За более чем 20 лет исследований были разработаны и испытаны продукты клеточной и генной терапии в качестве потенциальных методов лечения или лечения ВИЧ-инфекции. История клеточной и генной терапии ВИЧ начинается по меньшей мере с 1994 года, когда Робертс и другие [1] использовали ретровирусный вектор для перепрограммирования Т-клеток на экспрессию основной молекулы распознавания комплекса гистосовместимости (MHC) без ограничений. Молекула распознавания представляла собой усеченную форму гликопротеинового рецептора CD4 для ВИЧ, и предполагалось, что перепрограммированные клетки будут обнаруживать и уничтожать инфицированные клетки, экспрессирующие гликопротеин оболочки клеточной поверхности. Это была ранняя форма того, что мы сегодня знаем как химерный антигенный рецептор (CAR), опосредованное и MHC-неограниченное распознавание клеточных антигенов. В последующие годы Т-клетки были сконструированы таким образом, чтобы распознавать инфицированные клетки с помощью множества рецепторов, противостоять прикреплению ВИЧ и подавлять репликацию вируса. Генетические модификации были внесены в циркулирующие лимфоциты или клетки-предшественники гемопоэтических стволовых клеток (HSCPC), и клетки вводились в ходе клинических испытаний, чтобы проверить, контролируют ли они возобновление виремии в плазме крови после прекращения терапии. За исключением примера клеток, отредактированных ex vivo для разрушения гена CCR5 и введенных участнику испытаний, гетерозиготному по аллелю потери функции CCR5delta32 [2], стабильного подавления ВИЧ в отсутствие антиретровирусной терапии достичь не удалось.

Чтобы понять, почему так много стратегий не достигли цели и есть ли у новых препаратов лучшие перспективы, мы приводим этот критический обзор последних достижений в области клеточной и генной терапии ВИЧ. Мы намеренно опустили исследования по генетической модификации массовых CD4 Т-клеток, в основном с использованием систем редактирования CRISPR/Cas9, и последние разработки в области CAR-подходов, которые рассматриваются в других разделах этого тома.

Существенное внимание было сосредоточено на улучшении плохого гуморального иммунный ответ на ВИЧ, при котором нейтрализующие антитела появляются редко и только через много месяцев после заражения. Одним из важных методов преодоления этого недостатка защитного гуморального иммунитета является использование векторного пассивного иммунитета. Векторный пассивный иммунитет - это доставка в ткани синтетических генов, кодирующих защитные антитела или противовирусные белки. Векторы включают рекомбинантные, ослабленные вирусы и плазмиды, но в будущем, несомненно, будет использоваться доставка голой РНК. Векторный пассивный иммунитет может доставлять нейтрализующие антитела или антитела, способные опосредовать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность.

Клиническое исследование адено-ассоциированного вирусного вектора (AAV), экспрессирующего широко нейтрализующее антитело PG9, было проведено среди здоровых (ВИЧ-отрицательных) взрослых мужчин [3]. Участники получали рекомбинантный AAV путем внутримышечной инъекции в дозах от 4 x 10¹² до 1,2 x 10¹⁴ геномов вектора; приблизительно 1,4 x 10¹² геномов вектора на кг. В исследовании принял участие 21 доброволец, которые прошли 48 недель наблюдения без каких-либо нежелательных явлений, связанных с препаратом. PG9 в сыворотке крови был обнаружен с помощью анализа на нейтрализацию ВИЧ, но не мог быть обнаружен с помощью ELISA. Антитела к препарату были обнаружены у 10 участников из групп с более высокой дозой. В этом исследовании рекомбинантный AAV1, экспрессирующий моноклональное антитело PG9, не смог поддержать высокий уровень антител в сыворотке крови. Напротив, в исследовании инфицированных SHIV макак-резус, инокулированных 2 x10¹² векторных геномов на кг на вектор и получавших два или четыре различных AAV, экспрессирующих моноклональные антитела (антитела 3BNC117 плюс 10-074 или антитела PGT145, 35022, NG и PGT128) при общей дозе AAV 4 х 10¹² векторных геномов на кг с двумя векторами, кодирующими антитела, или 8 х 10¹² векторных геномов на кг для группы, получавшей четыре рекомбинантных AAV. Макаки получили начальную дозу рекомбинантных векторов с использованием серотипа AAV8 и получили вторую дозу через 25 недель с использованием серотипа AAV1, чтобы избежать нейтрализующих вектор антител [4]. У макак, получавших два разных AAV, наблюдалась тенденция к снижению уровня виремии в плазме, но результаты были более впечатляющими у двух из четырех макак в группе, получавшей четыре разных AAV; у этих животных наблюдалось значительное и устойчивое снижение уровня виремии в плазме, несмотря на периодические "всплески" в течение 55 недель после первоначального введения AAV.

Различия в серотипе AAV, использование одной или двух доз, выбор конструкций антител и тестирование на ВИЧ-отрицательных людях по сравнению с макаками, инфицированными SHIV, затрудняют сравнение. Легко поверить, что несколько генных конструкций антител лучше, чем одна конструкция, так же как, что комбинированная антиретровирусная терапия превзошла клиническую пользу от отдельных препаратов. Значение AAV8 по сравнению с AAV1 может быть важным, а доза, использованная в клиническом исследовании безопасности, возможно, была слишком низкой. Важно также отметить, что более ранние исследования на макаках продемонстрировали in vivo защитные эффекты антител, экспрессированных в AAV, которые не были отражены в анализах нейтрализации сыворотки [5**], а проблема анти-лекарственных антител, которые связывают и ингибируют антитело, закодированное в AAV [6?*, 7**], остается потенциальным камнем преткновения для более широкого клинического применения. Недавний обзор содержит более подробное обсуждение терапии антителами и использования векторов AAV, включая подробное обсуждение литературы, опубликованной до 2019 года [8*]

Прямое введение плазмидной ДНК, кодирующей гены для моноклональных антител, является альтернативой использованию AAV. Плазмидная ДНК была составлена с гиалуронидазой и введена мышам или не-человекообразным приматам внутримышечно [9**]. В обоих случаях были обнаружены высокие титры нейтрализующих антител в сыворотке крови, а у не-человекообразных приматов их уровень превышал титры нейтрализующих антител, защищавших макак от заражения вирусом Зика, который использовался в качестве предварительной цели для определения уровня антител в сыворотке крови [10**]. Использование плазмидной ДНК имеет дополнительное преимущество, поскольку анти-векторные антитела не вырабатываются, а повторное дозирование упрощается.

Векторный пассивный иммунитет также был продемонстрирован на не-человекообразных приматах с использованием антителоподобной молекулы eCD4-IG. eCD4-Ig содержит домены CD4, связывающие гликопротеин оболочки ВИЧ, плюс небольшой CCR5-миметический сульфопептид, слитый с Fc-областью IgG [11]. Защита наблюдалась, но эффективность была снижена появлением антител против препарата, направленных в основном против сульфопептида. Использование eCD4-Ig может упростить векторный пассивный иммунитет за счет доставки одной растворимой молекулы вместо нескольких антител, но результаты клинических испытаний не были представлены, и проблема анти-лекарственных антител остается.

Искусственно преобразованные В-клетки представляют собой новую важную возможность преодоления недостаточности естественного гуморального иммунитета при ВИЧ-инфекции. Широко нейтрализующие антитела появляются у меньшинства инфицированных людей и то только через 1-3 года после заражения. Пассивная иммунизация с использованием прямого введения очищенных белков или векторного пассивного иммунитета, о котором говорилось выше, продемонстрировала клиническое воздействие мощных антител. В последнее время предпринимаются попытки повысить эффективность и потенцию гуморального иммунитета путем генной инженерии В-клеток.

В большинстве случаев для инженерии лимфоцитов ex vivo используются ретровирусные или лентивирусные векторы, но этот подход плохо работает для В-клеток человека из-за низкой эффективности трансдукции. Альтернативная стратегия основана на трансфекции В-клеток плазмидами с использованием редактирования CRISPR/Cas9 для замены хромосомного гена иммуноглобулина синтетическим геном, экспрессирующим антитело против гликопротеина оболочки ВИЧ. Зрелые мышиные или человеческие В-клетки получали синтетический ген антитела без независимого промотора, экспрессирующий широко нейтрализующее антитело. Конструкция была интегрирована (knock-in) в хромосомный локус тяжелой цепи [12*] Экспрессия сконструированного гена антитела зависела от транскрипционного промотора гена естественного иммуноглобулина. Эффективность модификации была выше для человеческих по сравнению с мышиными В-клетками, а иммунизация восстановленных мышей когнитивным антигеном вызывала титры антител в сыворотке крови на защитных уровнях. Knock-in произошел в основном в активном локусе тяжелой цепи, а не на хромосоме, заглушенной путем исключения аллелей, и привел к высокоуровневой экспрессии антител на поверхности клеток.

Сходное исследование началось с конструкции, содержащей промотор тяжелой цепи (VH) и ген, кодирующий широко нейтрализующее антитело VRC01. AAV использовали для доставки рибонуклеопротеинового комплекса CRISP/Cas9 и направляющей РНК, чтобы направить расщепление ДНК с помощью Cas9, а трансфекция плазмиды осуществлялась с помощью электропортации и обеспечила донорской нитью ДНК, содержащую 5' и 3' гомологичные плечи, плюс конструкцию для экспрессии антитела [13**]. Адоптивный перенос вернул сконструированные В-клетки обратно мышам. Самые высокие титры антител наблюдались после усиления антигенами восстановления мышей и особенно для конструкций knock-in, нацеленных на локус тяжелой цепи. Удивительно, но сконструированные антитела демонстрировали соматическое созревание в последовательностях V региона, что указывает на селекцию антигена in vivo. Преобразованные В-клетки направлялись в зародышевые центры и преобладали над эндогенными реакциями, демонстрируя при этом рекомбинацию классов переключения и фенотипов памяти [14].

Искусственное преобразование В-клеток открывает большие перспективы для экспрессии широко нейтрализующих антител независимо от медленного и ненадежного естественного ответа на ВИЧ. Возможность переключения изотипов и соматического созревания позволяет предположить, что эти преобразованные гены являются субстратом для естественного созревания ответа антител, что может позволить достаточное количество изменений генов антител для преодоления быстрого избегания (escape) вирусами из-за их вариаций . Очень важно решить, будет ли лучшей отправной точкой экспрессия преобразованного известного нейтрализующего антитела или вставка последовательности предшественника ближе к зародышевой линии, которая может иметь большую гибкость для ответа на различные варианты ВИЧ или может ускорить процесс соматического созревания.

Цели лечения и излечения от ВИЧ-инфекции привлекли внимание специалистов по клеточной и генной терапии, что привело к большому разнообразию подходов и клинических испытаний, обсуждаемых здесь и в других разделах данного тома. В большинстве этих стратегий отсутствует попытка объединить возможности клеточного программирования с доказанной полезностью иммунотерапии. Наиболее значительным и стойким иммунным дефектом при ВИЧ-инфекции является потеря и неспособность восстановить ВИЧ-специфические CD4 Т-клетки, что приводит к снижению способности дифференцировать новые цитотоксические Т-клетки CD8 для соответствия вирусной эволюции и слабому ответу В-клеток из-за отсутствия MHC класса II-ограниченной помощи Т-клеток. Когда объемные CD4 Т-клетки создаются ex vivo и вводятся в организм, частота ВИЧ-специфических Т-клеток не меняется, а потенциал для иммунотерапии теряется. В настоящее время предпринимаются новые попытки объединить возможности клеточной инженерии с существующими методами лечения заболеваний с помощью антиген-специфических Т-клеток. Лечение вирусных заболеваний с помощью вирус-специфических Т-клеток (VST) является устоявшейся технологией, используемой в контексте аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у взрослых (обзор в [15**]) и детей [16*,17].

Использование VST требует экспансии антиген-специфических Т-клеток ex vivo с последующим введением обратно. Для лечения ВИЧ предпочтительны аутологичные клетки, в отличие от аллогенных клеток, используемых в пост-трансплантационном периоде. Аутологичные VST были протестирована при ВИЧ-инфекции с использованием размноженных ex vivo клеток, полученных путем выделения и созревания дендритных клеток, затем добавления мононуклеарных клеток периферической крови плюс пулов пептидов, представляющих белки ВИЧ Gag, Pol и Nef [18**]. Полученные клетки вводились в организм и хорошо переносились, но значимого изменения в частоте латентно инфицированных Т-клеток в циркуляции не наблюдалось. Важно отметить, что эта процедура не модифицировала CD4 Т-клетки для защиты их от ВИЧ-инфекции, и полученный продукт содержал лишь низкую долю CD4 Т-клеток. В текущих клинических исследованиях (NCT03485963) проводится оценка этого продукта. Хотя модификация объемных PBMC позволила получить ВИЧ-специфические CD8 Т-клетки, продукт не обеспечил достаточного количества устойчивых ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток для достижения иммунного контроля ВИЧ.

Из предыдущих исследований известно, что более высокий уровень ВИЧ-специфических CD4 T-клеток, особенно Gag-специфического подмножества, связан с естественным контролем вируса. Лица, которые естественным образом контролируют виремию ВИЧ без антиретровирусной терапии, имеют более высокий уровень Gag-специфических CD4 T-клеток по сравнению с теми, кто не контролирует вирус [19**], а более высокий уровень T-клеточных помощников коррелирует с большей широтой нейтрализующих антител [20], возможно, из-за повышения уровня и функции фолликулярных клеток помощников CD4 T [21]. Ранняя индукция и поддержание Gag-специфических CD4 T-клеток является важной особенностью лиц, контролирующих ВИЧ [22,23], и восстановление этой способности должно быть целью клеточной и генной иммунотерапии ВИЧ [24]. Клеточная терапия, основанная на генетической модификации основной массы CD4 T-клеток, может обеспечить устойчивые к ВИЧ клетки для так называемой "заместительной иммунной системы" [15**], но не повлияет на частоту ВИЧ-специфических CD4 T-клеток, что жизненно важно для восстановления естественного иммунного контроля ВИЧ.

Недавно две группы сообщили о прогрессе в объединении концепций VST с технологией клеточной и генной терапии. Используя метод генерации ВИЧ-специфических Т-клеток от неинфицированных нативных доноров [25**], ВИЧ-специфические Т-клетки были размножены и трансдуцированы лентивирусным вектором, кодирующим моноклональное антитело, способное связывать гликопротеин оболочки ВИЧ и направлять антитело-зависимую клеточную цитотоксичность [26]. Сконструированные клетки показали незначительное снижение скорости пролиферации по сравнению с немодифицированными клетками и продуцировали антитело, способное к антителозависимой клеточной цитотоксичности. Использование этих клеток предполагается как часть подхода "шок и смерть", при котором мощная поликлональная стимуляция CD4 T-клеток in vivo активирует выработку белка ВИЧ среди латентно инфицированных клеток, а антитела, экспрессированные с вирусного трансгена, перенаправляют убийство на инфицированные клетки.

Наши собственные усилия были направлены на восстановление иммунитета CD4 T-клеток к ВИЧ, делая эти клетки (AGT103-T) устойчивыми к ВИЧ и предотвращая выделение ВИЧ, если они были латентно инфицированы до генетической модификации и экспансии. С помощью полу-автоматизированного процесса производства, соответствующего требованиям GMP, удалось обогатить Gag-специфические CD4 Т-клетки c приблизительно 0,05% CD4 Т-клеток в исходном материале до уровня 30% в конечном клеточном продукте, который содержит более 95% CD4 Т-клеток [27]. В процессе производства Gag-стимулированные клетки трансдуцировали лентивирусным вектором, экспрессирующим миРНК, способную снижать уровень CCR5 на клеточной поверхности и атаковать геном и мРНК ВИЧ в области генов Tat и Vif. В результате уровень CCR5 модулируется в основном в Gag-специфических CD4 T-клетках, эти клетки противостоят как CCR5-, так и CXCR4-тропным штаммам, а высвобождение вируса после индуцирования латентных клеток нарушается. По сравнению с инфузией клеток с массовым продуктом CD4 Т-клеток SB781, состоящим из CD4 Т-клеток, модифицированных аденовирусом, экспрессирующим нуклеазу Zinc finger, нацеленную на ген CCR5 [2], AGT103-T обеспечивает в 1000 раз большее количество модифицированных, Gag-специфичных CD4 Т-клеток по сравнению с SB781 или другими клеточными продуктами, полученными из массовых популяций Т-клеток. Наша цель - восстановить популяцию Gag-специфических CD4 Т-клеток клетками, устойчивыми к ВИЧ, и ожидать, что эти клетки улучшат активацию/дифференцировку ВИЧ-специфических цитотоксических CD8 Т-клеток для преодоления вирусной маскировки посредством мутации, а также усилят хелперную функцию В-клеток, что будет способствовать выработке широко нейтрализующих антител. Клеточный продукт AGT103-T оценивается в клиническом испытании RePAIR (NCT04561258).

Генн-преобразованные Т- и В-клетки обладают потенциалом для лечения ВИЧ-инфекции. Мощная и длительная борьба с ВИЧ зависит от устранения специфических иммунных дефектов при ВИЧ-болезни, таких как создание В-клеток для выработки защитных ВИЧ-специфических антител или модификация ВИЧ-специфических Т-клеток для восстановления клеточного иммунного ответа. Восстановление ВИЧ-специфических CD4 T-клеток с помощью генетически модифицированных клеток, устойчивых к истощению, может устранить ключевой дефект, вызванный ВИЧ-инфекцией, опосредовать уменьшение латентного вирусного резервуара и обеспечить иммунный контроль над ВИЧ-болезнью.