний. Однако при использовании CRISPR/Cas9 для лечения нейродегенеративных заболеваний у человека остается много препятствий [8]. Помимо вопросов безопасности, поскольку его нельзя применять к неделящимся клеткам, неврологические заболевания, при которых в самих нейронах отсутствует митотический потенциал, являются основным ограничением технологии [32,33]. Дальнейшее понимание характеристик, морфологии и функций векторов для переноса генов, а также важных факторов, ограничивающих эффективный перенос генов, должно быть достигнуто до того, как станет возможным использование генной терапии в клиническом лечении

Большинство нейродегенеративных заболеваний еще не до конца изучены с точки зрения их генетических основ [34]. Однако, поскольку основной причиной HD является единственная генетическая мишень, которая могла бы связываться с геном Htt и снижать его экспрессию. Поэтому многие методы лечения HD были направлены на этот конкретный ген в различных формах генной терапии. Одним из методов генной терапии стало открытие РНК-интерференции в 1998 году. Это произвело революцию в генной терапии, так как позволяло заглушить гены на пост-транскрипционном уровне. Исследование показало [33] дизайн малых интерферирующих, коротких шпилек и микроРНК, которые связывались с геном Htt и снижали его экспрессию. В качестве метода доставки обычно используются вирусные векторы, особенно векторы AAV. Они успешно доставляли РНК мышам и способствовали подавлению образования мутантной агрегации Htt. В другом исследовании [34] также использовались аналогичные методы для лечения HD, поскольку оно было основано на применении рекомбинантных векторов AAV серотипа-5 для доставки молекулы РНК с короткой шпилькой против мутантного белка хантингтина (mHTT) в трансгенную модель мыши HD [35].

В других исследованиях генотерапия использовалась для лечения HD, но не все методы лечения были направлены непосредственно на ген Htt. В некоторых исследованиях [36] ген PA28γ вводился через LVs, поскольку предполагалось, что такой перенос гена улучшает функцию протеасом и двигательное поведение в мышиных моделях HD. Результаты исследований показали, что перенос гена действительно способствовал улучшению двигательных функций в моделях мышей с HD [36].

Недавний подход - использование ASOs. ASO представляют собой короткие синтетические молекулы ДНК, которые связываются с целевой РНК и подавляют целевой ген. Область CAG гена Htt связана с однонуклеотидными полиморфизмами, и ее можно нацелить на ASO, чтобы заглушить ген Htt. Их можно вводить непосредственно в интрацеребровентрикулярное пространство без вектора [37]. Однако они могут не-специфически связываться как с мРНК, так и с пре-мРНК [37].

Примеры генотерапии для лечения нейрогенетических заболеваний перечислены в таблице 1 [5]. Один из них, описанный выше, в настоящее время коммерчески доступен - спинальная мышечная атрофия (SMA). Стоимость генной терапии, направленной на SMA, составляет 1,4 млн долларов США на одного пациента. В 2017 году FDA одобрило генотерапию для одного из видов врожденного амавроза Лебера, в которой для переноса генов применялся AAV, а в 2019 году FDA также одобрило генную терапию для SMA, основанную на переносе onasemnogene (онасемногенов) с помощью AAV.



Table 1. Methods of gene therapy depending on the genetic makeup of the disease

В настоящее время разрабатывается множество испытаний для других нейродегенеративных и генетических заболеваний. Например, исследование эффективности nusinersen (нусинерсена) проводилось двойным слепым, плацебо контролируемым методом на 126 пациентах со спинальной мышечной атрофией второго типа (SMA2). Их возраст составлял от двух до двенадцати лет, а симптомы начались после шести месяцев. Они могли сидеть без посторонней помощи, не имели опыта самостоятельной ходьбы и имели баллы по шкале Hammersmith Functional Motor Scale-Expanded (HFMSE) от 10 до 54. Среди этих пациентов 100 человек завершили 15-месячный курс лечения, 66 из них были направлены на лечение нусинерсеном, а 34 - на фиктивное лечение. Из 66 пациентов, получивших лечение, семь были старше 6 лет, а 59 - младше 6 лет. Только один пациент (14%) старше 6 лет на исходном уровне был признан ответившим на терапию на основании улучшения показателей HFMSE на 3 балла и более, в то время как 38 из 59 пациентов (64%) в возрасте до 6 лет на момент начала лечения улучшили показатели на 3 балла и более [38].

Стратегия снижения уровня Htt с использованием ASOs является самой современной стратегией. ASOs - это короткие одноцепочечные нуклеиновые кислоты, которые связываются с комплементарной нитью мРНК посредством сопряжения оснований Уотсона-Крика. В зависимости от целевой последовательности мРНК они могут предотвращать биосинтез белка, блокировать сплайсинг или ингибировать связывание белков [39]. Однако они могут только временно снижать уровень экспрессии Htt. Поэтому для поддержания низкого уровня экспрессии Htt необходимо их многократное применение. Это большой недостаток по сравнению с генотерапией с использованием вирусных векторов, таких как AAV [6], поскольку они могут регулировать экспрессию генов на постоянной основе путем введения РНК-интерферирующих структур в участки мозга [39]. Помимо подходов с использованием ASO [40], для подтверждения эффекта снижения уровня Htt путем вмешательства в транскрипцию при модификации заболевания были исследованы одноцепочечные молекулы РНК (ssRNAs), малые интерферирующие РНК (siRNAs) [41] и короткие шпилечные РНК (shRNAs) [42] или искусственные микро-РНК (miRNAs) [43]. Все они вмешиваются в транскрипцию на уровне РНК и снижают уровень Htt in vitro и in vivo.

ASO RO7234292 (RG6042) компании Roche был разработан компанией IONIS Pharmaceuticals Inc. (Карлсбад, Калифорния, США) (ISIS443139; IONIS-HTTRx), и в настоящее время он проходит клинические испытания III фазы на основании результатов исследования I/IIa фазы [43]. Эта технология была успешно использована при других редких наследственных заболеваниях. ASO - это химически модифицированный синтетический олигомер второго поколения, комплементарный 20-нуклеотидному участку мРНК Htt. Табризи и др. [44] продемонстрировали примерно 40% снижение мутантного белка Htt в спинномозговой жидкости (СЖ) с помощью 4 интратекальных инъекций 120 мг HTTRx (позднее 267 RG6042) через люмбальную пункцию каждые 4 недели. Этот эффект сохранялся в течение двухмесячного периода наблюдения, удовлетворяя требованиям безопасности для проведения последовательных многоцентровых испытаний фазы III. В настоящее время проводится расширение открытых меток для испытания фазы I/IIa. Продолжающееся клиническое испытание III фазы (под названием Generation HD 1, NCT03761849, спонсор: Hoffmann-La Roche) является первым исследованием ASO при HD, демонстрирующим потенциал модуляции прогрессирования заболевания на основе глобального исследования, проведенного в 101 регионе. В этом рандомизированном, двойном слепом, плацебо-контролируемом исследовании будет зарегистрировано 804 участника. В 3-плечевом исследовании участники получали либо RG6042 в дозе 120 мг, либо RG6042 в дозе 120 мг плюс плацебо каждые 8 недель, либо постоянно получали плацебо в течение 2 лет [39]. Целью исследования III фазы было определить, эффективен ли Tominersen (томинерсен) в снижении экспрессии белка Htt, что привело бы к улучшению клинических признаков HD у пациентов, уже имеющих симптомы [45].

Однако недавно компания "Рош" объявила о прекращении испытания III фазы препарата Томинерсон для ASO HD [45]. Решение было основано на потенциальном профиле риск/польза, и данные должны быть дополнительно проанализированы компанией Roche, но до тех пор исследование III фазы не является полностью закрытым. Некоторые факторы, которые исследователям, возможно, потребуется пересмотреть, - влияет ли блокирование нормального белка Htt на пациентов и не является ли метод введения Томинерсена в позвоночник недостаточно эффективным [45]. Информация все еще очень ограничена, но исследование III фазы еще не отменено, поскольку, во-первых, нет сообщений о новых плохих медицинских исходах, а во-вторых, профиль польза/риск мог измениться. Будущее исследований ASO в лечении HD зависит от решения о дальнейшем использовании томинерсена.

Параллельно с Generation HD1 ведутся исследования с использованием ASO для снижения уровня Htt: Precision-HD1 (NCT03225833, спонсор: Wave Life Sciences Ltd. [Cambridge, MA, USA]) и Precision-HD2 (NCT03225846). Критерии, которые нацелены на мутантную мРНК Htt и при этом не влияют на трансляцию нормального аллеля, достигаются в ASO WVE-120101 и WVE-120102 путем распознавания двух однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в расширенном гене Htt [46]. Первый SNP (RS362037) и второй SNP (RS362331) присутствуют приблизительно у 50% и 40% пациентов с HD, соответственно. В настоящее время проводится I/II клиническая фаза для изучения безопасности и селективности мишеней WVE-12010 и WVE-120102. Фаза I исследований Precision-HD1 и Precision-HD2 началась в 2017 году, а предварительные данные исследования Precision-HD2 были опубликованы в пресс-релизе в 2019 году компанией WAVE Life Sciences Ltd. Было продемонстрировано, что мутированный Htt в CSF был подавлен на 12% с помощью WVE-120102, регуляция которого довольно уступает по сравнению с RG6042, но не является полностью неэффективной [39].

В компании Uniqure разрабатывается генотерапия на основе AAV, называемая терапией AMT-130, которая доставляется адено-ассоциированный вирусный вектором серотипа 5 (AAV5) путем одномоментной операции на головном мозге, что приводит к постоянному снижению экспрессии Htt. AVV5 вводится в паренхиму мозга с помощью технологии MRI. МиРНК попадает в ядро клетки и связывается с мРНК Htt, помечая ее для деградации. В теории считается, что эта процедура необратима. Это неселективная миРНК, предназначенная для людей на ранних стадиях HD [47]. Исследования in vivo, проведенные на модели мышей Q175 с использованием описанного выше хирургического метода введения AVV5, выявили значительное зависимое от дозы среднее снижение белка mHTT до 39% в стриатуме и до 13% в коре головного мозга [48]. Текущее исследование AMT-130-01 изучает его действие на людях, а также его безопасность. Это исследование проводилось в двойных слепых условиях с фиктивной группой. В настоящее время исследование проходит на уровне фазы I/II [47]. В настоящее время в США продолжается набор участников, 26 пациентов получат терапию путем операции на головном мозге и будут наблюдаться в специализированных клиниках по лечению HD по всему миру.

HD может быть потенциальной и идеальной моделью нейрогенетического расстройства с единственной уникальной мишенью. Мы извлекли определенные уроки из терапевтического развития HD, что модуляция уровня mHTT посредством переноса генов является одной из наиболее важных стратегий для облегчения течения болезни. Эта стратегия универсальна и может быть применена к различным другим нейродегенеративным заболеваниям, например, для воздействия на амилоид-бета при болезни Альцгеймера путем переноса генов. Несколько независимых клинических испытаний генотерапии HD находятся в фазе III. Помимо HD, существуют пациенты с нарушениями, связанными с триплетными повторами, с аналогичными патогенетическими механизмами, которые ждут новой терапевтической стратегии для лечения своих заболеваний. В заключение следует отметить, что результаты генной таргетной терапии, по-видимому, являются первым шагом на пути к преодолению трагедии страданий от неврологических генетических заболеваний.