Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), вызываемый ВИЧ-1 инфекцией, представляет серьезную угрозу для здоровья человека во всем мире с тех пор, как о нем впервые было сообщено в начале 1980-х годов Центром по контролю и профилактике заболеваний (CDC) в США (CDC, 1982). ВИЧ-1 - это ретровирус с двумя копиями полногеномной РНК длиной около 9,8 кб, состоящей из двух длинных терминальных повторов (LTR) и генов, кодирующих десять вирусных белков, включая gag, pol, vif, vpr, vpu, env, tat, rev, nef и анти-смысловой белок (ASP) (Liu et al. 2019). ВИЧ-1 вторгается в клетки-мишени путем связывания своего поверхностного белка оболочки gp120 с основным рецептором CD4 на мембране клетки-мишени, а затем взаимодействует с хемокиновым ко-рецептором CCR5 или CXCR4 (Alkhatib et al. 1996; Bleul et al. 1996). CCR5 является основным ко-рецептором для проникновения CCR5 (R5)-тропного ВИЧ-1 в лимфоциты, моноциты, макрофаги и CD4+ Т-клетки (Keele et al. 2008), а CXCR4 является ко-рецептором для CXCR4 (X4)-тропных вирусных штаммов (Hunt et al. 2006). На поздней стадии R5-тропной ВИЧ-1 инфекции или когда CCR5 разрушен, ВИЧ-1 эволюционировал так, чтобы использовать CXCR4 в качестве альтернативного ко-рецептора для проникновения вируса (Hütter et al. 2015; Poveda, 2015). Связываясь с рецепторами, ВИЧ-1 проникает в клетки благодаря слиянию мембран и преобразует вирусную геномную РНК в двухцепочечную ДНК (dsDNA) с помощью обратной транскриптазы РНК. Затем dsDNA интегрируется в геном хозяина, образуя провирус, который может либо активно транскрибировать РНК для создания потомков вируса, либо перейти в латентное состояние без вирусной продукции (Finzi et al. 1999; Zheng et al. 2005). Резервуары латентных ВИЧ образуются на самой ранней стадии ВИЧ-инфекции в покоящихся CD4+ Т-клетках (Siliciano et al. 2003; Chun et al. 2008), макрофагах (Smith et al. 2003), астроцитах и микроглиальных клетках (Bagasra et al. 1996; Narasipura et al. 2014) и, следовательно, ускользают от иммунной системы и противовирусных препаратов. Как только латентный провирус реактивируется под воздействием стимулов, могут быть произведены новые вирусы для заражения соседних клеток, и могут быть созданы новые латентные резервуары (Xiao et al. 2019b). Кроме того, было продемонстрировано, что ВИЧ-1 может проникать в клетки путем эндоцитоза, однако это спорный вопрос, требующий дополнительных доказательств (Marin et al. 2019). Для завершения процессов репликации, упаковки и почкования ВИЧ-1 должен использовать некоторые незаменимые факторы хозяина, такие как фактор роста эпителия хрусталика (LEDGF/P75), транспортер-3 (TNPO3) и нуклеопорин 358 (NUP 358), которые и являются мишенями для лекарств против ВИЧ-1 (Xiao et al. 2019b). ВИЧ-1 в основном инфицирует и разрушает первичные CD4+ Т-клетки, что приводит к повышению риска развития условно-патогенных инфекций, других инфекционных заболеваний и некоторых видов рака (Z Liu et al. 2017). ВИЧ-1 также может инфицировать моноциты, дендритные клетки, микроглию, астроциты и периваскулярные макрофаги в центральной нервной системе (Xiao et al. 2019b).

В настоящее время основным методом лечения ВИЧ-1/СПИДа является комбинированная антиретровирусная терапия (cART), которая представляет собой сочетание нескольких препаратов, эффективно подавляющих функции различных вирусных белков в процессе репликации ВИЧ-1. Однако cART не может полностью ликвидировать латентные резервуары и имеет множество недостатков, таких как пожизненное лечение, высокая стоимость, хронические заболевания печени, поражение сердечно-сосудистой и цереброваскулярной систем, осложнения при старении и неврологические нарушения (Bayer et al. 1983; Durand et al. 2012; Chen et al. 2018; GuoandBuch 2019; Thakur et al. 2019). Поэтому необходимо разработать более эффективные методы удаления латентного провируса ВИЧ-1 и лечения больных ВИЧ-1/СПИДом.

В последние десятилетия генотерапия была разработана как новая стратегия для улучшения здоровья пациентов с генетическими заболеваниями, такими как гемофилия, β-талассемия и другие моногенные заболевания (Xiao et al. 2019a). Между тем, в клинических исследованиях сообщалось, что "берлинский пациент" со СПИДом и острым миелоцитарным лейкозом (AML), был функционально излечен после трансплантации костного мозга с помощью CCR5 Δ32 (Hütter, 2014). Совсем недавно в клиническом отчете о "лондонском пациенте" с лимфомой Ходжкина и СПИДом были представлены аналогичные доказательства излечения (Gupta et al., 2019). Кроме того, Xu и др. сообщили о случае "пекинского пациента" со СПИДом и AML, которому была проведена трансплантация гемопоэтических стволовых клеток с нарушенным CCR5 с использованием технологии CRISPR/Cas9. AML удалось вылечить, однако репликация ВИЧ-1 была только подавлена, а излечение СПИДа не было достигнуто из-за низкой эффективности системы редактирования генов (Xu et al. 2019). Эти клинические случаи показывают, что в настоящее время лечение с помощью редактирования генов подходит не для всех пациентов со СПИДом и рекомендуется только в качестве последнего средства для тех, кто также имеет угрожающие жизни гематологические злокачественные опухоли. Однако в будущем генотерапия может стать мощной стратегией лечения ВИЧ-1/СПИДа, если мы сможем преодолеть все ограничения и обеспечить эффективность и безопасность целенаправленного воздействия.

В исследованиях по генотерапии ВИЧ-1/СПИДа широко изучались три инструмента редактирования генома, опосредованные нуклеазами, а именно нуклеазы с эффектором, подобным активатору транскрипции (TALEN), нуклеазы с цинковыми пальчиками (ZFN) и CRISPR/Cas9 (Xiao et al. 2019b). Среди них ZFN и TALEN - это две специальные нуклеазы, которые распознают участки редактирования генома через взаимодействие белка с ДНК. ZFN была применена для редактирования генов CCR5 в аутологичных CD4+ Т-клетках для лечения ВИЧ-1-инфицированных пациентов (Tebas et al. 2014; Xiao et al. 2019b). Однако и ZFN, и TALEN имеют ограничения, такие как низкая эффективность редактирования генов, высокая частота эффектов вне мишени, а также дорогостоящее и трудоемкое конструирование векторов. Система CRISPR/Cas была впервые обнаружена в иммунных реакциях прокариот против фаговой инфекции и вторжения плазмид (Barrangou et al. 2007). Она содержит геликазу, обозначаемую как Cas, которая связывается с направляющей РНК (gRNA), транскрибируемой палиндромным повтором ДНК, и вырезает ДНК мишень, гибридизированную с gRNA. В зависимости от филогенетического анализа консервативных белков Cas и сравнения репертуаров генов и расположения в локусах CRISPR-Cas, системы CRISPR-Cas можно разделить на три отдельных типа и десять подтипов (MakarovaandKoonin 2015). В частности, в наиболее часто используемой системе CRISPR-Cas второго типа транскрипт повторяющихся последовательностей палиндромов ДНК, названный транс-активирующей CRISPR РНК (tracrRNA), и транскрипт спейсерной CRISPR РНК (crRNA) могут сливаться, образуя одну направляющую РНК (sgRNA), которая направляет Cas9 на разрыв ДНК, расположенной вблизи протоспейсерных смежных мотивов (PAMs) (Jinek et al. 2012; Cong et al. 2013). Разрыв ДНК может привести к негомологичному концевому соединению (NHEJ) или гомологично направленной репарации (HDR) - опосредованному редактированию генома, что приводит к вставкам или делециям в клеточном геноме (Cong et al. 2013; Mali et al. 2013).

Систему CRISPR/Cas можно разделить на два класса в соответствии с компонентом белка Cas, и каждый класс содержит несколько типов (Safari et al. 2020). Система CRISPR/Cas класса I состоит из нескольких белковых комплексов, включая типы I, III и IV (Negahdaripour et al. 2017). Класс II - это монобелковая CRISPR-система, включающая тип II (Cas9), тип V (Cas12a/Cpf1, Cas12b/C2c1 и C2c3) и тип VI (Cas13a, Cas13b и Cas13d) (East-Seletsky et al. 2017). Система CRISPR/Cas типа II впервые была использована in vitro для создания двухцепочечного разрыва (DSB) в целевой ДНК в определенном месте, что заложило основу для ее применения в редактировании генома (Jinek et al. 2012). Затем она была быстро разработана для редактирования генов в клетках млекопитающих благодаря своему удобству, высокой эффективности редактирования и низкими эффектам Вне мишени (Cong et al. 2013). На сегодняшний день разработанные системы CRISPR/Cas в основном включают: (1) традиционный CRISPR-SpCas9, в котором Cas9 был получен из Streptococcus pyogenes, и средства его доставки, такие как лентивирус (LV), аденовирус (AV) и адено-ассоциированный вирус (AAV), для расширения спектра применения (Chen et al. 2018). (2) CRISPR-интерференция (CRISPRi), в которой белок Cas9 содержит два важных нуклеазных домена, RuvC и гистидин-аспарагин-гистидин (HNH), которые необходимы для расщепления комплементарных и не комплементарных нитей ДНК мишени. Мутации SpCas9 RuvC (D10A) и HNH (H840A) могут заставить его структурный домен превратиться в ДНК-"никазу", которая расщепляет только одну нить и индуцирует специфические NHEJ и HDR. Таким образом, неактивный Cas9 (dCas9, SpCas9D10A/H840A) может только связываться с sgRNA и целенаправленно воздействовать на ДНК без её расщепления, что приводит к ингибированию экспрессии генов мишеней (Chen et al. 2018). (3) CRISPR-активатор (CRISPRa), который собирается путем объединения четырех копий активатора транскрипции VP16 (вирусный белок 16 - фактор транскрипции, кодируемый геном UL48 вируса Herpes simplex virus-1) или одной копии активационного домена p65 (AD) с dCas9 (dCas9-VP64 и dCas9-p65AD), которые могут трансактивировать транскрипцию генов в клетках (Chen et al. 2018). (4) Система CRISPR-SaCas9, в которой SaCas9 получен из Staphylococcus aureus и кодируется открытой рамкой считывания (ORF) размером 3,5 кб, которая может быть доставлена в клетки с помощью вектора AAV (Chen et al. 2018). (5) Усовершенствованный Cas9 (eCas9), который представляет собой модифицированный вариант Cas9, впервые разработанный двумя группами независимо друг от друга под названием усовершенствованный Cas9-1.1 (eCas9-1.1) (Slaymaker et al. 2016) и Cas9 high-fidelity variant 1 (Cas9-HF1) (Kleinstiver et al. 2016), который имеет минимальные или не обнаруживаемые нецелевые эффекты в клетках человека, но теряет некоторую расщепляющую активность. Позже были исследованы несколько других вариантов eCas9, таких как гипер-точный вариант Cas9 (HypaCas9) (Chen et al. 2017) и further eCas9 (FeCas9) (Yin et al. 2019), которые продемонстрировали чрезвычайно низкую нецелевую активность без очевидной потери способности к редактированию по сравнению с Cas9 дикого типа.

In addition to CRISPR/Cas systems, many other gene-editing tools, such as CPF1, редакторы оснований, прайм-редакторы и pfAGO (Zetsche et al. 2015; Komor et al. 2016; Anzalone et al. 2019). Более того, CRISPR/Cas-производные SHERLOCK, DETECTR, PAC-MAN и ABACAS были использованы для обнаружения патогенов (Safari et al. 2021). Чтобы представить стратегии генной терапии ВИЧ-1/СПИДа и использовать эти новые технологии редактирования и обнаружения генов в будущем (рис. 1), мы обобщили принципы, функции и потенциальное применение этих инструментов генного таргетинга в лечении ВИЧ/СПИДа (табл. 1).



Fig 1. Strategies for HIV-1/AIDS gene therapy. The allogeneic transplantation is the common method for HIV-1/AIDS gene therapy. It is performed by transplanting gene edited hematopoietic stem cells (HPSC) or CD4+ T cells derived from the bone marrow cells or peripheral-blood mononuclear cells (PBMC) of HIV-1/AIDS patient. In the process of gene editing, multi-approaches can be utilized to making cells resistant against HIV-1 infection.



Table1. Application of CRISPR/Cas based gene editing in HIV-1/AIDS therapy.

Инструмент для целенаправленного воздействия на гены CRISPR/SpCas9 является первой системой CRISPR/Cas, которая была использована в исследованиях генной терапии ВИЧ-1. Одной из наиболее значимых проблем в лечении СПИДа является устранение латентного резервуара в инфицированных ВИЧ-1 клетках. Наиболее прямым и эффективным методом генотерапии является удаление интегрированной ДНК провируса из генома хозяина с помощью CRISPR/SpCas9 таргетинга. С этой целью в 2013 году Ebina и др. сообщили, что экспрессия генов ВИЧ-1 была успешно подавлена в клеточной линии Jurkat с помощью CRISPR/SpCas9-опосредованного целенаправленного воздействия на кассеты NF-κB, расположенные в области U3, и последовательность TAR в R-области LTR. Помимо подавления транскрипции провирусной ДНК ВИЧ-1 и вирусной репликации, CRISPR/SpCas9 может устранять интегрированные вирусные гены в хромосоме хозяина (Ebina et al. 2013). Аналогично, Hu и др. провели исследование по удалению генома ВИЧ-1 с помощью CRISPR/SpCas9, нацеленного на консервативные сайты в области LTR U3 ВИЧ-1. Экспрессия и репликация гена ВИЧ-1 были подавлены в микроглиальных, promonocytic и Т-клетках, при этом наблюдалась минимальная генотоксичность, а внецелевых эффектов обнаружено не было (Hu et al. 2014). Zhu и др. добились аналогичного уничтожения латентного провируса ВИЧ-1 в клетках JLat10.6 с помощью CRISPR/SpCas9, нацеленного на десять различных сайтов (Zhu и др. 2015). Нацелившись на несколько участков генома ВИЧ-1, Liao и др. повысили эффективность редактирования генов и придали первичным клеткам устойчивость к инфекции ВИЧ-1 (Liao et al. 2015). Было показано, что сочетание двух эффективных гид gRNA, нацеленных на разные регионы генома ВИЧ-1, может предотвратить вирусную репликацию и устранять ВИЧ в первичных человеческих Т-клетках и клетках-резервуарах ВИЧ, полученных из плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) (Lebbink et al. 2017).

Помимо воздействия на геном ВИЧ-1 с помощью CRISPR/SpCas9, альтернативной терапевтической стратегией является редактирование клеточных рецепторов для проникновения ВИЧ-1. Основной рецептор, CD4, играет важную роль в иммунной системе, поэтому не рекомендуется уничтожать его с помощью генного таргетинга. Учитывая два известных случая "Берлинского пациента" и "Лондонского пациента", ко-рецептор CCR5 также может быть идеальной мишенью для генотерапии ВИЧ-1/СПИДа. Действительно, Cho и др. успешно подавляли CCR5 в клетках эмбриональной почки человека (HEK) 293T путем трансфекции SpCas9 и sgRNA (Cho et al. 2013). Впоследствии Ye et al. сообщили, что CRISPR/SpCas9 и технология транспозиции piggyBac могут быть использованы для создания мутаций CCR5-Δ32 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (IPSCs) без внецелевых эффектов. Отредактированные IPSCs могли дифференцироваться в моноциты/макрофаги и продемонстрировали устойчивость к R5-тропной инфекции ВИЧ-1 in vitro (Ye et al. 2014). Кроме того, Li и др. использовали химерный аденовирус в качестве носителя для эффективной доставки CRISPR/SpCas9 в первичные CD4+ Т-клетки для замалчивания CCR5 и обеспечили устойчивость к ВИЧ-1 инфекции (Li et al. 2015). Кроме того, Mandal и др. создали биаллельные делеции CCR5 в первичных CD34+ гемопоэтических стволовых и клетках предшественниках человека (HSPCs) и CD4+ Т-клетках, используя подход двойной доставки. CCR5-модифицированные HSPC сохранили способность дифференцироваться в эффекторные клетки у мышей NOD-PRKDCScid-IL2rgnull (NSG) (Mandal et al. 2014). Наконец, Xu и др. создали CCR5-модифицированные CD34+HSPCs с помощью целенаправленного воздействия SpCas9 на область Δ32, которые могут внутренне дифференцироваться и поддерживать нарушение CCR5 во втором поколении HSCs, обеспечивая основу для разработки лечения ВИЧ-1/СПИДа путем трансплантации CCR5-модифицированных HSPCs (Xu и др. 2017).

Другой ко-рецептор ВИЧ-1, CXCR4, играет важную роль в поддержании нормальной физиологической функции гемопоэтических стволовых клеток. Недостаток CXCR4 может привести к потенциально злокачественным заболеваниям (Liu et al. 2018). Стратегия целенаправленного воздействия на CXCR4 для лечения ВИЧ-1 проводилась только в отношении CD4+ Т-клеток. Например, мы разработали две sgRNA, которые направляют CRISPR/SpCas9 для разрушения CXCR4 в первичных человеческих CD4+ T-клетках и придают устойчивость к X4-тропной инфекции ВИЧ-1 без внецелевых эффектов (Hou et al. 2015). Hultquist et al. сконструировали тропно-зависимые устойчивые к ВИЧ-1 первичные CD4+ Т-клетки путем электропортации белка рибонуклеиновой кислоты с помощью CRISPR/SpCas9 и sgRNAs, нацеленных на CXCR4 или CCR5, но метод электропортации был сложным, поскольку требовал больших количеств белка Cas9 и crRNA:tracrRNA для генерации in vitro (Hultquist et al. 2016). Мы заметили, что природный мутант CXCR4 P191A может подавлять X4-тропную инфекцию ВИЧ-1, не нарушая дифференцировку HSC (Liu et al. 2014). Таким образом, мы использовали системы CRISPR/SpCas9 и PiggyBac для создания клеточной линии с мутантным геном CXCR4 (P191A), который может значительно снизить ВИЧ-1 инфекцию, но не влияет ни на связывание лигандов, ни на передачу сигналов Ca2+. Поскольку мутант CXCR4 P191A физически функционирует в клетках и противостоит связыванию X4-HIV, он обеспечивает новый подход к генотерапии ВИЧ-1 (Liu et al. 2018). Более того, поскольку ВИЧ-1 имеет ко-рецепторную конверсию и эволюционировал, чтобы использовать CXCR4 на поздней стадии инфекции, мы провели исследование, нацеленное одновременно на CCR5 и CXCR4 с помощью CRISPR/SpCas9. Модифицированные CD4+ Т-клетки были устойчивы к X4 и/или R5-тропной инфекции ВИЧ-1 и демонстрировали селективное преимущество перед не модифицированными клетками (Z Liu et al. 2017). Поскольку некоторые факторы хозяина необходимы для жизненного цикла ВИЧ-1, они могут быть использованы для предотвращения инфекции ВИЧ-1. Например, Hultquist и др. ввели CRISPR/SpCas9-sgRNA, нацеленные на LEDGF и TNPO3, которые играют ключевую роль в репликации ВИЧ-1, в первичные CD4+ Т-клетки путем электропорации, что привело к non-ophilic-зависимой продукции потомства вирусов (Hultquist et al. 2016). Основная проблема при нокауте определенных факторов хозяина заключается в том, что нарушение может повлиять на физиологические функции этих белков, что приведет к серьезным побочным реакциям у хозяина. В дополнение к принудительной экспрессии факторов рестрикции ВИЧ-1, таких как TRIM5α, SAMHD-1 и NONO, с помощью CRISPRa таргетинга, можно получить мутанты этих факторов хозяина, которые придают повышенную устойчивость к инфекции ВИЧ-1 с помощью CRISPR-опосредованного подхода HDR. Например, введение аминокислотных замен R332G и R355G в человеческий TRIM5α (huTRIM5?) домена может эффективно привести к ограничению ВИЧ-1. Berthoux и др. использовали метод редактирования генома CRISPR/Cas9 на основе трансфекции, чтобы успешно мутировать TRIM5α в его потенциально ограничивающую ВИЧ-1 версию посредством HDR. Эта стратегия подчеркнула важность биаллельной модификации TRIM5α для достижения значительного подавления репликации ВИЧ-1. Однако из-за неточного редактирования CRISPR/Cas9 и ограничений PAM эта стратегия имеет низкую эффективность и может легко привести к двуаллельному целенаправленному воздействию и нежелательным мутациям (Dufour et al. 2018; D?saulniers et al. 2020).

CRISPR/SaCas9 обычно доставляется с помощью AAV, преимуществами которого являются низкая токсичность, низкая патогенность, стабильная экспрессия генов, безопасность, эффективное нацеливание, широкий диапазон серотипов и тропизмов (MingozziandHigh 2013). Кроме того, благодаря более длинной последовательности PAM, распознаваемой SaCas9, повышается скорость распознавания мишени и снижается вероятность нецелевого воздействия. Мы впервые использовали CRISPR/SaCas9 в сочетании с несколькими sgRNA в универсальном лентивирусном векторе для эффективного воздействия на латентный провирус ВИЧ-1 в клетках Jurkat C11 и TZM-bl (Wang et al. 2018). Yin и др. продемонстрировали, что AAV-опосредованная SaCas9/sgRNA может быть использована для удаления интегрированной провирусной ДНК ВИЧ-1 из клеток-предшественников, нейронных стволовых клеток и клеток C11 (Yin et al. 2017). Чтобы нацелиться на ко-рецепторы, мы выбрали два пакета gRNAs/SaCas9 в AAV6 для нацеливания на CXCR4 в CD4+ T-клетках. Эти отредактированные клетки продемонстрировали устойчивость к X4-тропной инфекции ВИЧ-1 (Wang et al. 2017). Мы также успешно целенаправленно воздействовали на CCR5 в первичных CD4+ Т-клетках и CD45+ HSCs с помощью AAV6-sgRNA/SaCas9 и продемонстрировали, что CCR5 CD45+ HSCs нормально дифференцировались и показали устойчивость к ВИЧ-1 у мышей NSG (Wang et al. 2017). Связав dCas9 с транскрипционной ингибирующей областью кассеты Kruppel, Olson и др. смогли подавить транскрипцию ВИЧ-1, одновременно реактивируя латентные провирусы ВИЧ-1 (Olson et al. 2020).

Анти-ВИЧ-1 генотерапия с помощью CRISPR/SaCas9 требует тщательного исследования in vivo на животных моделях. Yin и др. продемонстрировали осуществимость и эффективность использования универсального AAV-вектора, содержащего несколько gRNAs/SaCas9, для воздействия на провирус ВИЧ-1 в трех различных моделях животных. Трансгенным мышам HIV-1 Tg26, у которых провирусный геном pNL4-3 с дефицитом репликации вируса, внутривенно вводили четыре gRNAs/SaCas9 AAV-DJ/8, и продемонстрировали значительное снижение вирусной репликации (Yin et al. 2017). Мы ввели CCR5-модифицированные CD4+ Т-клетки гуманизированным мышам, которые продемонстрировали преимущество в выживании по сравнению с не модифицированными CD4+ Т-клетками при индукции ВИЧ-1 (Xiao et al. 2019a). Далее Pietro и др. продемонстрировали, что болезнь у SIV-инфицированных макак-резусов, которым внутривенно вводили AAV9-CRISPR/SaCas9, протекала легче за счет удаления интегрированных фрагментов провирусной ДНК в геноме клеток крови и тканей, включая лимфатические узлы, селезенку, костный мозг и головной мозг (Mancuso et al. 2020). Приведенные выше исследования закладывают основу для применения CRISPR/SaCas9 в клинических испытаниях ВИЧ-1/СПИДа у человека.

По сравнению с SaCas9, Cpf1 (класс 2 тип V) также обнаруживает преимущества в лечении ВИЧ-1/СПИДа (Zetsche et al. 2015). Используя технологию CRISPR/AsCpf1, наша группа осуществила редактирование генов CCR5 в TZM-b1, Sup T1-R5 и CD4+ Т-клетках. Клетки, нацеленные на CCR5, продемонстрировали устойчивость к R5-тропной ВИЧ-1 инфекции и селективное преимущество по сравнени с необследованными клетками без нецелевых эффектов или дефицита клеточной пролиферации. Это говорит о том, что CRISPR/AsCpf1-опосредованное редактирование генов имеет потенциал для клинического применения (Liu et al. 2020).

Хотя использование CRISPR/Cas редактирования генов в лечении ВИЧ-1 прогрессирует и совершенствуется, все еще существуют некоторые неизбежные дефекты в процессе NHEJ и HDR, вызванные DSB, которые могут привести к неконтролируемым побочным реакциям. Чтобы избежать DSB, Alexis и др. разработали новый метод редактирования генома под названием "редактор оснований", который включает в себя программируемый ДНК-связывающий белок, например, каталитически неполноценный Cas9, не обладающий способностью к расщеплению ДНК, или никазу Cas9, и ДНК-модифицирующий фермент, например, цитидиндеаминазу (Komor et al. 2016). Слитые Cas9 и цитидиндеаминаза могут связываться с целевым геномным локусом путем распознавания sgRNA и напрямую преобразовывать цитидин в уридин, что приводит к мутации C->T (или G->A) после репликации или дополнительной репарации ДНК. "Редактор оснований", цитозиновый редактор оснований (CBE), имеет приблизительное "активное окно", обычно основания 4-8 протоспейсера, где PAM соответствует 21-23 основаниям, которые могут быть эффективно отредактированы. Таким образом, он может эффективно исправлять различные точечные мутации, связанные с заболеваниями человека (Komor et al. 2016). Кроме того, с помощью широкого спектра стратегий направленной эволюции и белковой инженерии David и др. создали редакторы адениновых оснований (ABE), которые могут эффективно преобразовывать целенаправленно пары оснований A->T в G->C (Gaudelli et al. 2017). Технологии CBE и ABE значительно расширяют возможности применения CRISPR/Cas в исследованиях по редактированию генома, поскольку они приводят к меньшему количеству внецелевых эффектов, меньшей генотоксичности и расширяют промежуток редактирования. Кроме того, в недавних исследованиях сообщалось о технологии двух-функционального редактора оснований (DBE), которая сочетает dCas9 с цитидиндеаминазой и аденозиндеаминазой для одновременного преобразования оснований C в T и A в G. По сравнению с соответствующими ABE или CBE, эффективность редактирования оснований DBE выше, а частота эффектов вне мигени ниже. DBE расширяет область изменения последовательности ДНК и расширяет применение CRISPR-редакторов оснований в лечении ВИЧ-1 (Grünewald et al. 2020; Sakata et al. 2020; Zhang et al. 2020). Поскольку мы и другие исследователи обнаружили, что некоторые точечные мутации (S532, T534, T536, L537A/W666A и I535A/V539G) в области gp41 ВИЧ-1 значительно снижают или блокируют образование синцития, опосредованное Env, и влияют на слияние вирусов и инфекцию, эти остатки могут быть мишенью для редакторов оснований и для создания неинфекционного dead-вируса (Freed et al. 1990; Bellamy-McIntyre et al. 2007; Lay et al. 2011; Lu et al. 2019). Таким образом, резервуар ВИЧ-1 может быть преобразован в неинфекционную провирусную ДНК путем ключевых аминокислотных мутаций, которые важны для вирусной инфекционности. Кроме того, для воздействия на CCR5, CXCR4 и факторы хозяина мы можем преобразовать генетический стартовый кодон или его ближайшую последовательность в стоп-кодон путем редактирования оснований, что приводит к преждевременному прекращению трансляции белка (Lu et al. 2019).

Хотя редакторы оснований могут эффективно устанавливать четыре переходные мутации (C->T, G->A, A->G и T->C), остальные восемь преобразований в настоящее время не могут быть произведены (C-->A, C-->G, G-->C, G-->T, G-->T, A-->C, T-->A и T-->A). Для решения этой проблемы Andrew и др. разработали новую систему редактирования генов под названием Prime Editing (PE), соединив каталитически поврежденный Cas9 (H840A) с обратной транскриптазой. В системе PE новая генетическая информация записывается непосредственно в заданный участок ДНК с помощью направляющей гид РНК прайм-редактирования (pegRNA), которая специфически связывается с участком мишенью и кодирует необходимую последовательность редактирования. pegRNA состоит из трех элементов: sgRNA, соответствующей сайту-мишени, последовательности связывания праймера и матрицы для обратной транскрипции, хранящих генетическую информацию для целенаправленного воздействия (Anzalone et al. 2019). PE имеет широкий спектр применения, поскольку вызывает мутации с переходом 12 оснований, небольшие вставки оснований, делеции и их комбинации в клетках человека без необходимости использовать DSB и матрицы донорской ДНК. Современные системы PE в основном включают PE1, PE2, PE3 и PE3b (Hsu et al. 2021). PE1 имеет самую низкую эффективность редактирования за счет слияния обратной транскриптазы с РНК-программируемой никазазой. PE2 повышает эффективность целенаправленного воздействия путем инженерии обратной транскриптазы на основе PE1. PE3 и PE3b совместно экспрессируют sgRNA, нацеленную на нередактируемую нить, на основе PE2 и могут защищать информацию о модификации редактируемой нити посредством внутриклеточного пути репарации несоответствий, тем самым еще больше повышая эффективность редактирования и усиливая образование indels (Anzalone et al. 2019; Lin et al. 2020). По сравнению с методом редактирования генома CRISPR-Cas, который индуцирует HDR, PE имеет меньше внецелевых эффектов и побочных продуктов, а также более высокую эффективность редактирования. Кроме того, по сравнению с BE, который может вызвать побочные редактирования, если активное окно содержит несколько цитозинов или аденинов, PE практически не имеет побочных продуктов. Однако, хотя PE имеет более широкий спектр применения и более точные правки, эффективность его редактирования ниже, чем у BE. Поэтому BE может быть выбран, если в активном окне находится один целевой нуклеотид или допустимы побочные правки. PE больше подходит для активных окон с несколькими цитозинами/аденинами или неприемлемыми побочными правками. Однако сложность и трудность конструирования pegRNA для PE намного выше, чем sgРНК для BE. Чтобы упростить конструирование pegRNA, Hsu и др. ввели базу данных для улучшения практического использования PE (Hsu et al. 2021; Kim et al. 2021). Для лечения ВИЧ-1/СПИДа PE можно использовать в качестве дополнения к BE. Например, мы определили три высоко-консервативных важных сайта (S532P, T534A и T536A), которые могут влиять на связывание gp120 с рецептором CD4 во время проникновения ВИЧ-1 в клетки (Lu et al. 2019). Мутации этих сайтов под действием PE могут блокировать инфекционность ВИЧ-1.

В лечении ВИЧ-1/СПИДа стратегия "шок и убийство" ("shock and kill" ) является перспективным подходом к уничтожению латентных вирусов, который достигается путем использования агентов, восстанавливающих латентность (LRA), для реактивации латентных провирусов ("шоковая" фаза), интегрированных в иммунные клетки, а реактивированные клетки могут быть уничтожены ВИЧ-1-индуцированными цитопатическими эффектами или иммунными ответами хозяина ("убойная" фаза) (Chen et al. 2018). Поскольку система активации CRISPR (CRISPRa) может усиливать экспрессию генов, ее можно рассматривать как LRA, включающую активацию вирусной репликации (Deeks, 2012). Например, Zhang et al. продемонстрировали, что система dCas9-SAM может эффективно целенаправленно воздействовать на промотор LTR ВИЧ-1 в микроглиальных клетках TZM-b1, J-LAT, 2D10, 3C9, E4 и CHME5 (Saayman et al. 2016). Кроме того, Sheena и др. исследовали систему dCas9-VP64, нацеленную на промотор LTR ВИЧ-1, чтобы определить "горячие точки" для связывания sgRNA и активации провируса (Limsirichai et al. 2016). Более того, Ji и др. использовали dCas9-SunTag-VP64 для нацеливания на область LTR ВИЧ-1 и эффективной реактивации провируса в латентных клетках C11 и A10.6 (Ji et al. 2016).

Поскольку ВИЧ-1 содержит две копии вирусной РНК, а геномная РНК может быть получена из провируса, целенаправленное воздействие на РНК является еще одной стратегией лечения ВИЧ-1/СПИДа. Изобретение эффекторов CRISPR, нацеленных на РНК, заложило основу для обнаружения и удаления РНК ВИЧ-1 (Freije et al. 2019; Zhang et al. 2019; Safari et al. 2021). Большинство методов редактирования РНК основаны на Cas13a и Cas12a.

Cas13a был впервые представлен Shmakov и др. (Shmakov et al. 2015). Она может разрушать РНК-мишень, направляемая с помощью gRNA, с чрезвычайно высокой специфичностью и очень низкими эффектами вне мишени. Её преимущество заключается в одно основание дискриминации генов-мишеней (Shmakov et al. 2015). При разрушении первой одноцепочечной РНК (ssRNA) Cas13a становится высокочувствительным и ферментативно "активным" и осуществляет неспецифическое расщепление других РНК (collateral cleavage) (East-Seletsky et al. 2017; L Liu et al. 2017). Исходя из этих свойств, нуклеаза Cas13a может быть использована для целенаправленного воздействия на геномную РНК ВИЧ-1 и проникающие в инфицированные клетки РНК. Объединив энзимологию Cas13a по расщеплению РНК и предварительную амплификацию нуклеиновой кислоты изотермической рекомбиназной полимеразой или рекомбиназной полимеразой обратной транскрипцией, была предложена specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking (SHERLOCK) для быстрого, удобного и чувствительного обнаружения целевого гена (Gootenberg et al. 2017; Kellner et al. 2019). Принцип SHERLOCK заключается в использовании побочного расщепления Cas13a, направляемого gRNA, для разрезания репортерной ssRNA с флуорофором и квенчером (глушителем) на обоих концах. Когда нацеливающая гид РНК не была подготовлена (primed) CRISPR/Cas13a gRNA, то репортерная РНК оставалась неповрежденной, а гаситель (quencher) гасил флуоресценцию. Однако, как только нацеливающая РНК обнаруживалась CRISPR/Cas13a gRNA, то репортерная РНК могла быть разрушена, чтобы высвободить флуоресценцию, которую может измерить детектор (Kellner et al. 2019). SHERLOCK был использован для обнаружения вирусов Зика и денге (Gootenberg et al. 2017). Поскольку ВИЧ-1 имеет две копии ssRNA, SHERLOCK можно использовать для скрининга ВИЧ-1 в подозрительных случаях и количественного определения уровня активной репликации ВИЧ-1 с высокой чувствительностью у пациентов со СПИДом.

Подобно SHERLOCK, транс-репортер CRISPR, нацеленный на ДНК-эндонуклеазу Cas12a (DETECTR), может вызывать DSB, что вызывает неспецифическое расщепление ДНК (Y Li et al. 2019). Поэтому DETECTR может расщеплять ssDNA-репортер с флуоресцентными и тушащими группами на обоих концах. С помощью DETECTR со специфической gRNA/Cas12a можно обнаружить ДНК провируса ВИЧ-1 у больных СПИДом.

При прямом нацеливании на (+) ssRNAs или РНК, ответственные за репликацию и экспрессию вируса , является эффективным методом блокирования репликации РНК-вирусов (H Li et al. 2020). Система CRISPR/Cas13d была разработана для подавления экспрессии мРНК в клетках млекопитающих или РНК-вирусов в растениях (Konermann et al. 2018; Mahas et al. 2019; Kushawah et al. 2020; Zhou et al. 2020). Кроме того, Cas13d и его варианты обладают сильной побочной активностью для расщепления РНК с высокой специфичностью и минимальными эффектами вне мишени (Yan et al. 2018). В связи с пандемией COVID-19, вызванной SARS-CoV-2 в прошлом году, Abbott и др. разработали профилактический противовирусный CRISPR-метод в клетках человека (PAC-MAN) на основе Cas13d для нацеливания на SARS-CoV-2 и все секвенированные штаммы коронавируса (Abbott et al. 2020). Путем биоинформационного анализа последовательностей SARS-CoV-2 были выбраны консервативные области SARS-CoV-2 для создания пула (библиотеки) crRNA, способного непосредственно разрушать все коронавирусы. Таким образом, эта библиотека crRNA может служить профилактическим средством против будущих патогенных коронавирусов, которые эволюционировали, чтобы избежать иммунного надзора (Abbott et al. 2020). Подобно SARS-CoV-2, библиотека кРНК может быть создана против штаммов ВИЧ-1 в рамках стратегии PAC-MAN для лечения ВИЧ-1/СПИДа.

Для более специфического воздействия на SARS-CoV-2 с помощью Cas13 был разработан метод слияния антител и CAS (ABACAS) путем слияния Cas13 со специфическим антителом к основным структурным белкам вируса, таким как S-белок. Комбинация вирусных антигенов по методу ABACAS может подавлять проникновение вируса в клетки. Кроме того, когда вирус попадает в клетки путем эндоцитоза, Cas13 может расщеплять вирусную РНК в инфицированных клетках, тем самым подавляя вирусную репликацию (Joyce et al. 2020; Yuan et al. 2020). Поскольку ВИЧ-1 также может проникать в клетки-мишени путем эндоцитоза, селективность вируса и эффективность расщепления РНК можно повысить, собрав ABACAS с Cas13 и антителом к ВИЧ-1.

В настоящее время общий подход к лечению ВИЧ-1/СПИДа с помощью генотерапии можно разделить на четыре категории (как показано на рис. 2): (1) Редактирование генов ко-рецепторов ВИЧ-1. Поскольку ВИЧ-1 проникает в иммунные клетки через ко-рецепторы CCR5 и CXCR4, наиболее эффективным методом является использование технологии редактирования генов, чтобы заставить замолчать или мутировать ко-рецепторы на поверхности клеток против ВИЧ-1 инфекции. (2) Нацеливание на геном РНК ВИЧ-1 или провируса. РНК ВИЧ-1 может быть обнаружена и/или деградирована РНК-направленными эффекторами CRISPR, происходящими от Cas12a и Cas13a. Кроме того, провирус ВИЧ-1 может быть либо расщеплен инструментами редактирования генов, либо активирован CRISPRa для стратегии "шок и смерть". (3) Нацеливание на незаменимые факторы хозяина, такие как LEDGF/p75 и TNPO3, которые необходимы для жизненного цикла ВИЧ-1. Мутирование или нокаут этих генов с помощью CRISPR-Cas ограничит репликацию вируса в клетках. (4) Принудительная экспрессия факторов рестрикции ВИЧ-1, таких как TRIM5α, SAMHD-1 и NONO, с помощью CRISPRa-таргетинга или редактирования генов для создания мутантов, обеспечивающих повышенную устойчивость к инфекции ВИЧ-1.



Fig 2. Gene editing targets in the life cycle of HIV-1. The potential targets for HIV-1/AIDS gene therapy can be divided into four categories: (1) HIV-1 co-receptors. As HIV-1 enters immune cells through co-receptors CCR5 and CXCR4, the most effective method is using gene-editing technology to silent or mutate co-receptors and confer cell resistance against HIV-1 infection. (2) HIV-1 RNA genome or provirus. HIV-1 RNA can be detected and/or degraded by RNA-guided RNA-targeting CRISPR effectors derived from Cas12a and Cas13a. HIV-1 provirus could either be cleaved by gene-editing tools or activated by CRISPRa for the "shock and kill" strategy. (3) Indispensable host factors, such as LEDGF/p75 and TNPO3, which are essential in the HIV-1 life cycle. Mutating or knockout of these genes by CRISPR-Cas will restrict virus replication in cells. (4) Forced expression of HIV-1 restriction factors, such as TRIM5?, SAMHD-1, and NONO, by CRISPRa targeting, or gene editing to develop mutants that confer increased resistance to HIV-1 infection.

ВИЧ-1/СПИДа (Tebas et al. 2014). Хотя в 2016 году было проведено первое клиническое испытание с использованием CRISPR/Cas9, в ходе которого модифицированные человеческие Т-клетки были повторно введены человеку с метастатическим не мелкоклеточным раком легких (Lu et al. 2020), технология для лечения ВИЧ-1/СПИДа в основном использовалась на мышах или первичных клетках. Клинические испытания CRISPR/Cas9 для лечения ВИЧ-1 были проведены на "пекинском пациенте", который страдал одновременно от ВИЧ-1/СПИДа и AML (Xu et al. 2019). Чтобы учесть безопасность клинического применения редактирования генов на основе CRISPR для лечения ВИЧ/СПИДа, перед широким использованием необходимо рассмотреть некоторые предостережения. Во-первых, внецелевые эффекты CRISPR/Cas9 вызывают неспецифическое расщепление и приводят к цитотоксичности. В предыдущем докладе была продемонстрирована толерантность к несовпадению при нацеливании SpCas9/sgRNA (Lin et al. 2014). Кроме того, опосредованная лентивирусным вектором постоянная экспрессия gRNA/Cas9 привела бы к нежелательным нецелевым эффектам и способствовала бы развитию DSBs, повышая толерантность к несовпадениям в области PAM и guide-matching (Ortinski et al. 2017). Это можно улучшить, используя альтернативные средства доставки Cas9, такие как векторы переходной экспрессии, электропортация мРНК или белков Cas9, а также наночастицы. Во-вторых, SpCas9 и SaCas9 могут вызывать DSB, которые будут индуцировать NHEJ или HDR, что приведет к неблагоприятным реакциям в виде неконтролируемых делеций и вставок. В-третьих, нацеливание CRISPR/Cas9 зависит от распознавания последовательности PAM, что ограничивает применение этого метода. В-четвертых, эффективность доставки компонентов CRISPR/Cas9 in vivo все еще нуждается в улучшении. В-пятых, для таргетинга ВИЧ-1/СПИДа латентное состояние вируса увеличивает сложность устранения резервуара в клетках, инфицированных ВИЧ-1. В последнее время вышеуказанные недостатки CRISPR/Cas9 были частично устранены и улучшены исследователями. Например, Jordan и др. разработали вариант YE1, который сохраняет субстратно-целевой охват высокоактивных CBE при минимальном Cas9-независимом внецелевом редактировании (Doman et al. 2020). Shannon и др. показали, что спектр нацеливания SpCas9 и его инженерных вариантов сильно ограничен его распознающей последовательностью PAM, содержащей гуанины. Они применили стратегии отбора с помощью фаговой непрерывной эволюции (PANCE) и трех новых фаговых непрерывных эволюций (PACE) для идентификации трех новых вариантов SpCas9 с NRNH типами PAM (R = A или G и H = A, C или T). Эти новые варианты Cas9 с несколькими PAM расширили применение CRISPR/Cas9 таргетинга (Miller et al. 2020) и позволяют улучшить некоторые стратегии и генерировать мутантные белки хозяина (Dufour et al. 2018). Кроме того, Youdiil et al. успешно подавляли репликацию ВИЧ-1 в долгосрочной перспективе и ограничивали генерацию избегающих мутантов путем дивергенции универсального лентивирусного вектора, содержащего шесть gRNAs, нацеленных на геном ВИЧ-1 в Т-клетках (Ophinni et al. 2020).

Технологии редактирования генов имеют широкие перспективы применения, особенно для лечения многих заболеваний, вызванных генными мутациями или патогенными инфекциями. Для генотерапии ВИЧ-1/СПИДа в клинических исследованиях с использованием CRISPR/Cas9 это остается проблемой. Чтобы улучшить практику в будущих применениях, мы должны: (1) разработать более специфичные мутанты gRNA и Cas9 для снижения внецелевых эффектов; (2) разработать одно- или многофункциональные редакторы оснований, которые могут непосредственно и точно редактировать основания без DSB-индуцированного NHEJ или HDR; (3) разработать варианты Cas9 с гибкими последовательностями PAM для расширения применения CRISPR/Cas9; (4) изучить новые средства для безопасной и эффективной доставки инструментов редактирования генов; и (5) оптимизировать животные модели ВИЧ-1/СПИДа и провести больше экспериментов по генотерапии in vivo, что заложит основу для клинического применения. Благодаря вышеуказанному прогрессу, CRISPR/Cas9 и другие технологии редактирования генома могут принести захватывающие и многообещающие достижения в генной терапии ВИЧ-1/СПИДа.