По последним оценкам, более 8000 заболеваний имеют моногенное происхождение, часто проявляются в детстве и в тяжелых случаях приводят к преждевременной смерти. Бремя генетических заболеваний остается тревожно высоким, поскольку клиническое лечение многих из них в значительной степени неэффективно. Для моногенных заболеваний, таких как гемоглобинопатии (β-талассемия и серповидно-клеточная болезнь (SCD)), муковисцидоз, гемофилия, болезнь Хантингтона и мышечная дистрофия Дюшенна, востребованы целенаправленные терапевтические стратегии.

Генотерапия направлена на устранение первопричины моногенных заболеваний путем прямого воздействия на уровне ДНК и использования широкого спектра стратегий на основе вирусов или нуклеаз, таких как дополнение, подавление, коррекция или разрушение генов. Добавление генов с помощью вирусных векторов является наиболее клинически продвинутой стратегией; однако в последнее время стало известно, что она сопряжена с такими рисками, как случайная интеграция, инсерционный мутагенез и иммуногенность [1]. Разработка настраиваемых эндонуклеаз, расщепляющих ДНК, таких как мегануклеазы, нуклеазы с цинковыми пальчиками (ZFN), нуклеазы, похожие на эффекторы активатора транскрипции (TALEN) и кластерные регулярно перемежающиеся короткие палиндромные повторы-ассоциированные с РНК-направляемые Cas9 (CRISPR-Cas9), произвела революцию в области редактирования генов и позволила легко манипулировать генами.

С помощью нуклеаз редактирование генов достигается за счет использования присущих ДНК путей репарации, таких как негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологично направленная репарация (HDR), которые активируются после образования двухцепочечных разрывов (DSB). NHEJ-репарация приводит к прямому лигированию разрезанных нитей с образованием InDels (инсерций-делеций) и преимущественно используется для разрушения генов, в то время как HDR следует стратегии направленной коррекции, когда экзогенный шаблон (матрица) для репарации с нужной последовательностью нуклеотидов опосредует процесс. Таким образом, стратегии направленного редактирования генома открывают большие перспективы для создания точных правок и могут преодолеть риски, связанные со стратегиями на основе вирусов [1, 2]. Сравнение стратегий добавления генов и редактирования генома приведено в таблице 1.

Table 1 Comparison of gene addition and genome-editing strategies

HSPC являются идеальными мишенями для генотерапии многих гематологических и иммунологических заболеваний. Использование HSPC для генотерапии обеспечивает потенциальные долгосрочные преимущества, поскольку они пополняют кроветворную систему пациента ген-модифицированными стволовыми клетками. Создание эффективного HDR-редактирования в HSPCs имеет решающее значение для достижения благоприятных терапевтических результатов [3]. В данном обзоре рассматривается применение HDR в генотерапии HSPC, проблемы и возможные решения.

Контрольные точки клеточного цикла и внутренние пути репарации ДНК помогают сдерживать разрушительные геномные повреждения, вызванные различными генотоксическими агентами, экзогенными нуклеазами и стрессом репликации. Большинство геномных повреждений исправляются либо путем NHEJ, либо путем HDR, выбор которого зависит от вырезок ДНК в месте DSB, а также от привлечения репарационных белков. Путь HDR показан на рис. 1.

Fig. 1 HDR gene-editing. Cas9-RNP along with a donor template (AAV6 or ssODN or IDLV) is delivered into HSPCs. Cas9 RNP introduces DNA double-stranded breaks at the target locus and endogenous HDR pathway repairs the DNA damage. During this process, the donor template having homologous sequence to the cut site is inserted into the target locus

53BP1 и BRCA1 являются двумя ключевыми факторами, регулирующими разрывы ДНК. 53BP1 противодействует резекции конца ДНК, образуя комплекс с RIF1, который блокирует привлечение BRCA1 к DSBs ДНК . Таким образом, не-разрезанные DSBs проходят путь репарации NHEJ, который активен на протяжении всей интерфазы. Лишенные резекции (unresected) DSB также активируют CtIP контрольно-пропускной пункт ATM, координируя репарацию ДНК и клеточный цикл. Когда клетки переходят в S-фазу клеточного цикла, CDK-опосредованное фосфорилирование S372 CtIP активирует CtIP и опосредует взаимодействие с BRCA1. Комплекс BRCA1-CtIP способствует дефосфорилированию и репозиционированию 53BP1, создавая в хроматине среду для механизмов резекции концов ДНК. BRCA1-CtIP образует основной комплекс с белками MRE11-RAD50-NBS1 (MRN), и этот комплекс генерирует короткую 3'-нависающую одноцепочечную ДНК на концах DSB благодаря нуклеазной активности MRE11. Образовавшаяся ssDNA немедленно стабилизируется белком репликации A (RPA), и короткая ssDNA далее удлиняется комплексом хеликаз и нуклеаз, который включает белок синдрома Блума (BLM) и экзонуклеазу 1 (EXO1) или WRN и DNA replication helicase/nuclease 2 (DNA2). Кроме того, ssDNA активирует контрольную точку клеточного цикла ATR. Концевая резекция завершается опосредованной BRCA2 загрузкой RAD51, который вытесняет RPA и формирует нуклеопротеиновые филаменты с ssDNA. Нуклеопротеиновые нити RAD51 способствуют гомологичному поиску и вторжению в ремонтный шаблон для начала процесса репарации [4-6].

Комплекс событий после DSB зависит от типа HDR - канонический HDR, синтез-зависимый отжиг нити (SDSA), репликация, вызванная разрывом (BIR), одноцепочечный отжиг (SSA) и одноцепочечная репарация по шаблону (SSTR). Хотя основные этапы, включая резекцию концов, поиск гомологичного шаблона, синтез новой нити c шаблона, лигирование концов ДНК, одинаковы для всех типов HDR, последующие этапы различаются в зависимости от типа HDR. При каноническом HDR 3' нависающая нить ssDNA вторгается в аналогичный ДНК-дуплекс путем вторжения нити, и между 3' нависающей нитью и гомологичным ДНК-шаблоном образуется D-петля. ДНК-полимераза удлиняет 3' вторгающуюся нить, в результате чего D-петля превращается в крестообразную структуру, известную как holliday junction. Разрешение двойного соединения holliday junction приводит к рекомбинации, такой как кроссинговер или не-кроссинговер, с помощью nicking-эндонуклеаз. На пути SDSA резецированная ssDNA подвергается инвазии в гомологичную дуплексную нить, образуя D-петлю, и запускает синтез зарождающейся ДНК. Затем зарождающаяся ДНК диссоциирует для отжига с другой резецированной нитью. При BIR один конец DSB доступен для инвазии нити, а другой конец не связывается с гомологичной последовательностью. Это приводит к асинхронному синтезу новой ДНК, опосредованному ведущей и отстающей нитями. SSA инициируется, когда DSB происходит между двумя повторяющимися последовательностями, которые ориентированы в одном направлении. SSA требует резекции длинного конца в 200 п.н. и не зависит от RAD51. RAD52 связывается с покрытыми RPA концами ssDNA и отжигает резецированные одноцепочечные гомологии к шаблону ДНК. В ходе репарации образуются одноцепочечные участки, прилегающие к разрыву, которые распространяются на повторяющиеся последовательности; таким образом, комплементарные нити могут отжигать друг с другом. Наконец, гетерогенные участки удаляются нуклеазой ERCC1-XPF, и разрывы ДНК лигируются. В SSTR-пути одноцепочечный шаблон ДНК отжигается к резецированной нити ДНК, и удлинение ДНК происходит с помощью дельта ДНК-полимеразы. Теперь расширенный продукт ДНК отделяется от шаблона, и концы ДНК лигируются с помощью лигазы1 или ее аналогов [7, 8]. Полученная в результате новая нить ДНК идеально восстанавливается с использованием последовательностей матрицы (рис. 1).

Редактирование генов основано на использовании искусственно созданных нуклеаз для распознавания и разрезания специфических последовательностей ДНК и последующего использования врожденного механизма ДНК клетки для восстановления вызванных нуклеазой DSB. Добавление шаблона гомологичной ДНК сайт-специфичными нуклеазами переключает врожденный путь репарации ДНК на HDR, вызывая нуклеотидные изменения мишени. Однако только клетки в S/G2-фазах имеют фосфорилированный CtIP, чтобы свести на нет антагонизирующий эффект 53BP1 на BRCA1 и, таким образом, ответить на добавление матрицы для HDR. Все шаблоны доноров HDR содержат левую (5') и правую (3') гомологичные последовательности, фланкирующие сайт разреза, для использования пути HDR. Широкий спектр полученных от вирусов или синтетически созданных двухцепочечных и одноцепочечных донорных HDR-шаблонов в настоящее время тестируется на предмет изменения одного нуклеотида для вставки большого трансгена. Вирусные доноры для HDR включают лентивирусные векторы с дефектом интегразы (IDLVs), аденовирус 5/35 серотипа (AdVs) и адено-ассоциированный вектор (AAV), а также одноцепочечные олиго-дезоксинуклеотиды (ssODNs) - невирусный вариант.

IDLV изначально были разработаны как альтернатива интегрирующим вирусным векторам, чтобы избежать риска, связанного с инсерционным мутагенезом. Мутация D116 в каталитическом домене интегразы инактивирует интегразу, опосредованную интеграцией вирусной ДНК, и в результате IDLV остается эписомным, который рассеивается во время деления клеток. Это переходное свойство делает IDLV подходящим донором HDR. IDLV представляют собой свободные двухцепочечные ДНК-векторы с потенциальной доставкой груза до 10 кб [9]. Шаблоны IDLV были протестированы в HSPC для коррекции мутаций SCID-X1 и SCD. Результаты показали незначительные уровни HDR (2-18%) с пост-трансплантационным снижением частоты HDR (0,27-2%) [10-12]. Низкая частота модификации мишени объясняется прямой рекомбинацией IDLVs с сайтом-мишенью до начала HDR, что приводит к образованию конкатемер. По сравнению с другими донорами HDR, доноры IDLV проявляют пониженные цитотоксические свойства, и предполагается, что достижения в протоколах лентивирусной трансдукции, такие как предварительная обработка HSPCs циклоспорином H, могут быть распространены на шаблоны доноров IDLV для повышения их эффективности [13].

AdV представляют собой dsDNA-векторы с белковым покрытием концов. Обычно используемые векторы AdV происходят от серотипа 5, модифицированного для вставки более крупного трансгена (~ 35 kb). AdV обладают широким тропизмом и высокой эффективностью трансдукции [14]. Благодаря большой способности переносить гены, они используются для доставки генов, кодирующих эндонуклеазы, расщепляющие ДНК, и ДНК-шаблонов для направленной вставки. Химерный гибрид векторов серотипов 5 и 35 под названием Ad5/35 был использован в качестве шаблона для HDR, и он генерирует низкоэффективные HDR-конверсии (~ 2%) в HSPC пуповинной крови (ПК) по локусу гена HBB [12].

С момента открытия вектор AAV является важным компонентом для генотерапии. Однако наличие антител против AAV ограничивает его применение в генотерапии in vivo. Векторы AAV предназначены для встраивания умеренно больших ДНК-трансгенов (~ 5 кб). Серотип AAV6, который проявляет тропизм к HSPCs, широко используется в качестве вектора доставки донора. Донорские шаблоны AAV6 имеют длинные гомологические ветви ~ 300-800 п.н. и обеспечивают высокую частоту HDR в HSPC и некоторых других первичных типах клеток [15]. Сообщается, что AAV6 демонстрирует успешную вставку репортерных конструкций в мишень до 91%, а доноры AAV6 демонстрируют эффективную HDR-опосредованную коррекцию серповидно-клеточной мутации, чем ssODN (50-60% против 29,6%) in vitro, но эффективность значительно снижается в долгосрочных прижившихся клетках по сравнению с ssODN (32% против 17,5% %) [12, 16-18].

ssODN представляют собой короткие олигосомы длиной не более 200 п.н. с гомологичными рукавами в диапазоне 30-60 нуклеотидов, фланкирующими желаемое нуклеотидное изменение. По сравнению с вирусными векторами, ssODN обладают рядом преимуществ, таких как простота конструкции, воспроизводимость, короткое время производства и относительно низкая стоимость. Это делает их пригодными для высокопроизводительного применения. Асимметричные ssODN (соответствующие сайту разреза) являются эффективными HDR шаблонами, чем симметричные, а олигосомы, комплементарные нецелевой нити, очень эффективны, так как при расщеплении Cas9 освобождается 3' конец нецелевой нити, что делает ее пригодной для ssODN. Асимметричная ssODN (PAM проксимального нуклеотида 91 и PAM дистального нуклеотида 36, фланкирующего точку разрыва генома) обеспечивает скорость HDR до 60% в клетках 293-T [12, 15]. Однако такие выводы о конструкции ssODN, определяющей эффективность HDR, не одинаковы для разных типов клеток, локусов и доноров. В HSPC были получены целенаправленные исправления в широком диапазоне локусов, таких как HBB и IL2RG [19]. Редактирование гена HBB с совместной доставкой ZFN и ssODN приводит к частоте HDR 5-15%, а у трансплантированных животных эффективность снижается до 9% [12]. Это указывает на необходимость разработки оптимизированных стратегий для повышения частоты HDR путем коррекции на основе ssODN. ssODN являются предпочтительными субстратами для SSTR, а механизм, задействованный в ssODN-опосредованной репарации, заключается в прямом отжиге от целевой ДНК. Подходы ssODN полезны для коррекции небольшого количества нуклеотидов [15]. Основной недостаток подхода ssODN в том, что он не может быть применен для вставки большого трансгена. Недавно группа Marson's преодолела это ограничение, используя длинный ssODN, и добилась направленной интеграции конструкции CAR размером более 1 кб с эффективностью до 12,3% в локус TRAC Т-клеток [20]. Такой подход еще предстоит проверить на HSPC.

Коррекция дефектного гена путем целенаправленной генной манипуляции является привлекательной стратегией в генотерапии HSPC. Редактирование HSPC обеспечивает долгосрочное лечение, так как эти клетки находятся на вершине гемопоэтической иерархии и их эффект может сохраняться во всех линиях, обеспечивая терапевтические преимущества как для гематологических, так и для иммунологических заболеваний. Существует множество исследований, демонстрирующих коррекцию мутаций с помощью HDR-редактирования генов в HSPCs для применения генотерапии (табл. 2).

Таблица 2 Стратегия терапевтического HDR редактирования генов для лечения генетических заболеваний с использованием ZFNs, TALENs и Cas9

Гемоглобинопатии: SCD и β-талассемия - дефекты, связанные с производством качественных цепей β-глобина (SCD) и зависимых от количества (β-талассемия) [21]. SCD возникает из-за точечной мутации в экзоне HBB (A >T или E6V), коррекция мутации была предпринята с помощью различных типов донорских конструкций HDR. Почти 50% аллелей E6V (HbS) были возвращены к аллелям дикого типа с помощью RNP, донора AAV6 и отбора клеток HDR. Аналогичным образом, 33% коррекции было достигнуто при использовании RNP и ssODN-опосредованной стратегии без отбора/обогащения, и до 23,4% исправленных аллелей сохранялись в течение длительного времени в приживленных гемопоэтических стволовых клетках [22]. В другом исследовании эффективность коррекции составила 24,5 ± 7,6% in vitro, а 10% скорректированных клеток обладали потенциалом долгосрочной репопуляции [23]. В соответствии с этим, направленная коррекция варианта сплайсинга IVS1-110 при β-талассемии была достигнута с помощью мРНК Cas9 и ssODN с эффективностью 8% [24]. Коррекция широкого спектра мутаций при β-талассемии требует персонализированных HDR-опосредованных подходов к коррекции генов. В качестве альтернативы мутационно-специфическому подходу, разработан универсальный подход, который включает реактивацию подавленного в процессе развития β-глобина для компенсации сниженных/дефектных цепей β-глобина. Известно, что несколько мишеней, таких как - 175 T>C, - 195 T>C и - 113 A>G HPFH мутации, вызывают повторную активацию γ-глобина и успешно продемонстрированы на эритроидных клеточных линиях K562 и HUDEP-2. Эти мишени еще предстоит проверить на HSPCs [25].

Гемофилия: Клинические испытания генотерапии, направленной на печень, с использованием векторов AAV показывают многообещающие результаты при гемофилии, но существование антител против AAV ограничивает применение генотерапии in vivo. В качестве альтернативы был разработан подход к редактированию генов HSPC ex vivo, при котором α-глобиновая направленная интеграция трансгена FIX-R338L позволяет экспрессировать FIX в эритроидных клетках [26]. Это указывает на то, что HDR редактирование генов в HSPC также может быть использовано в качестве системы доставки терапевтических белков.

Дефицит пируваткиназы (PKD): Мутации в гене пируваткиназы Isozymes R/L (PKLR) вызывают преждевременное разрушение эритроцитов, что приводит к болезни PKD. Вставка оптимизированной по кодонам кДНК пируваткиназы в ее эндогенный локус и отбор целевых клеток пуромицином для достижения 70% клеток с исправленным геном - интересный подход. Однако плохое приживление in vivo отобранных in vitro клеток (менее 1% HDR клеток) остается большим препятствием для этого подхода [27].

Х-сцепленная хроническая гранулематозная болезнь (X-CGD): Мутации в гене бета-цепи цитохрома В-245 (CYBB) приводят к дефектной продукции антимикробных реактивных форм кислорода. Мутация гена CYBB была исправлена с помощью ZFNs в сочетании с донорами AAV6 в HSPC, полученных от пациентов с ХГД, что позволило достичь 58% HDR in vitro и 6-16% in vivo [28]. CRISPR/Cas9 RNP и ssODN-опосредованная коррекция точечной мутации C676T с эффективностью in vitro 20% и in vivo 13% была достигнута [29].

Х-сцепленный тяжелый комбинированный иммунодефицит (SCID-X1): Мутации в гене γ цепи (γc), кодирующем гамма субъединицу рецептора интерлейкина 2 (IL2RG), основной субъединицы кодирующей общую γ цепь (γc), приводят к SCID-X1 [30]. Эндогенная вставка cDNA IL2RG с помощью ZFN с IDLV или AAV6 была достигнута с эффективностью 10% и 25% в HSPC дикого типа и пациента, соответственно [31]. Аналогично, с помощью CRISPR-Cas9 и доноров AAV6 была достигнута частота вставки до 45% в HSPCs пациента in vitro и функциональная коррекция в 10-20% LT-HSCs in vivo [30].

Синдром Вискотта-Олдрича (WAS): Мутации в гене WAS приводят к снижению уровня белка WAS. CRISPR/Cas9-опосредованная вставка кДНК WAS в эндогенный сайт была достигнута у 47,9% в HSPCs пациентов, что привело к восстановлению экспрессии WASp в 49% клеток. Исследования in vivo показали частоту целевой инсерции 40,7% и 37% в hCD45+ клетках и hCD19+ В-клетках, соответственно [17].

Иммунная дисрегуляция, полиэндокринопатия, энтеропатия, Х-сцепленный (IPEX) синдром: IPEX синдром возникает из-за мутаций в гене fox head box protein 3 (FOXP3), критического транскрипционного фактора, необходимого для регуляторных Т-клеток (Tregs). С помощью CRISPR-Cas9/AAV6-опосредованного редактирования генов кДНК FOXP3 была вставлена в его эндогенный локус, и экспрессия FOXP3 была восстановлена в 29±8% отредактированных HSPC, которые способны частично восстанавливать Tregs (CD4+ CD25+ FOXP3+) с сохранением 60% отредактированных клеток in vivo [32].

Мукополисахаридоз I типа: Мутации в гене альфа-L-идуронидазы (IDUA) снижают экспрессию IDUA, вызывая накопление гликозаминогликанов в лизосомах, что приводит к развитию заболевания [33, 34]. Направленная вставка гена IDUA в локус CCR5 safe harbor с использованием доноров AAV6 привела к повышению частоты HDR до 54%±10 и 44%±7 в СВ и PB HSPCs, соответственно, и пятикратному снижению долгосрочного приживления измененных по гену клеток [34].

Болезнь Гоше: Мутации в гене глюкоцереброзидазы приводят к недостаточному уровню глюкоцереброзидазы (GCase). В HSPC целенаправленная вставка кассет глюкоцереброзидазы в локус CCR5 safe harbor5 человека с использованием донорских шаблонов AAV6 привела к частоте HDR до 51,5±9,1% [33]. Эта стратегия экспрессии, специфичная для моноцитов/макрофагов, обеспечила сверхфизиологическую экспрессию GCase in vivo.

Гомологически-направленная репарация имеет большой потенциал в генотерапии, так как позволяет точно настраивать геном, но эта техника не свободна от ограничений. Хотя методы редактирования генов хорошо зарекомендовали себя в течение многих лет, стратегии манипуляций на основе HDR, особенно в HSCs, нуждаются в тщательной импровизации для успешного клинического применения.

В отличие от естественной гомологичной рекомбинации, где сестринские хроматиды выступают в качестве корректирующего шаблона, эксперименты по редактированию генов, опосредованные HDR, требуют экзогенной матрицы донорской ДНК. Донорский шаблон может быть настроен универсальным образом для включения модификаций ДНК от одного нуклеотида до нескольких килобаз. Однако для эффективного редактирования требуется сильная синергия РНК и ssODNs, а добавление донорского шаблона может помешать потенциалу доставки. Важно отметить, что донорская матрица требует тщательной характеристики длины гомологичных плеч, полярности, PAM-защиты и модификаций основы для эффективного HDR [15].

Основной проблемой при использовании олиго-доноров является вызывание иммунного ответа в клетках-мишенях. Олиго-доноры могут имитировать проникновение патогена, и клетка-хозяин, неспособных отличать одно от другого, активирует опосредованный интерфероном гамма (IFNγ) воспалительный иммунный ответ, приводящий к апоптозу. Кроме того, свободные/открытые концы ДНК в ssODNs подвержены атаке экзонуклеаз, что снижает доступность донорских матриц для HDR. Хотя покрытые (capped) концы ДНК в плазмидах AAV обеспечивают лучшую стабильность, их больший размер увеличивает нуклеотидную нагрузку [35, 36] Опосредованная генным редактированием клеточная токсичность также запускается p53-путем, поскольку p53 являются непосредственными ответчиками на повреждение ДНК, что приводит к апоптозу и постепенному уменьшению числа клеток. Активность р53 повышается донором при введении ДНК- матриц, генерируя большую цитотоксичность, чем при редактировании с помощью RNP [37].

Редактирование HDR в HSPCs является сложной задачей, так как репарация с помощью матрицы разрешена только во время S/G2 фаз клеточного цикла. Следовательно, HSPC и, в частности, примитивные HSC, демонстрируют низкую восприимчивость к редактированию HDR. Хотя стимуляция цитокинами и длительная культура используются для того, чтобы подтолкнуть HSPC к вступлению в цикл, эти условия также связаны с нарушением приживления HSPC. Обычные стратегии синхронизации клеточного цикла также не всегда подходят для HSPC, поскольку нет данных о потенциале приживления синхронизированных HSPC [38].

Общая эффективность редактирования генов HDR остается низкой по сравнению с не-использующими шаблоны механизмами коррекции - NHEJ и MMEJ. В то время как эффективность редактирования генов NHEJ может достигать более 90%, нет никаких сообщений об эффективности редактирования генов HDR выше 50%. Хотя отбор HDR-положительных клеток может увеличить частоту HDR-редактированных клеток, такой подход к отбору может быть невозможен при редактировании генов на основе ssODN. Кроме того, большие инсерции, опосредованные HDR, происходят с гораздо меньшей частотой, чем однонуклеотидные изменения и маленькие инсерции. Кроме того, в разных локусах частота событий редактирования варьирует из-за статуса хромосомы и присущего им смещения в сторону NHEJ/MMEJ [39, 40].

В то время как менее 50% HSPC подвергаются редактированию генов с помощью HDR in vitro, эксперименты по ксенотрансплантации выявили дополнительную проблему снижения частоты HDR-редактированных клеток in vivo. Редактирование HDR показало неутешительные результаты в экспериментах по трансплантации, с резким снижением приживления HDR клеток. Это может быть связано с одним из следующих факторов: уровень HDR выше в популяции предшественников, чем в примитивных HSCs и долгоживущих репопулирующих клетках, которые устойчивы к репарации с помощью матриц ДНК/клеток, подвергшиеся HDR, которые теряют стволовость и не сохраняются in vivo. Таким образом, всегда существует фундаментальный дисбаланс между HDR-редактированием и стволовостью HSCs [30, 40-42].

HSPC, отредактированные с помощью HDR, будут содержать гетерогенный пул отредактированных клеток, либо гомозиготных, либо гетерозиготных, либо только с InDel. В некоторых сценариях клетки с InDels могут вызывать беспокойство. ssODN-опосредованная коррекция мутации SCD в локусе HBB приводит к коррекции вызывающей болезнь мутации, но часть клеток с InDels может нарушить экспрессию β-глобина, что приводит к фенотипу, похожему на талассемию. Такое непреднамеренное редактирование может не вызывать беспокойства при многих заболеваниях. Однако точное редактирование желательно [43].

Несмотря на ограничения и трудности HDR-опосредованного редактировании генов, их потенциал в направленном редактировании является многообещающим. Поэтому на протяжении многих лет изучается несколько стратегий для улучшения HDR-редактирования.

Ингибирование белков, участвующих в различных этапах пути репарации NHEJ, является одним из основных подходов к повышению эффективности HDR. В то время как стабильный нокдаун ключевых белков репарации приводит к пагубным последствиям, использование малых молекул обеспечивает лучшее решение для преходящего ингибирования. SCR-7, NU7441, NU7026, STL127685, IC86621, M3814 и KU-0060648 - некоторые из малых молекул, испытанные в отношении ингибирования NHEJ и повышения эффективности HDR. SCR-7 связывается с ДНК-связывающим доменом лигазы IV, ингибируя NHEJ и повышая частоту HDR в клеточных линиях млекопитающих. Обработка SCR7 приводила к аддитивному эффекту в сочетании с белками аденовируса 4 (Ad4) E1B55K и E4orf6 и улучшала вставки больших трансгенов в локус Kell. NU7026, ингибитор ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-ПК), улучшает HDR в iPSCs. Некоторые другие ингибиторы DNA-PK, такие как NU-7441 и KU-0060648, увеличили плазмидный и ssODN-опосредованный HDR в клетках HEK 293 T. NU-7441 увеличил эффективность опосредованного донором AAV6 HDR в iPSCs. IC86621 и M3814 усиливают HDR в клетках V3 и клетках k562, соответственно. CRISPY Mix (смесь малых молекул: трихостатин А, MLN4924, NU7026 и NSC 15520), как показано, увеличивает HDR в iPSCs [5-7, 19]. Поскольку большинство молекул для ингибирования NHEJ были протестированы в различных типах клеток человека, но не в HSPC, вышеупомянутые молекулы могут быть протестированы в HSPC для повышения HDR.

L755507, ресвератрол, брефельдин А, RS-1, MLN4924 и NSC 15520 - это немногие молекулы, протестированные для усиления HDR. И L755507, и ресвератрол повысили эффективность HDR в эмбриональных фибробластах свиньи за счет увеличения экспрессии ключевых факторов HDR. Кроме того, L755507 и брефельдин способствуют вставке большого фрагмента в локус ACTA2 в эмбриональных стволовых клетках мыши (mESCs). Фаррерол, растительное соединение, повышает скорость HDR в клетках HEK293FT и mESCs [44]. RS-1 усиливает HDR в клеточных линиях остеосаркомы HEK293A и U2OS путем рекрутирования RAD51. MLN4924 увеличивает степень резекции концов ДНК в месте двухцепочечного разрыва и способствует HDR в iPSCs. NSC 15520, блокирующий взаимодействие RPA с RAD9 и с p53, увеличивает HDR в iPSCs [5, 6, 19]. Хотя для увеличения HDR используется несколько NHEJ-независимых факторов, эффективность малых молекул варьирует в зависимости от типа клеток и генного локуса. Функциональные последствия воздействия малых молекул на ген-отредактированные HSPC требуют тщательного подтверждения, поскольку они еще не изучены. Концентрация малых молекул и экспериментальные условия должны быть оптимизированы для достижения высокой эффективности HDR в HSPC.

Показано, что состояние хроматина влияет на редактирование генов HDR, а изменение состояния хроматина через модуляцию активности HDAC и октамерного комплекса гистонов вокруг ДНК влияет на интеграцию донорской ДНК. Энтиностат (ингибитор HDAC1/2/3) и панобиностат (ингибитор Pan HDAC) увеличивают скорость HDR в клеточных линиях HEK [45]. TSA, ингибитор HDAC 1/2, увеличивает частоту HDR на 40% при использовании с RNP и донором AAV6 [46]. Вальпроевая кислота (VPA), ингибитор HDAC класса I (HDAC1,2,3,8) и IIa (HDAC4,5,7,9), усиливает HDR в эмбриональных стволовых клетках человека [47]. Аналогично, ромидепсин (класс I, IIa, IIb (HDAC6,10) и IV (HDAC11)) и VPA повышают эффективность нацеливания генов в mESCs [48]. Все это позволяет предположить, что ингибирование HDAC облегчает доступ Cas9 к ДНК мишени и увеличивает частоту редактирования генов, тем самым повышая эффективность HDR.

Состояние клеточного цикла влияет на результаты HDR, и одним из возможных вариантов является увеличение доли клеток в S и G2 фазах клеточного цикла. Ограничение редактирования генов фазой S/G2 путем слияния Cas9 с геминином позволило добиться преходящей активности Cas9 в фазе S/G2, тем самым увеличив соотношение HDR/NHEJ. Одновременная обработка hGemCas9 и ингибитором циклин-зависимой киназы 1 RO-3306 показала увеличение уровня HDR в HSPCs. XL-413, ингибитор связанной с циклом 7 протеинкиназы (CDC7), задерживал клетки в фазе S и увеличивал HDR. HSPC также были допущены к контролируемому циклу для увеличения HDR в 5-6 раз, а затем с помощью рапамицина и CHIR99021 был введен режим покоя. Нокодазол, ингибитор полимеризации микротрубочек, и афидиколин, ингибитор фазы G1/S, увеличивали скорость HDR в клетках HEK 293. Ингибитор полимеризации микротрубочек ABT-751 увеличил интеграцию генов в HSPCs [5, 19]. Хотя в HSPC были использованы различные стратегии синхронизации клеток, влияние синхронизации на стволовость, генетическую стабильность и потенциал дифференцировки стволовых клеток требует дальнейшего изучения.

Токсичность клеток зависит от типа используемого донорского шаблона, при этом dsDNA проявляет более высокую токсичность, чем олиго ssDNA. Химические модификации, такие как фосфоротиатные (PS) модификации на 3' и 5' концах ssODN, снижают экзонуклеазную атаку, тем самым уменьшая клеточную токсичность [35]. Поскольку шаблон голой ДНК потенциально токсичен для клеток, использование шаблона хроматиновой ДНК, который, по-видимому, является естественной формой ДНК, снижает токсичность, связанную с шаблоном [49]. Индуцированные нуклеазой DSB приводят к активации пути p53, что влияет на выживание клеток. Уменьшение опосредованных р53 эффектов с помощью доминантно-негативного белка р53 помогает снизить токсичность донорского шаблона и повысить жизнеспособность отредактированных HSPC [37].

Показано, что увеличение глобальной концентрации доноров оказывает прямое влияние на события HDR, но влияет на жизнеспособность HSPC. В качестве альтернативы донорская ДНК может быть сконцентрирована в местах расщепления Cas9 путем физического связывания ssODN с Cas9 с помощью различных химических соединений. Конъюгация Cas9-ssODN с помощью тиол-малеимидной химии увеличила HDR в клетках INS-1E (рис. 2a). Слитые белки Cas9, соединенные со связанным с O6-бенилгуанином ssODN (рис. 2b), увеличили скорость точной коррекции в клетках HEK 293 T. ssODN, ковалентно связанный с белком Cas9-porcine circovirus 2 rep посредством слитой эндонуклеазы HUH, увеличил HDR в HEK293T (рис. 2c). В системе S1mplex биотинилированный донор ssODN, связанный с гРНК, модифицированный стрептавидин-аптамерным комплексом, увеличивал соотношение HDR/indel в HSPCs (рис. 2d). Аналогично, модифицированный биотином ssODN связан с авидином, слитым с Cas9 через гибкий линкер (рис. 2e), что позволило добиться более высокой частоты HDR в эмбрионах мыши (рис. 2e). Тестирование этих подходов в HSPCs может дать интересные результаты [5, 50].

Fig. 2 Strategies for increasing the donor availability at Cas9 cut site. a Thiol-maleimide chemistry-based Cas9 and ssODN conjugation. A short oligonucleotide adaptor is attached to the Cas9 via thiol-maleimide and appended with ssODN by base pairing. b Cas9-ssODN linking using snap-tag technology. Snap-tag fused Cas9 is covalently linked to the BG coupled ssODN. c RNP-ssODN tethering using HUH endonuclease. Cas9 is fused to the HUH endonuclease PCV Rep protein via H4-2 linker. Then, ssODN is covalently attached to the HUH endonuclease PCV. d In S1mplex system, sgRNA modified using streptavidin-binding aptamer is linked to the biotinylated ssODN, forming RNP-ssODN complex. e Cas9 is fused to the avidin via flexible linker and Cas9 is linked to biotin modified ssODN. f Direct fusion of CtIP and Cas9 nuclease

Факторы, способствующие HDR, были широко протестированы для применения в редактировании генов, и различные факторы, такие как RAD51, RAD52, RAD54 и BRCA1, были избыточно экспрессированы во всем мире для повышения HDR. Показано, что коэкспрессия RAD51/RAD54 повышает эффективность HDR в клеточных линиях HT-1080. Аналогично, экспрессия либо дикого типа, либо гипер-рекомбинационных вариантов BRCA1 увеличивала эффективность HDR в клеточных линиях HEK-293A. RAD52 motif protein 1 (RDM1) предотвращает остановку клеточного цикла G2/M и тем самым повышает частоту HDR, а вариант слияния Cas9-RDM1 еще предстоит испытать на клетках человека, включая HSPCs. Ингибирование 53BP1 убиквитиновым вариантом (i53) повысило эффективность HDR как с AAV6, так и с донором ssODN. Совместная экспрессия обоих факторов, dn53BP1 и RAD 52, увеличила частоту HDR в нескольких локусах в клетках HEK 293 и iPSCs. В целом, эта технология может быть применена к HSPCs для улучшения HDR и достижения более высоких показателей коррекции генов. Хотя для достижения глобальной экспрессии факторов, способствующих HDR, используется несколько стратегий, для успешной генной терапии на основе HDR в HSPC необходимо дальнейшее совершенствование [4, 51, 52].

Наличие инновационных инструментов открывает возможности для создания терапевтических препаратов нового поколения для лечения генетических заболеваний. Быстрая эволюция инструментов редактирования генов и передовой технологии CRISPR/Cas9 позволила разработать более эффективные и осуществимые подходы к генотерапии, чем вирусные векторы. Отчеты о редактировании генов с помощью технологии NHEJ показали многообещающие результаты в текущих клинических испытаниях. Редактирование генов HDR еще не дошло до клинических исследований из-за низкой эффективности и сложностей, связанных с этим. Новые технологии, такие как редактирование оснований и прайминг, представляют собой серьезную проблему для HDR-редактирования, поскольку их эффективность превосходит HDR-редактирование генов. Тем не менее, одобрение по IND подхода UCSF/UCLA к Cas9-ssODN-опосредованной коррекции SCD и подхода Стэндфордского университета к Cas9-AAV6-опосредованной коррекции SCD подают много надежд на HDR редактирование генов. С успехом редактирования генов на основе HDR мы ожидаем, что в будущем мы станем свидетелями успеха целенаправленной генотерапии нескольких генетических заболеваний. Наряду с техническими исследованиями и усовершенствованием генотерапии, важно также разработать экономически эффективный лечебный модуль, чтобы терапия была доступна большинству пациентов, особенно в развивающихся странах.