Наследственная тирозинемия типа 1 (НТ1) - это аутосомно-рецессивная врожденная ошибка метаболизма, которая характеризуется неспособностью метаболизировать тирозин. Вызванная дефицитом фермента фумарилацетоацетат гидролазы (FAH)¹, НТ1 вызывает накопление токсичных метаболитов в печени, что приводит к тяжелому окислительному повреждению. У таких пациентов развивается фиброз, цирроз, высокая частота гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) и печеночная недостаточность в очень молодом возрасте, если их не лечить^2,3. Фармакологическое лечение НТ1 существует в виде 2-(2-нитро-4-трифторметилбензоил)-1,3-циклогексанедиона (NTBC), препарата, который ингибирует предшествующий фермент 4-гидроксифенилпируват диоксигеназу (HPD), тем самым уменьшая образование токсичных метаболитов, ответственных за прогрессирование заболевания печени, таким образом, по существу преобразуя заболевание в наследственную тирозинемию типа 3 (HT3) с более доброкачественным фенотипом4. У большинства пациентов NTBC значительно улучшает фенотип НТ1, и если она начата до 1-месячного возраста, то, по-видимому, способна уменьшить развитие HCC, по крайней мере, в первые три десятилетия жизни⁵. Однако еще предстоит выяснить, сохраняется ли профилактика HCC во взрослом возрасте, поскольку внедрение этого препарата произошло в 1990-х годах⁶. Ряд сообщений о случаях и серий указывают на развитие фиброза, цирроза и HCC, несмотря на терапию NTBC особенно когда терапия NTBC была отсрочена^7-10. Частота развития HCC в течение ограниченного периода наблюдения за пациентами, получавшими лечение NTBC, составляет более 1%, если лечение начато до 1 года, 7%, если лечение начато в возрасте от 1 до 2 лет, 21%, если лечение начато в возрасте от 2 до 7 лет, и 35%, если лечение начато после 7 лет¹¹. Поэтому эти пациенты нуждаются в пожизненном наблюдении за HCC с определением уровня альфа-фетопротеина (AFP) каждые 3-6 месяцев⁶. Кроме того, у пациентов HT1, получающих лечение NTBC наблюдается прогрессирующее нейрокогнитивное снижение, несмотря на оптимальную дозировку NTBC возможно, из-за длительного воздействия повышенного уровня тирозина, возникающего при приеме препарата^12-14. Хотя точные патофизиологические механизмы, лежащие в основе этих нарушений, не ясны⁶, два исследования выявили корреляцию между соотношением фенилаланина и тирозина у этих пациентов и IQ^15,16. В пользу этой теории говорит и тот факт, что HT3, заболевание, вызванное дефицитом того же фермента, который блокирует NTBC, также сопровождается неврологическими проявлениями, включая задержку развития^17-20. Осложнения, связанные с лечением NTBC, помимо низкого IQ, включают дефицит внимания, проблемы с памятью и обработкой информации, психомоторные и поведенческие проблемы, нарушение исполнительных функций и социального познания^21-28. При ежедневном дозировании NTBC, а также частом тестировании, многие пациенты сталкиваются с проблемами соблюдения режима терапии NTBC во втором и третьем десятилетиях жизни^26,27. Несоблюдение режима терапии NTBC является ключевым фактором прогрессирования заболевания у пациентов с НТ1²⁹. На сегодняшний день единственным терапевтическим вариантом для пациентов, рефрактерных к NTBC или с прогрессированием заболевания, несмотря на терапию NTBC, и единственным методом лечения HT1 является трансплантация печени.

Генотерапия может предложить пациентам с НТ1 альтернативный, менее инвазивный метод лечения. Наша группа ранее продемонстрировала, что перенос лентивирусных (LV) генов ex vivo с последующей аутологичной трансплантацией исправленных гепатоцитов является лечебным как в мышиной, так и в свиной модели HT1³⁰. Подход ex vivo эффективен, но аутологичная трансплантация требует частичной гепатэктомии при заболеваниях печени, чтобы избежать иммунного отторжения, которое может произойти при трансплантации аллогенных гепатоцитов. Поэтому направленная на печень генотерапия in vivo представляет собой привлекательную нехирургическую альтернативу для лечения врожденных ошибок метаболизма печени.

Ограниченная биохимическая коррекция мышиной модели HT1 была достигнута in vivo с помощью ретровируса, аденовируса и адено-ассоциированного вируса (AAV), опосредованного переносом генов^31-33, а также с помощью РНК-направленного CRISPR/Cas9-опосредованного редактирования генома и перепрограммирования метаболических путей^34,35. До сих пор ни один из этих методов in vivo не был протестирован на более клинически значимой крупной животной модели HT1. Мышиная модель не повторяет некоторые из наиболее важных аспектов человеческого фенотипа, поскольку у мышей HCC развивается независимо от фиброза и цирроза, а у свиней и людей - нет^36. У мышей HCC развивается, несмотря на длительное лечение NTBC, и происходит это в условиях дисплазии гепатоцитов, стеатоза печени, анизоцитоза и лимфоцитарных инфильтратов, но не распространенного фиброза и цирроза, как это происходит у пациентов с HT1³⁷. На данный момент хорошо известно, что развитие HCC у мышей происходит через совершенно иной набор молекулярных механизмов по сравнению со свиньями и людьми, с различиями, включая, но не ограничиваясь следующим: базальная скорость метаболизма у мышей примерно в семь раз выше, чем у человека, что влияет на уровни эндогенных оксидантов и других мутагенов, которые образуются как побочные продукты нормального окислительного метаболизма; разница в способе активации или нейтрализации многих канцерогенов; склонность к развитию рака мезенхимальных тканей вместо карцином эпителиально-клеточного слоя, более распространенных у человека; высокая частота спонтанной иммортализации клеток у мышей, возможно, объясняемая конститутивной экспрессией теломеразы, которая обычно не экспрессируется в клетках человека; различия между двумя видами в относительном вкладе путей p53 и ретинобластомы в клеточное старение; и ключевые различия в сигнальных требованиях для трансформации клеток, где у мышей активация только путей p53 и Raf-MAPK кажется достаточным для опосредования туморогенной трансформации, в то время как в фибробластах человека для достижения того же результата необходимо возмущение шести или более путей^38,39. Кроме того, эффективность терапии на основе AAV у людей снижается из-за предсуществующих нейтрализующих антител к вирусному вектору, которые образуются после естественного воздействия вируса дикого типа, а в случае заболевания печени - из-за иммуноопосредованной очистки AAV-трансдуцированных гепатоцитов⁴⁰. То же самое относится и к иммунному ответу на бактериальный Cas9⁴¹. Системы на основе AAV использовались у взрослых пациентов с гемофилией и другими заболеваниями, но эта терапия не принесла бы пользы пациентам HT1, поскольку повреждение печени с последующей гибелью и регенерацией гепатоцитов приводит к потере экспрессии трансгенов в гепатоцитах с течением времени^42-44.

В человеческих условиях ВИЧ-производные LV-векторы имеют ряд потенциальных преимуществ перед AAV-векторами. Во-первых, низкая распространенность ВИЧ-инфекции среди людей снижает вероятность того, что иммунный ответ снизит эффективность терапии⁴⁵. Во-вторых, векторы LV лучше подходят для лечения определенных заболеваний благодаря своей способности переносить более крупные генные вставки⁴⁶. Наконец, у пациентов с HT1 и в педиатрической популяции, где высока текучесть гепатоцитов, использование интегрирующих векторов LV может быть ключом к стабильной, пожизненной экспрессии желаемого трансгена, в то время как эписомальные векторы будут постепенно размываться в процессе репликации клеток до полной потери⁴⁷. Это преимущество усиливается в HT1, поскольку FAH-положительные гепатоциты отбираются за счет поврежденных FAH-отрицательных гепатоцитов.

Генотерапия с использованием LV в печени дала многообещающие результаты на крупной животной модели гемофилии В; Cantore и др. показали, что внутрипортальное введение вектора LV, несущего трансген cFIX, способно безопасно обеспечить стабильный клинический эффект у собак с этим заболеванием, и тем самым обеспечили доклиническое доказательство концепции in vivo использования векторов LV в генотерапии печени на своей модели гемофилии⁴⁸. В данном исследовании мы оценили эффективность и безопасность генотерапии in vivo с использованием LV-векторов в печени для лечения предракового метаболического заболевания HT1.

Доставка ЛВ-вектора в воротную вену in vivo хорошо переносится свиньями

Fig. 1: LV-FAH administration to pigs.

a Schematic repr esentation of the lentiviral vector carrying the human FAH cDNA under control of the human alpha-1-antitrypsin (AAT) promoter. LTR long terminal repeat, Ψ psi packaging sequence, RRE Rev-responsive element, cPPT central polypurine tract; LTR/ΔU3, 3' long terminal repeat with deletion in U3 region. b Acute inflammatory response after systemic LV-FAH administration compared to reference portal vein LV-GFP delivery. No significant differences in TNF-alpha or IL-6 concentrations or white blood cell count were found between the two routes of administration. Note that 30,000 pg/mL represents the upper limit of detection for the TNF-alpha assay. c Vital signs and TNF-alpha levels during and after portal vein delivery of LV-FAH in four FAH-/- animals. Heart rate and blood pressure remained stable throughout infusion, and TNF-alpha levels were within normal range immediately post-infusion and at 8 and 45days post-treatment.

Основываясь на этих результатах, мы применили минимально инвазивный подход, используя чрескожное введение вектора LV, несущего трансген FAH человека, в портальную вену четырем свиньям FAH-/- (Таблица 1). Таблица 1





Fig. 2: : NTBC-independent weight gain and correction of biochemical parameters after in vivo LV-FAH delivery.

a Timeline of NTBC cycling and withdrawal for No. 166 and No. 167 (first row) demonstrated NTBC-independent growth at 98 and 78?days post-treatment. Each gray bar represents 1?week spent on NTBC. Green line represents when blood was drawn for the biochemical data in (b). Timeline of NTBC undertreatment for No. 266, which did not receive LV-FAH and developed HCC, and for No. 158, which did not receive LV-FAH but received appropriate NTBC cycling. b Normalization of tyrosine, aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP), ammonia, and total bilirubin levels at 142?days post-treatment. Mean ± standard deviation are shown for No. 166 and No. 167 alongside historical wild-type (n = 2) and untreated FAH-/- (n = 3) controls. P-values are provided for treated animals compared to untreated FAH-/- controls based on a two-sided Welch's t-test with no adjustment for multiple comparisons: * represents P< 0.05, ** represents P< 0.01, **** represents P< 0.0001. Tyrosine: p< 0.0001; AST: p= 0.01; ALP: p= 0.004; ammonia: p= 0.03; bilirubin: p= 0.04. c Age-appropriate decreases and maintenance of alpha-fetoprotein (AFP) levels in No. 166 and No. 167 despite chronic NTBC withdrawal.





Fig. 3: Liver repopulation with FAH-positive hepatocytes after in vivo LV-FAH delivery.

a Immunohistochemistry (IHC) for FAH in Nos. 166 and 167 at the time of euthanasia (337?days post-treatment) showing liver repopulation with FAH-positive hepatocytes in all areas of the liver. Sixteen areas of each liver were examined with similar results for a-c. b IHC for FAH in No. 162 at 60 days post-treatment showing multiple FAH-positive nodules in the liver with no presence of significant liver injury on H&E or Trichrome staining (first row). IHC for FAH from laparoscopic liver biopsy in No. 166 (second row) and No. 167 (third row) at 225 days post-treatment showing extensive liver repopulation with FAH-positive hepatocytes, with H&E and Trichrome staining showing hepatocellular inflammation with moderate fibrosis but no increased AFP staining. IHC for FAH in No. 166 (left medial lobe, fourth row) and No. 167 (left lateral lobe, fifth row) at 337 days post-treatment showing near complete liver repopulation with FAH-positive hepatocytes, with H&E and Trichrome staining showing resolution of hepatocellular inflammation and fibrosis with no increased AFP staining. c H&E and Trichrome staining of wild-type pig liver (left panels) and HCC in an NTBC under-treated FAH-/- pig liver (No. 266, right panels) at 1 year show liver fibrosis and cellular alterations in the under-treated animal, while IHC for AFP shows ubiquitous increases in expression consistent with development of HCC in this context. d Quantification of AFP in No. 266 shows age-appropriate AFP levels in the neonatal period; however, AFP was slightly elevated at 1?year, while AFP in Nos. 166 and 167 at 337?days post-treatment was below the limit of quantitation.

LV-FAH vector shows a benign integration profile in pig hepatocytes after in vivo delivery



Table 2 Top 10 genes by integration frequency



Fig. 5: RNA expression analysis shows LV-FAH restores wild type expression profiles better than standard NTBC treatment.

a Individual heatmaps comparing RNA expression levels of the genes listed on the right between wild-type pigs at 6 and 12 months of age (left), LV-FAH-treated pigs at 6 and 12 months of age (middle) and NTBC-treated pigs at 12 months of age (right). Genes displayed are the result of overlapping differential expression analyses across the three comparisons with absolute log2 fold change > 2 and FDR < 0.05. Clusters are identified for 1. cancer- and 2. fibrosis-associated genes. b Individual heatmaps showing RNA expression level profiles comparing 6 and 12-month wildtype and LV-FAH-treated pigs with either FAH-/- NTBC-undertreated pigs (Sick, top) or NTBC-treated pigs (bottom). c Gene clusters represented in (b) organized by association with various disease and cancer pathways showing that over the course of 12 months of LV-FAH treatment genes in these pathways are expressed more similarly to wildtype than to the sick or standard NTBC-treated pigs. P-values were derived from an over-representation analysis with two-tailed tests without adjustment for multiple comparisons, and the genes shown in the figure the top 10 hits for each comparison from each direction. d Principal component analysis (PCA) supporting the conclusion that wild-type pigs are transcriptome-wide more similar to the LV-FAH treated pigs than to the NTBC-treated pigs. Original values are ln( + 1) transformed. X and Y-axis show principal component 1 and principal component 2 that explain 46.4% and 23.9% of the total variance, respectively. Prediction ellipses are such that with probability 0.95, a new observation from the same group will fall inside the ellipse.

В данном исследовании мы продемонстрировали, что генотерапия лентивирусным вектором безопасна и эффективна для прямого in vivo введения в воротную вену чрез кожу в соответствующей доклинической крупной животной модели HT1. Примечательно, что результаты безопасности, полученные в этом эксперименте, поддерживают применение этого интегрирующего вектора in vivo при отсутствии промотор- или трансген-специфических побочных явлений и в условиях полного разрешения биохимических и гистологических особенностей тирозинемии, которые приводят к прогрессирующему системному заболеванию и болезни печени. Экспериментальные FAH-/- свиньи были включены и выключены из NTBC для отбора FAH-положительных гепатоцитов и были излечены от болезни после однократного внутри-портального введения LV вектора, несущего гн FAH человека под контролем специфического для печени промотора HCR-AAT.

Введение через кожу LV-FAH в портальную вену была хорошо переносимо, без системной воспалительной реакции. В течение 48 часов после введения вектора проводился тщательный мониторинг жизненных показателей, который показал минимальные изменения частоты сердечных сокращений и артериального давления при стабильной температуре. Однако при системном введении того же вектора у животных развилась острая гипотензивная анафилактоидная реакция, потребовавшая вазопрессорной поддержки, что, вероятно, связано с транзиторным повышением уровня циркулирующих цитокинов TNF-α, IL-6, IL-8 и INF после воздействия частиц LV⁵⁶, но возвращением к исходному уровню через 6-12 часов после введения. Naldini и коллеги ранее описали аналогичные результаты после открытого хирургического вмешательства с введением в воротную вену LV, несущего трансген фактора IX, у собак⁴⁸. Подобная воспалительная реакция наблюдалась ранее у мышей, подвергшихся воздействию частиц LV, и, как полагают, была связана с активацией печеночных и селезеночных плазмацитоидных дендритных клеток, вызванной загрязняющими нуклеиновыми кислотами или присутствием самих частиц LV⁵⁶. Этих результатов можно избежать или уменьшить их количество путем оптимизации протоколов иммуносупрессии⁴⁸ , титрования дозы для конкретного вида, чтобы минимизировать системное воздействие, а также путем использования методов доставки через кожу, описанных в данном исследовании. Через-кожная канюляция воротной вены - это передовой, но доступный навык, который позволит проводить направленную на печень генотерапию у людей под сознательным воздействием седативных средств , а не под общей анестезией, что позволит избежать путаницы и дополнительного физиологического стресса при открытой операции, приводящей к активации значительных воспалительных путей, наблюдаемых при хирургическом вмешательстве.

Введением через кожу в портальную вену было продемонстрировано, что в отличие от системной доставки, происходит очень эффективное нацеливание на печень, ограничивая биораспределение во внепеченочные ткани. Обширный анализ ПЦР показал крайне ограниченное воздействие на внепеченочные ткани по сравнению с системным введением. Хотя исследование биораспределения после системной доставки было проведено только у одного животного на 14 день после лечения, результаты биораспределения в группе доставки через портальную вену были одинаковыми у всех четырех животных во всех временных точках, включая раннюю (48 ч), среднюю (60 дней) и позднюю (337 дней). Первоначальная интеграция лентивируса в печень была измерена при менее чем одном VCG, что значительно ниже рекомендаций FDA о пяти VCG⁵⁷. Это число быстро увеличилось до десяти у наших животных, находившихся в долгосрочной перспективе, по мере того, как исправленные гепатоциты разрастались и заселяли печень, что, возможно, свидетельствует о естественном отборе гепатоцитов с более высоким VCG или более сильной ферментативной активностью.

Важно отметить, что направленная на печень генотерапия in vivo LV вылечила HT1 у наших экспериментальных животных и сделала это в более быстрые сроки, чем генотерапия ex vivo с использованием той же векторной конструкции, поэтому вероятность повреждения печени была меньше. Две свиньи-долгожительницы продемонстрировали независимость от NTBC на 78-98 день после лечения, всего после четырех циклов приема препарата. Для сравнения, в нашем предыдущем исследовании ex vivo независимость NTBC была получена на 93-150 день после лечения, после четырех-шести циклов приема препарата^30,58. Кроме того, все функциональные тесты печени у экспериментальных животных находились на уровне дикого типа через четыре и пять месяцев после лечения, а уровень AFP демонстрировал соответствующее возрасту снижение, которое сохранялось на протяжении всего исследования.

К концу исследования (337 дней) гистология печени экспериментально леченных животных соответствовала нормальной печеночной архитектуре, обнаруженной у контрольных животных дикого типа, сопоставимых по возрасту. Мы не обнаружили признаков хронического повреждения печени или повышенного окрашивания AFP у наших экспериментальных животных даже через 8 месяцев после прекращения приема защитного препарата NTBC. Это особенно важно, поскольку мы также продемонстрировали, что у животных FAH-/-, не получающих генотерапию и хронически не-долеченных NTBC, развивается обширный фиброз в течение нескольких недель и может прогрессировать до печеночных аденом в течение 6 месяцев жизни и HCC до года жизни, что подтверждает предыдущие данные о фиброзе у 100% животных и развитии аденом при более мягком недолечивании NTBC⁵⁹. Важно отметить, что у свиней HT1 HCC развивается в зависимости от фиброза, как и у людей и в отличие от мышей^37,60,61, что делает свинью с дефицитом FAH идеальной доклинической моделью для оценки потенциальных пагубных последствий лентивирусной терапии, лечения и отмены NTBC у людей. Предыдущие исследования с использованием нелентивирусного ретровируса (GlFSvNa) у мышей для лечения HT1 in vivo показали метаболическую коррекцию фенотипа, но увеличили частоту развития HCC. В то время было сделано предположение, что повышенная частота HCC была обусловлена наличием некоторого количества неоткорректированных гепатоцитов, которые сохранялись и затем прогрессировали до HCC. Эта проблема безопасности препятствовала разработке генотерапии для HT1 в течение более двух десятилетий, в то время как наши последние данные, полученные на более клинически значимой модели свиньи, показывают, что эта проблема устарела. Основанием для этого служит наше новое понимание того, как HCC развивается у мышей, свиней и людей.

У мышей аденомы и HCC развиваются в результате другого набора молекулярных нарушений по сравнению с людьми и свиньями; на самом деле, было показано, что в свиной модели HCC развивается в результате такого же набора молекулярных нарушений, как и в большинстве человеческих HCC, включая повышенную экспрессию TP53 и KRAS, устойчивый ангиогенез в результате избыточной экспрессии PDGFA и ANGPT2, уклонение от апоптоза посредством избыточной экспрессии TWIST1 и других механизмов, реактивацию TERT для поддержания теломер и активацию сигналов Wnt^62,63. У людей, включая пациентов с HT1, HCC развивается в условиях сильно воспаленной, фиброзной или цирротической печени, за исключением фиброламеллярного варианта или редких случаев онкогенности, связанной с HBV64, в то время как у мышей FAH-/- HCC возникает при отсутствии таких изменений³². Это согласуется с наблюдением, что тканевая среда, в которой развивается HCC, заметно отличается у людей и грызунов, где хронический гепатит и цирроз - редкие поражения в печени крыс и мышей, у которых развивается HCC³⁶. Поэтому у мышей аденомы и HCC развиваются в печени в результате воспалительного и фиброзно-независимого процесса, тогда как у людей и свиней, особенно в условиях HT1, аденомы и HCC развиваются почти исключительно на фоне хронического фиброза и цирроза, что делает их отсутствие в печени защитным. Гистологически мы показали, что к концу терапии нигде в печени не было обнаружено признаков хронических воспалительных изменений, и этот вывод подтверждается результатами секвенирования РНК, о которых речь пойдет ниже. Мы также не обнаружили никаких признаков аденом или HCC ни у одного из наших долгосрочных экспериментальных животных, что согласуется с нашими результатами терапии ex vivo³⁰, и не обнаружили обогащения каких-либо путей, связанных с опухолями, на GSEA. Кроме того, эти животные циклически включали и полностью выключали NTBC; теоретически этот режим может быть изменен на хронический прием низких доз препарата, например, чтобы снизить риск фиброза, поскольку FAH-положительные гепатоциты разрастаются, заселяя печень, а также избежать порфириеподобных кризов и коагулопатии, которые вызывает не-леченный дефицит FAH у пациентов HT1⁶⁵.

Вектор LV-FAH продемонстрировал доброкачественный профиль интеграции в гепатоцитах свиней после доставки in vivo, что еще раз подтверждает безопасность данного подхода. Оценка 17 000-39 000 уникальных сайтов интеграции у всех животных не выявила генотоксических событий и не способствовала интеграции в опухоль-кодирующие области генома или в CpG-богатые промоторные области, причем это соотношение оставалось одинаковым для всех анализируемых тканей печени (Дополнительная таблица 3). Это согласуется с результатами предыдущих исследований, в которых лентивирусы интегрируются в кодирующие области генов без явного предпочтения стартовых участков транскрипции, промоторных областей или других регуляторных участков генома^66,67. Эти данные, вместе с нашими предыдущими работами, в которых не было обнаружено доказательств генотоксичности LV-FAH in vivo в мышиной модели, подверженной HCC⁶⁸ , и GSEA, показавшей обогащение сигнальных путей PI3K-Akt и TGFb только у одного животного, создают благоприятный профиль безопасности, особенно с учетом того, что гепатоциты, как было показано, восприимчивы к инсерционному мутагенезу^69,70. В нашем исследовании мы наблюдали интеграционное смещение в ДНК печени, выходящее за рамки устоявшихся ожиданий, о которых сообщалось ранее⁷¹. Мы обнаружили, что в дополнение к этим ранее зарегистрированным смещениям, интеграция LV-FAH была увеличена в локусах FAH и SERPINA1, что может представлять собой смещение интеграции, основанное на гомологии последовательностей.

Экспрессия генов, связанных с воспалением, фиброзом и HCC в печени, была хорошо охарактеризована⁷². Анализ RNA-seq в возрасте 1 года от животных, получавших лечение NTBC, у которых развилась HCC, сравнивали с контрольными особями дикого типа, содержавшимися на адекватном уровне NTBC и свиньями, получавшими лечение LV-FAH. Относительно друг друга наблюдались значительные изменения, связанные с воспалением, фиброзом и генами, связанными с раком, что свидетельствует о том, что лечение LV-FAH восстанавливает фенотип дикого типа спустя 12 месяцев после лечения. Примечательно, что у животных, получавших адекватное лечение NTBC наблюдалось увеличение этих генов, связанных с повреждением печени и опухолями, что может объяснить достоверные данные, полученные в настоящее время у людей, демонстрирующие развитие цирроза и HCC у пациентов HT1, несмотря на оптимальную и соответствующую требованиям терапию NTBC^7-10,73,74. Кроме того, как и у животных дикого типа, у свиней, получавших LV-FAH, нормальный, не обнаруживаемый уровень AFP в 1 год, что резко отличается от животных с дефицитом FAH получавших NTBC. Это еще раз подтверждает наше предложение о применении LV-FAH в качестве приемлемого продвижения в лечении HT1 вместо хронической поддерживающей терапии NTBC, которая не предотвращает развитие воспаления, фиброза и HCC из-за остаточного прогрессирования метаболизма тирозина по пути деградации, что приводит к производству токсичных метаболитов. Более того, пациенты с дефицитом FAH, получающие оптимальное лечение NTBC, в лучшем случае страдают от фенотипа HT3, который со временем может стать изнурительным^21-23,26. Пациенты с НТ1 все еще нуждаются в истинном лечении, таком, которое предлагает LV-FAH.

Наконец, наиболее убедительным аспектом этой модели и заболевания является характерная экспансия FAH-положительных гепатоцитов. Генетически модифицированные гепатоциты в модели свиньи HT1 представляют собой очень чувствительный инструмент для оценки платформ генотерапии, включая LV, на предмет мутагенеза с последующей надежной клональной экспансией любых неблагоприятных клонов. Мы приводим доказательства того, что на модели свиньи HT1 может развиться HCC в отсутствие генотерапии и адекватной дозировки NTBC, устанавливая значимость отсутствия событий туморогенной интеграции или активации онкогенных путей у животных, получавших LV-FAH, и предоставляя убедительные данные по безопасности для рассмотрения возможности применения на человеке. Эта работа вносит вклад в растущее число доказательств того, что LV-векторы имеют более низкий генотоксический риск по сравнению с гамма-ретровирусными векторами^75-77. Хотя для повышения безопасности лентивирусных векторов в целом применялись и применяются многочисленные стратегии^78,79, пациенты, участвующие в клинических испытаниях с использованием лентивирусных векторов, по-прежнему будут нуждаться в тщательном долгосрочном наблюдении. Стоит отметить, что пациенты HT1 уже нуждаются в частом наблюдении в связи с раком и скрининге HCC5 , и это требование не будет принципиально изменено после применения генотерапии для лечения HT1.

Наше исследование имеет ряд ограничений. Основным и наиболее существенным ограничением является небольшое количество животных, прошедших лечение и анализ. Как это часто бывает в доклинических исследованиях на крупных животных, включение большого объема выборки было бы дорогостоящим. Результаты следует интерпретировать в контексте ограниченных данных, полученных от небольшого числа животных, за которыми наблюдали в течение относительно короткого периода времени. Однако нельзя недооценивать важность тестирования новых методов лечения на доклинических моделях, которые, в отличие от моделей грызунов, полностью повторяют фенотип заболевания человека, а также тот факт, что эта конкретная модель продемонстрировала способность к развитию HCC в относительно короткие сроки. Дозы были основаны на предыдущих исследованиях печени in vivo LV на крупных животных⁴⁸, а также на наших собственных результатах на мышах. Дальнейшие исследования дозы-ответа оправданы для изучения влияния дозы на биораспределение и поиска баланса между быстрым излечением с ограниченным циклированием NTBC и смягчением системного воздействия, приводящего к внепеченочным интеграционным событиям. Такие дальнейшие исследования эффективности в минимальных дозах, которые выходят за рамки данной работы, в настоящее время проводятся. Дозы, используемые в данном исследовании, потребуют крупномасштабного производства на взрослых или педиатрических пациентах, но новые технологии, такие как реакторы из полых волокон и процессы суспензионной культуры, очень быстро снижают производственные трудности^80,81. Стратегии снижения необходимой дозы LV могут также включать временный нокдаун клеток Купфера перед введением LV, чтобы уменьшить устранение вектора в печени⁸². Эти дальнейшие исследования будут иметь решающее значение для создания оптимальных протоколов лечения лентивирусами in vivo для клинического применения. Кроме того, печень экспериментальных свиней не подвергалась CT или MRI imaging, а только грубому гистологическому исследованию после среза 0,5 см. Поэтому возможно, что присутствовали опухоли размером менее 0,5 см, хотя отсутствие фиброза и нормальный уровень AFP, а также нормальный профиль экспрессии печеночных генов делают это маловероятным. Кроме того, хотя ПЦР как инструмент оценки биораспределения вектора может определить наличие LV в определенной ткани, он не дифференцирует типы клеток в этой ткани. Поэтому, когда мы оцениваем биораспределение и профиль интеграции в органе, мы говорим в широком смысле обо всех клетках, содержащихся в этой ткани. В частности, в печени мы оцениваем интеграцию в гепатоциты, а также, предположительно, в звездчатые клетки, клетки Купфера и эндотелиальные клетки синусоидов печени. Свиней также не наблюдали на предмет развития HCC в течение всей их жизни. Однако время до развития HCC у пациентов, получавших NTBC определенно смоделировано, а отсутствие фиброза, повышенного уровня AFP или изменений экспрессии печеночных генов после 6 месяцев отмены NTBC является защитным фактором против развития опухоли в будущем.

В заключение, наше исследование предоставляет дополнительные доказательства того, что in vivo лентивирусная генотерапия, направленная на печень, посредством прямой через-кожной доставки через портальную вену является безопасной и эффективной. Эти данные подтверждают целесообразность применения лентивирусных векторов in vivo для лечения HT1 и других заболеваний, которые можно вылечить с помощью стабильной интегрированной доставки генов.