Модификация и передача генетического материала для компенсации аномально мутировавших генов называется генотерапией. Целью генотерапии является лечение или даже профилактика генетических заболеваний путем стимулирования длительной экспрессии перенесенного гена на терапевтическом уровне [78,79]. Гемофилия - это наследственное заболевание, генетика которого хорошо изучена, что делает его идеальной мишенью для генотерапии. Кроме того, поскольку тяжесть фенотипа кровотечения относительно нечувствительна к плазменным уровням факторов свертывания крови, точное регулирование не требуется. Самое большое ограничение доступных в настоящее время методов лечения связано с их коротким терапевтическим периодом полураспада, что приводит к частым внутривенным инфузиям и заставляет предпринимать активные усилия по разработке более эффективных стратегий генотерапии [71,80-85].

В современных стратегиях генотерапии чаще всего используются два типа векторов. Лентивирусные векторы используются для переноса генов ex vivo в гемопоэтические и другие стволовые клетки [83,86], а адено-ассоциированные вирусные (AAV) векторы обычно используются для переноса генов in vivo в пост-митотические клетки [78,87]. Поскольку лентивирусные векторы очень сложны в производстве, клинические исследования с использованием этих векторов еще не начаты из-за трудностей в производстве количества вектора, необходимого для доставки in vivo [39,88]. AAV дикого типа (wt) - это небольшой одноцепочечный ДНК-вирус семейства парвовирусов, непатогенный и дефектный по репликации, поэтому он не может вызывать заболевания. В современных клинических исследованиях генотерапии гемофилии используются рекомбинантные векторы AAV (rAAV) для прямой трансдукции генов факторов коагуляции в гепатоциты печени, которые превращаются в белковые биофабрики, производящие и выделяющие в циркуляцию трансгенный продукт. После трансдукции клетки-мишени терапевтические генные последовательности rAAV обнаруживаются в основном в виде concatemeric эписом с низким уровнем интеграции в геномную ДНК хозяина [87,89].

AAV имеет широкий спектр естественно существующих серотипов, каждый из которых имеет свой органный/клеточный тропизм [90]. Для повышения эффективности вектора могут быть получены гибридные серотипы. В первых клинических исследованиях гемофилии использовался серотип AAV первого поколения, AAV2, который лучше всего охарактеризован и наиболее подробно изучен среди серотипов. Другие серотипы, которые были протестированы, это AAV5, AAV8 и AAVrh10 [91]. Серотип AAV8 эффективно переносит гены в печень и способствует высокой экспрессии генов даже при внутривенном введении [87,92]. AAV5 является наиболее филогенетически отличным серотипом вектора с точки зрения структуры капсида, в то время как другие широко используемые серотипы имеют более 80% гомологии [91].

Одним из ограничений векторов AAV является ограниченная емкость упаковки (~4,7 килобаз [кб]) [93]. Поэтому первые исследования генной терапии гемофилии были проведены при гемофилии В с использованием меньшего по размеру трансгена F9 [94]. Аналогичные клинические исследования при гемофилии А начинались медленно, поскольку трансген F8 имеет размер ~7 кб, и F8 имеет плохой профиль экспрессии [95,96]. Недавно был разработан подход к переносу генов на основе AAV для устранения ограничений по размеру путем удаления B-домена FVIII (называемого B-domain deleted [BDD]) для уменьшения размера кассеты экспрессии FVIII [96]. Кроме того, относительно плохой профиль экспрессии FVIII может быть улучшен в 10 раз путем оптимизации кодонов (т.е. инженерии кодонов для улучшения экспрессии гена и трансляции белка на основе смещения кодонов хозяина) кДНК FVIII wt человека [97]. В 2017 году компания BioMarin Pharmaceutical успешно применила эту конструкцию, используя оптимизированный по кодонам вектор AAV5, кодирующий вектор BDD человеческого FVIII (AAV5-hFVIII-SQ) [98]. Обзор клинических исследований генотерапии при гемофилии А приведен в Разделе 3.

Генотерапия гемофилии включает внутривенное введение трансгена F8 в составе вирусного капсида (рис. 1). Внутривенное введение приводит к преимущественному нацеливанию трансгена на гепатоциты из-за архитектуры капилляров печени [99]. Как только клетка-хозяин распознает капсид AAV через свои гликозилированные рецепторы клеточной поверхности, вирус интернализируется через клатрин-опосредованный эндоцитоз и транспортируется в цитозоль через цитоскелетную сеть. AAV должен выйти из эндосомы в оптимальное время, чтобы избежать лизосомной деградации и способствовать его транспортировке в ядро и последующему разворачиванию посредством конформационных изменений pH-чувствительных эндосомолитических вирусных белков [100]. Вирусные инвертированные терминальные повторы, присутствующие в геноме rAAV, стимулируют внутримолекулярную или межмолекулярную рекомбинацию (т.е. конкатемеризацию) для формирования циркуляризованных геномов, которые выживают в ядре в виде эписом [101].



Рисунок 1. Targeted gene therapy schematic. The transgene of interest is packaged inside a recombinant viral vector and injected into the subject. The vector is taken up by many different cell types via endocytosis into organelles called endosomes. The vector escapes from the endosomes, attaches to the nuclear envelope, and injects its genomic payload into the nucleus. The vector genome contains a tissue-specific promoter such that it is only transcribed in the target cell type (e.g. hepatocytes). The host transcription machinery transcribes the transgene into mRNA, which is transported out of the nucleus and translated into the protein of interest.

Основным ограничением подхода генотерапии на основе AAV является то, что эписомные геномы AAV не реплицируются во время деления клеток. Важными моментами, которые необходимо учитывать при использовании этого подхода, являются потенциальная потеря экспрессии факторов и последствия роста печени и разбавления трансдуцированных гепатоцитов у молодых пациентов [71]. К сожалению, повторное введение противопоказано, поскольку после первой дозы возникает гуморальный иммунный ответ против капсидных белков AAV. Однако возможно, что вектор rAAV интегрируется в геномы животных [102], что может уменьшить эффект разбавления. Важно учитывать возможность развития генотоксичности, которая, хотя и редко, но может иметь место [103].

Основные проблемы генной терапии в целом включают крупномасштабное производство векторов и их стоимость, контроль качества и стандартизацию анализов, а также иммунологические барьеры для доставки генов rAAV. Трудности удаления клеточных и вирусных примесей из частиц rAAV, а также пустых капсидов AAV, отсутствие стандартизации и присущие каждой партии вариации в потенции вектора влияют на стоимость производства [101]. Основные ограничения и риски генной терапии при гемофилии подробно описаны ниже.

Предсуществующие нейтрализующие анти-AAV антитела, специфичные для различных серотипов AAV (с различной степенью серологической перекрестной реактивности), которые могут нейтрализовать вектор и тем самым снизить эффективность лечения, широко распространены в популяции вследствие естественного инфицирования wt AAV в детстве [92,100,104-106]. Распространенность анти-AAV антител варьируется от 20% до 70%, в зависимости от конкретного серотипа AAV и популяции испытуемых [39,87,91,107]. Меньшая популяция испытуемых демонстрирует предсуществующие антитела к AAV5, что, вероятно, является результатом меньшей перекрестной реактивности с антителами к AAV приматов [92]. Однако оценка распространенности предсуществующего иммунитета к AAV в общей популяции осложняется тем, что лабораторные тесты для выявления анти-AAV антител еще не стандартизированы [39,87,107,108].

В дополнение к предсуществующему иммунитету, отсроченный клеточный иммунный ответ на капсид AAV, обычно возникающий через 4-12 недель после введения вектора, может привести к разрушению трансдуцированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами и потере терапевтической эффективности (т.е. снижению долговечности с течением времени). Индукция цитотоксических Т-лимфоцитов препятствует эффективному повторному дозированию и ослабляет долгосрочные терапевтические преимущества [61,79,109]. Помимо капсидного белка, другие компоненты вектора AAV, такие как стимулирующие гипометилированные CpG-мотивы, могут влиять на иммунный ответ [61,110-113].

Некоторые терапевтические препараты на основе векторов AAV2, AAV8 или других подобных серотипов, произведенных в клетках млекопитающих, вызывают анти-AAV капсидный клеточный иммунный ответ, направленный против трансдуцированных гепатоцитов, что приводит к потере экспрессии трансгена, которую иногда можно контролировать с помощью иммуносупрессивной терапии [114]. Текущие исследования могут определить, можно ли избежать такого клеточного иммунного ответа, если производить вектор AAV в более отдаленно родственных видах, таких как насекомые. Некоторые исследования показали, что предсуществующие нейтрализующие антитела к AAV могут препятствовать трансдукции вектора и ограничивать терапевтическую эффективность (см. раздел ?2.2.3) [115], в то время как в других исследованиях о потере трансгена или свидетельствах клеточного иммунитета не сообщалось [116]. В одной из программ клинических испытаний для лечения гемофилии B на эффективность трансдукции не повлияли предсуществующие антитела к AAV5 в титрах, обычно наблюдаемых в общей популяции, а в клиническом испытании, которое проводится в настоящее время, не были исключены субъекты с предсуществующими нейтрализующими антителами к капсиду AAV [91,115,117,118].

Влияние нейтрализующих антител может быть преодолено с помощью таких стратегий, как изменение серотипа AAV или увеличение дозы вектора для преодоления антитела. Однако изменение серотипа AAV может оказаться неэффективным из-за перекрестной реактивности некоторых нейтрализующих антител. Другие потенциальные стратегии включают включение пустых капсидов, снижение титра с помощью иммуносупрессивных препаратов или плазмафереза, изменение капсида AAV и изоляцию доставки AAV на ограниченную территорию для снижения системного воздействия. Все эти стратегии, однако, ставят под угрозу ожидаемую эффективность лечения [119].

Другой подход заключается в попытке предотвратить развитие адаптивного иммунитета и Т-клеточного иммунного ответа на капсид AAV. Например, недавно были разработаны обеспречивающие толерантность наночастиц, инкапсулирующие рапамицин, которые вызывают иммунную толерантность и тем самым усиливают экспрессию трансгенов после первой дозы AAV-вектора и подавляют адаптивный иммунный ответ антител и Т-клеток против капсида AAV, что позволяет повторно вводить AAV-векторы мышам и не-человекообразным приматам [120,121].

Большинство современных исследований по генотерапии гемофилии направлены на пациентов с отрицательным уровнем предсуществующих нейтрализующих антител против капсида AAV. Таким образом, эти антитела не позволяют широко применять имеющиеся в настоящее время методы генной терапии в популяции больных гемофилией. Кроме того, поскольку после применения генной терапии на основе AAV могут образовываться нейтрализующие антитела к AAV, пациентов нельзя лечить несколькими дозами одного и того же серотипа AAV [87].

На сегодняшний день не сообщалось о появлении ингибиторов FVIII или FIX в клинических исследованиях генотерапии AAV. О генотипах F8 и F9 этих участников пока не сообщалось. В целом, однако, текущие клинические исследования включают только тех пациентов, у которых было более 150 дней экспозиции для замещения фактора, и все, у кого в анамнезе были ингибиторы, были исключены. Таким образом, участники этих исследований, вероятно, обогащены генотипами F8 и F9, связанными с низким риском образования ингибиторов. Неизвестно, могут ли у пациентов, не получающих лечение, образоваться ингибиторы после генотерапии [84,95]. Таким образом, в настоящее время проводятся клинические испытания для оценки лиц с активными ингибиторами, чтобы определить, может ли генотерапия вызвать толерантность и уничтожить ингибиторы [92].

Клинические исследования гемофилии А и В сообщают о бессимптомном транзиторном повышении уровня аланиновой трансаминазы (ALT), которое можно контролировать с помощью сокращающегося курса глюкокортикоидов [98,122,123]. Эта обычно легкая токсичность может быть связана с перемещением вирусных частиц, их распаковкой и ответом на повреждение ДНК, индуцированным ДНК вектора [98]. В нескольких исследованиях было показано, что повышение уровня ALT совпадает с выявляемым анти-AAV капсидным Т-клеточным ответом, но результаты не были последовательными. У некоторых пациентов уровень ALT повышается без капсидного ответа [124], тогда как у других пациентов капсидный ответ наблюдается без одновременного повышения уровня ALT [94,125]. Повышение уровня ALT, наблюдаемое после генотерапии на основе AAV, зависит от дозы вектора, но не связано с капсидом AAV, конфигурацией генома, промотором трансгена или методом производства [96]. В исследовании 1/2 фазы генотерапии FVIII компании BioMarin (раздел 3.2.1) повышение ALT не было связано с потерей активности FVIII или иммунным ответом Т-клеток на пептиды вирусного капсида [92,126].

Однако в большинстве случаев повышение ALT достигает максимального уровня, в 1,5-2 раза превышающего верхнюю границу нормы, и может быть связано или не связано с потерей гепатоцитов [92]. Медицинский и научный консультативный комитет Национального фонда гемофилии США рекомендует проводить биопсию для определения гибели или повреждения гепатоцитов, цитотоксичности Т-клеток, врожденного иммунного ответа и воспаления, экспрессии и распределения FVIII/FIX и признаков остаточных внутриклеточных капсидов AAV, по крайней мере, у части участников клинических исследований для решения вопросов безопасности, эффективности, долговечности и вариабельности ответа [127,128]. Эти крайние точки (endpoints) вносят важный вклад в наше понимание долгосрочной безопасности и эффективности лечения, а также оборота гепатоцитов, и могут способствовать выявлению различий в тропизме серотипов AAV [92].

Провирусная ДНК обычно сохраняется в эписомах трансдуцированных клеточных ядер. Таким образом, риск геномного инсерционного мутагенеза после AAV-опосредованной передачи генов невелик, что согласуется с тем фактом, что, хотя люди часто заражаются wt AAV, инфекция AAV не связана с онкогенезом [96]. Однако, как бы редко ни происходила интеграция генома AAV в организм хозяина, глубокое секвенирование показало, что такая интеграция все же происходит в печени [129,130], а несколько последних исследований выявили связь между гепатоцеллюлярной карциномой и wt AAV [131-133]. Несмотря на то, что значительно больше доказательств подтверждают отсутствие риска инсерционного мутагенеза как в животных моделях, так и у пациентов с гемофилией, леченных AAV, исключение этого потенциального риска потребует дальнейших исследований с большим числом подвергшихся лечению пациентов [84].

Количество синтетических и других сложных биологических функций, выполняемых печенью, делает ее очень восприимчивой к стрессу эндоплазматического ретикулума (ER) [134,135]. Поскольку экспрессия трансгена ограничена подмножеством клеток, некоторые отдельные клетки могут продуцировать избыточное количество FVIII, что может вызвать клеточный стресс. В ER происходит укладка и секреция зарождающихся белков. Перегрузка функции ER, например, вызванная увеличением потребности в сворачивании белков или накоплением развернутых или неправильно сформированных белков, приводит к ответу на развернутый белок (UPR) [136], что является признаком клеточного стрессового ответа [137,138] (рис. 2).



Figure 2. Schematic diagram of the unfolded protein response (UPR).

Клеточный стресс индуцируется, когда клетки продуцируют слишком много белка или белков, которые подвераются неправильному преобразованию и оказываются неупакованными иои неправильно упакованными. Эти клеточные стрессы задействуют UPR , чтобы заставить большую часть эндоплазматического ретикулума исправлять неупакованные или неправильно упакованные белки. Если клеточный стресс очень велик, то UPR может приводить клетки к гибели посредством апоптоза. UPR активирует нижестоящие сигнальные каскады путем усиления активности генов в ядре, что приводит к аресту трансляции и деградации белка, это снижает белковую нагрузку на ER [139].

UPR - это скоординированный клеточный механизм, который регулирует синтез и секрецию белка в ER [140]. Он функционирует как адаптивный сигнальный путь, который предотвращает накопление неправильных и развернутых белков в ER, тем самым минимизируя окислительный стресс [141,142]. UPR включает в себя 3 трансмембранных белка-сенсора стресса ER, в том числе нуждающуюся в инозитоле киназу, активирующий транскрипционный фактор 6 и протеинкиназу, активируемую двухцепочечной РНК, подобную ER-киназе [143,144]. Индукция UPR может быть измерена путем оценки репортерной активности ER response element-luciferase, сплайсинга X-box-binding protein 1 и активации регуляции иммуноглобулин-связывающего белка (BiP), также называемого Grp78 [145]. Grp78/BiP является центральным регулятором стресса ER благодаря своей роли основного шаперона ER с анти-апоптотическими свойствами, а также способности контролировать активацию трансмембранных датчиков стресса ER через механизм связывания-высвобождения [141,146-148]. Хроническая активация UPR и накопление развернутых белков в ER может привести к гибели клеток через апоптоз. Хотя гепатоциты являются мишенью генотерапии для производства белка FVIII, они естественным образом не экспрессируют ни FVIII, ни vWF [31], что увеличивает риск индукции стресса ER путем избыточной экспрессии FVIII в этих клетках [84].

Избыточно экспрессированный FVIII склонен к неправильному сворачиванию в просвете ER, что активирует UPR, приводя к повреждению клеток или апоптозу. Увеличение UPR коррелирует со снижением экспрессии FVIII, что оценивается с помощью систем клеточной экспрессии in vitro, а также со снижением концентрации FVIII в плазме крови in vivo после трансдукции генов вирусными векторами генотерапии [40]. Интересно, что биосинтез свиного FVIII, содержащего домены A1 и ap-A3, в 10-100 раз эффективнее, чем человеческого FVIII, и обеспечивает более высокий уровень экспрессии и эффективности секреции [149,150]. Экспрессия человеческого FVIII активирует UPR в большей степени, чем экспрессия свиного FVIII [145].

Методы целенаправленного редактирования генома для исправления генных мутаций на уровне генома с помощью программируемых нуклеаз (например, нуклеазы с цинковым пальцем, нуклеазы, подобной эффектору активатора транскрипции, и системы clustered regularly interspaced short palindromic repeat [CRISPR]/CRISPR-associated protein 9 [Cas9] [151]) могут обеспечить более длительное лечение гемофилии [102,152,153]. Исследование редактирования генов на основе нуклеазы цинковых пальцев (ZFN) было впервые проведено у пациентов с гемофилией B, в ходе которого нормальный трансген F9 был помещен в интрон 1 альбумина под контролем промотора эндогенного локуса альбумина. Однако программа была прекращена (NCT02695160). Недавние результаты показали, что in vivo целенаправленное воздействие на геном человеческого трансгена на локус Alb с помощью CRISPR/Cas9 привело к выработке человеческого FVIII в печени и ослаблению тяжелого фенотипа гемофилии А у мышей [153]. Такие генетические подходы, эффективно переведенные на людей, могут обеспечить более долгосрочные решения для пациентов с гемофилией А.

На сегодняшний день наиболее серьезной проблемой, связанной с целенаправленной доставкой AAV в печень, является печеночная токсичность, сопровождающаяся потерей или снижением экспрессии трансгена [96]. Как доза вектора, так и оптимальная экспрессия трансгена могут влиять на то, индуцируется ли иммунный ответ против вектора AAV и продукта трансгена [84,154,155]. Однако точный патофизиологический механизм потери экспрессии трансгена и гепатотоксичности неясен [96]. Механизмы, лежащие в основе этого явления, вероятно, сложны и могут включать другие факторы, такие как UPR [95]. Хотя существуют доказательства существования CD8+ Т-клеток памяти, нацеленных на капсиды AAV, ответ еще не до конца ясен, и потеря экспрессии трансгена или гепатотоксичность не всегда коррелируют с Т-клеточным ответом. Поэтому способность генерировать стойкую, долгосрочную экспрессию экзогенных генов потребует более полного понимания врожденного и адаптивного иммунного ответа на векторы AAV, а также дальнейшего выяснения других источников клеточного стресса и токсичности [61,84,156].

В настоящее время дети не имеют права на генотерапию, направленную на лечение гемофилии. Поскольку кассеты экспрессии FVIII и FIX находятся в эписомах и поэтому не реплицируются во время деления клеток, лечение пациента, печень которого все еще развивается, может привести к разбавлению экспрессии [84]. Исследование, проведенное среди взрослых, показало стабильную экспрессию трансгена в течение как минимум 10 лет для FIX, но 50% снижение экспрессии FVIII между 1 и 2 годами, которая продолжала снижаться до конца 3-го года [92].

Долгосрочные цели для исследовательской генотерапии гемофилии включают увеличение продолжительности экспрессии трансгена и возможность лечения пациентов с предсуществующими анти-AAV нейтрализующими антителами или ингибиторами FVIII и FIX [61,78,96]. Химерная молекула FVIII человек/свинья (ET3) с повышенной секреторной способностью является потенциальным решением для получения стабильной и долговечной экспрессии трансгена [149,157]. Кроме того, необходимо собрать долгосрочные данные о безопасности, вариабельности и долговременной эффективности [158].

В таблице 1 представлен хронологический поток активных исследований генной терапии гемофилии А в соответствии с графиком, представленным на сайте ClinicalTrials.gov (отсортировано по дате начала исследования). В целом, на сайте ClinicalTrials.gov зарегистрировано 16 клинических исследований генотерапии гемофилии А.



Table 1. Timeline of gene therapy clinical studies in Hemophilia A

Генные препараты для лечения гемофилии А, разработанные 8 компаниями, в настоящее время оцениваются в клинических исследованиях, как показано в таблице 2 и последующих разделах.

Таблица 2. Обзор клинических исследований генной терапии гемофилии А по компаниям

BioMarin Pharmaceutical проводит 5 клинических исследований для оценки эффекта различных схем генотерапии тяжелой гемофилии А с использованием AAV5-hFVIII-SQ (valoctocogene roxaparvovec, Roctavian), который содержит 14-аминокислотную человеческую линкерную последовательность SQ вместо домена B (называемую HSQ и наиболее часто используемую в текущих клинических исследованиях тяжелой гемофилии А).

У 15 мужчин с тяжелой гемофилией А была проведена фаза 1/2 клинического исследования по повышению дозы (исследование BMN270-201, NCT02576795) для оценки эффекта однократного введения одной из нескольких доз с последующим наблюдением в течение 3 лет [98,126]. В целом, лечение существенно снизило ABR, что позволило субъектам, получившим 4 x 10¹³ или 6 x 10¹³ векторных геномов (vg)/кг массы тела AAV5-hFVIII-SQ, прекратить профилактическое применение FVIII. В течение 3-летнего наблюдения после однократного введения ни у одного из участников не развились ингибиторы, тромбозы или стойкие изменения в анализах функции печени, и никто не умер [126]. На Всемирной федерации гемофилии (WFH) был представлен дополнительный год данных (по 8 апреля 2020 года) по этой когорте для когорты 6 х 10¹³ vg/кг, а также данные за 3 года по когорте 4 x 10¹³ vg/кг.

Шесть испытуемых из когорты 6 x 10¹³ vg/кг AAV5-hFVIII-SQ, которые получали профилактику FVIII до лечения AAV5-hFVIII-SQ, продемонстрировали значительное и длительное сокращение эпизодов кровотечений, которые требовали инфузии FVIII. Кумулятивный средний ABR в течение 4 лет после лечения AAV5-hFVIII-SQ составил 0,8, что на 95% меньше, чем за год до начала исследования (средний исходный ABR = 16,3, медиана = 16,5). Через 4 года средний ABR для всех 6 испытуемых составил 1,3 (медиана = 0). В этой группе за 4-летний период исследования использование FVIII удалось сократить на 96% - с исходного среднего показателя 135,6 инфузий/год до среднего показателя 5,4 инфузий/год. Среди 7 пациентов этой когорты 6 (86%) не испытывали эпизодов кровотечения в течение 4-го года. Ни один из 7 испытуемых в настоящее время не нуждается в профилактической терапии FVIII.

У 6 испытуемых из когорты 4 х 10¹³ vg/кг AAV5-hFVIII-SQ также наблюдалось длительное сокращение случаев кровотечений, которые требовали инфузий FVIII. Все 6 испытуемых смогли прекратить профилактическую терапию FVIII. Кумулятивный средний ABR в течение 3 лет после лечения составил 0,9, что на 95% меньше, чем за год до начала лечения AAV5-hFVIII-SQ (средний ABR = 12,2, медиана = 8,0), и у 5 из 6 участников не было кровотечений из целевых суставов в 3-й год наблюдения. На 3-й год средний ABR составил 0,5 (медиана = 0), и у 4 из 6 участников не было кровотечений. Среди 6 пациентов 5 сообщили об отсутствии спонтанных кровотечений. В этой группе количество инфузий FVIII за 3 года сократилось на 96%, с 142,8 инфузий/год в исходном состоянии до 5,7 инфузий/год через 3 года. Средние уровни активности FVIII в конце периода исследования в обеих дозовых когортах подтверждают снижение ABR и количества инфузий FVIII. В конце периода исследования все испытуемые продолжали вырабатывать собственный эндогенный FVIII. В группе с дозой 6 ? 1013 вг/кг средняя (медиана) активность FVIII составила 24,2 (16,4) МЕ/дл (хромогенный субстратный анализ) и 35,4 (23,4) МЕ/дл (одноэтапный анализ). В когорте 4 ? 1013 вг/кг средняя (медиана) активность FVIII составила 9,9 (7,9) МЕ/дл (хромогенный субстратный анализ) и 14,9 (12,3) МЕ/дл (одноэтапный анализ). Лечение с помощью AAV5-hFVIII-SQ в настоящее время тестируется в дополнительных клинических исследованиях фазы 1/2 и фазы 3 (Таблица 2). Глобальное исследование 3-й фазы AAV5-hFVIII-SQ в дозе 6 ? 1013 вг/кг (GENEr8-1, исследование BMN 270-301, NCT03370913, n = 134 участника) для сравнения эффективности AAV5-hFVIII-SQ с текущим стандартом лечения - профилактической терапией FVIII. Набор участников завершен, и данные, полученные по крайней мере за 1 год наблюдения, свидетельствуют о 84%-ном снижении среднего ABR и 99%-ном снижении среднегодовой скорости инфузии FVIII. Через 1 год после лечения средний уровень экспрессии FVIII составил 42,9 МЕ/дл. BioMarin также проводит исследование фазы 1/2 у субъектов (n = 10) с ранее существовавшими антителами к AAV5 с использованием дозы 6 ? 1013 вг/кг дозы AAV5-hFVIII-SQ (исследование BMN 270-203, NCT03520712). Кроме того, BioMarin проводит еще 2 исследования: оценку серораспространенности AAV у людей с тяжелой формой гемофилии А и неинтервенционное исследование, направленное на установление исходных характеристик людей с гемофилией А. Из-за различий между исследованиями фазы 1/2 и фазы 3, долговечность лечения AAV5-hFVIII-SQ не ясна [161]. 3.2.2. University College London (UCL) Исследование Университетского колледжа Лондона представляет собой текущее клиническое исследование фазы 1/2 с открытой меткой, в котором оценивается лечение с помощью вектора AAV, экспрессирующего 17-аминокислотный пептид, содержащий 6 N-связанных мотивов гликозилирования из B-домена человеческого FVIII, со специфическим для печени транспортером (AAV8-HLP-hFVIII-V3; GO-8, исследование UCL 13/0076, NCT03001830). В исследовании использовались относительно низкие дозы AAV8-HLP-FVIII-V3 по сравнению с другими родственными генными терапиями FVIII. Предварительные результаты, опубликованные в 2018 году [162], показали, что у всех 3 участников уровень активности FVIII был ниже 5%, а у 1 участника был нормальный уровень прокоагулянтной активности (FVIII:C). События спонтанного кровотечения были снижены или предотвращены в течение предварительного периода наблюдения. О нежелательных явлениях 3-го класса или выше не сообщалось в течение первых 47 недель после начала лечения [162]. 3.2.3. Spark Therapeutics Компания Spark Therapeutics также проводит оценку эффективности кассет FVIII уменьшенного размера на выработку FVIII у пациентов с гемофилией А. Оцениваются две различные конструкции, SPK-8011 и SPK-8016. СПК-8011 (вектор rAAV-LK03) - это рекомбинантный вектор AAV, содержащий оптимизированный по кодонам ген FVIII человека под контролем специфического для печени промотора. СПК-8016 - это генная терапия собственной разработки. В настоящее время проводятся три клинических исследования, два с оценкой СПК-8011 и одно с оценкой СПК-8016 [163]. В открытом не-рандомизированном исследовании фазы 1/2 с использованием SPK-8011 у пациентов с гемофилией А (дата отсечения данных - 3 мая 2021 года, NCT03003533), однократная доза SPK-8011 (доза варьировалась от 5?1011 до 2?1012 вг/кг) была введена в общей сложности 18 пациентам в 4 когортах: 5X1011 (N= 2), 1X1012 (n= 3), 1.5X1012 (n= 4) и 2x1012 (n= 9) [164]. Шестнадцать участников продемонстрировали устойчивую экспрессию FVIII, прекратили базовую профилактику и продемонстрировали снижение ABR на 91,5% и снижение годового количества инфузий FVIII на 96,4%. У двух участников экспрессия FVIII прекратилась, предположительно в результате иммунного ответа на основе капсида.

Во втором клиническом исследовании SPK--8011 будет проведен мониторинг безопасности и эффективности (на срок до 5 лет) однократной дозы SPK--8011 у примерно 100 мужчин с гемофилией А, которые участвовали в предыдущем исследовании СПК-8011, спонсированном компанией Spark (исследование SPK-8011-LTFU, NCT03432520).

Компания Spark Therapeutics также проводит фазу 1/2 открытого не-рандомизированного исследования по определению дозы препарата SPK-8016 (исследование SPK-8016-101, NCT03734588) у взрослых мужчин с клинически тяжелой гемофилией A, у которых не развились ингибиторы FVIII. Безопасность, эффективность и переносимость SPK-8016 у взрослых мужчин с клинически тяжелой гемофилией А, у которых не развились ингибиторы FVIII, будут оценены в Части 1, а данные Части 1 будут использованы для разработки и подбора дозы для Части 2 у взрослых мужчин, у которых развились ингибиторы FVIII. Предварительные данные 4 участников показывают, что уровень FVIII был стабильным и продолжительным в течение 52 недель (колебался в пределах 5,9%-21,8%) в группе 5 x 10¹¹ vg/кг, с 98% снижением годовой скорости инфузии и 85% снижением ABR.

Компания Pfizer продвигает новый исследуемый препарат, гироктокоген фителпарвовек (SB-525 или PF-07055480; первоначально разработан компанией Sangamo Therapeutics, но в 2019 году передан компании Pfizer) в фазу 3 клинических исследований. Гироктокоген fitelparvovec представляет собой рекомбинантный AAV-вектор, кодирующий ген человеческого FVIII, из которого удален домен B.

Гироктокоген fitelparvovec исследуется в рамках открытой фазы 1/2 исследования (исследование Alta, исследование SB-525-1603, NCT03061201) с участием 11 человек мужского пола, получавших лечение в 4 когортах возрастающих доз: 9 x 10¹¹ vg/кг (n = 2), 2 x 10¹² vg/кг (n = 2), 1 x 10¹³ vg/кг (n = 2) и 3 x 10¹³ vg/кг (n = 5). Обновленные результаты были представлены на Всемирном конгрессе Всемирной федерации гемофилии 2020, состоявшемся в июне 2020 года, следующим образом.

5 участников в группе 3 x 10¹³ vg/кг гироктокогена фителпарвовек продемонстрировали устойчивое повышение уровня активности FVIII (медиана 64,2%), отсутствие кровотечений и отсутствие нужды в инфузиях FVIII. Гироктокоген фителпарвовек в целом хорошо переносился, и только у 1 участника из когорты с самой высокой дозой (3 х 10¹³ vg/кг) возникли связанные с лечением серьезные нежелательные явления в виде гипотензии (класс 3) и лихорадки (класс 2) в течение 6 часов после инфузии (полностью прошли в течение 24 часов). Из 5 участников в группе с дозой 3 x 10¹³ vg/кг, 4 получали пероральные кортикостероиды из-за повышения уровня печеночных ферментов (ALT), полностью прошло после лечения.

В настоящее время компания Pfizer также набирает испытуемых в исследование 3-й фазы (протокол NAB, исследование C0371004, NCT03587116), в котором не применяется исследуемый препарат (только стандартная заместительная терапия), данные которого, как ожидается, обеспечат исходный уровень для испытуемых, которые впоследствии будут включены в основное исследование 3-й фазы (исследование AFFINE, исследование C3731003, NCT04370054). В исследовании фазы 3 будет оцениваться в первую очередь ABR, а вторичные конечные точки будут включать уровни активности FVIII в стабильном состоянии, годовую частоту инфузии FVIII, годовое потребление FVIII, причину и локализацию ABR, а также изменения состояния суставов в течение 12 месяцев. Это продолжающееся исследование, в котором первый участник получил дозу в октябре 2020 года.

BAY 2599023 разрабатывается компанией Bayer в сотрудничестве с Ultragenyx Pharmaceutical. BAY 2599023 представляет собой AAV-вектор, кодирующий FVIII с удаленным B-доменом, который управляется специфическим для печени промотором и усилителем, оптимизированным для трансгенной экспрессии. Текущее исследование фазы 1/2 с установлением дозы (исследование 19 429, NCT03588299) оценивает безопасность, переносимость и раннюю эффективность 3 возрастающих доз BAY 2599023 у мужчин с тяжелой формой гемофилии А, которые ранее получали лечение препаратами FVIII. Предварительные данные, представленные на ежегодном собрании Американского общества гематологии (декабрь 2020 года), показали, что BAY 2599023 обеспечил ранние измеримые уровни экспрессии FVIII, которые сохранялись (более 18 месяцев) с доказательствами гемостатической эффективности в трех когортах доз (0,5 х 10¹³, 1 х 10¹³ и 2 х 10¹³ копий гена/кг [n = 2 в каждой]) [165]. Несколько пациентов (когорты 2 и 3), которые до генной терапии принимали профилактику FVIII, прекратили профилактику примерно через 6 недель после переноса генов. Те участники, которые достигли уровня FVIII более или равно 15 IU/dL , не сообщали о спонтанных кровотечениях. У обоих участников из когорты 3 был повышен уровень ALT (в 1,5 раза выше верхней границы нормы), и они получали кортикостероиды. В настоящее время в исследование набираются испытуемые (до 30 подходящих взрослых испытуемых).

Генотерапия гемофилии компании Takeda включает TAK-754 (ранее известный как SHP654 и BAX 888), который представляет собой вектор AAV серотипа 8, экспрессирующий FVIII с удаленным доменом B, для лечения гемофилии А. Компания проводит клиническое исследование фазы 1 (исследование 201,501, NCT03370172), которое активно, но не набирает участников.

В 2017 году Shenzhen Geno-immune Medical Institute зарегистрировал клиническое исследование лентивирусного гена FVIII, модифицированного аутологичными гемопоэтическими стволовыми клетками и мезенхимальными стволовыми клетками (исследование GIMI-IRB-17007, NCT03217032), но по состоянию на июнь 2021 года исследование остается в статусе без набора.

Компания Expression Therapeutics зарегистрировала клиническое исследование генотерапии путем трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, включающее лентивирусный вектор, кодирующий высоко экспрессирующий FVIII трансген ET3 (исследование ET3-201) для лечения тяжелой гемофилии A (NCT04418414), но по состоянию на июнь 2021 года исследование остается в статусе отсутствия набора.

Applied StemCell (ASC) Therapeutics, Inc. разработала конструкцию под названием ASC618 (вирусный вектор AAV2/8 HCB-ET3-LCO BDD FVIII), которая представляет собой гибридный вектор AAV2/8, кодирующий BDD, кодон-оптимизированный hFVIII (BDD hFVIII) с синтетическим промотором, направленным на печень (рис. 3). По сравнению с другими клинически протестированными конструкциями для генной терапии, ASC618 имеет самый короткий геном вектора. Конструкция включает специфичный для печени, оптимизированный по кодонам (LCO) биоинженерный BDD hFVIII (ET3) под контролем синтетического печеночного комбинаторного пучка (HCB) промотора.



Рисунок 3. ASC618 Schematic Diagram Expression Cassette. The ASC618 construct consists of an AAV8 vector encoding a codon-optimized hFVIII gene that has been minimized by deleting the B-domain (BDD). The construct is designed to be specifically expressed in liver cells.

ASC618 предназначен для экспрессии белка hFVIII с целью лечения пациентов с тяжелой и умеренно тяжелой гемофилией А. ASC618 поставляется в замороженном виде в виде вирусного вектора в индивидуальных флаконах и вводится путем однократной внутривенной инфузии.

Для создания ASC618 были применены как рациональные, так и эмпирические стратегии конструирования, которые позволили создать минимальный по размеру, высокоэффективный вектор AAV-FVIII, включающий 2 уникальных элемента: 1) минимальный промотор HCB, направленный на печень (146 п.н.) для минимизации размера упаковки и обеспечения более высоких уровней экспрессии белка; и 2) новую биоинженерную молекулу FVIII, ET3, с 10-100-кратным увеличением эффективности биосинтеза, экспрессии и секреции по сравнению со стандартными трансгенами hFVIII (известными как HSQ; BDD белок hfVIII, содержащий 14-аминокислотную человеческую линкерную последовательность SQ вместо B-домена), используемыми в настоящее время в большинстве методов генной терапии гемофилии А. Компания Expression Therapeutics/Emory University охарактеризовала конструкцию HCB-ET3-LCO в мышиной модели гемофилии А и лицензировала ее компании ASC Therapeutics для дальнейшей терапевтической разработки.

Конструкция ASC618 использует химерную молекулу FVIII человека/свиньи, ET3, для повышения эффективности вектора. ET3 - это биоинженерный человеческий белок FVIII BDD с элементами доменов A1 и A3 свиньи (91% человека, 9% свиньи) [86,145,149,157,166,167]. Новая биоинженерная молекула FVIII ET3 (ранее называемая HP47) была разработана на основе BDD рекомбинантного свиного FVIII [149,150]. Рекомбинантный свиной FVIII (rpFVIII, Obizur®) был первоначально разработан в Университете Эмори и одобрен FDA для лечения острых кровотечений у пациентов с приобретенной гемофилией А [168,169]. Была проведена обширная работа по оптимизации фармацевтических свойств белка FVIII путем изучения последовательностей FVIII у различных предковых видов (подход реконструкции предковой последовательности). Были разработаны варианты белка FVIII с улучшенными свойствами по сравнению с существующими биопрепаратами hFVIII, включая повышенную активность, стабильность, потенциал биосинтеза и снижение ингибирования клиническими антителами [170].

Поскольку молекулы rpFVIII и ET3 меньше взаимодействуют с резидентными шаперонами ER и, таким образом, менее склонны вызывать UPR, они секретируются гораздо эффективнее, чем другие конструкции FVIII [145,149,150,171]. В ET3 более высоко экспрессирующиеся последовательности rpFVIII заменяются на A1 и ap-A3 домены рекомбинантного человеческого FVIII. Эта небольшая модификация последовательности (~9%) объясняет замечательное 10--100-кратное улучшение биосинтеза [149].

По сравнению со стандартными стратегиями оптимизации кодонов на уровне генома, стратегии оптимизации кодонов, направленные на ткани, улучшают экспрессию трансгенов FVIII в конкретных типах клеток (например, гепатоцитах). Все текущие кандидаты на получение продукции rAAV-FVIII, проходящие клинические испытания, используют кодон-оптимизированные трансгены. В традиционных стратегиях оптимизации кодонов склонность использования кодонов в целом организме определяется на основе кДНК всего генома, которая, как предполагалось, представляет собой концентрацию переносимой рибонуклеиновой кислоты в каждой отдельной клетке. В действительности, концентрация трансферной РНК в отдельных клетках значительно варьирует среди различных тканей и типов клеток [172].

Используя эту новую стратегию оптимизации кодонов, Doering и коллеги [166] изучили таблицы смещения использования кодонов в зависимости от ткани/типа клеток для оптимизации кодонов в направленной на печень генотерапии AAV для дальнейшего улучшения экспрессии BDD hFVIII (HSQ) и ET3. При трансфекции в клетки HepG2, ET3-LCO демонстрирует значительно более высокую экспрессию, чем миелоидная оптимизация кодонов или нативные не-кодон-оптимизированные cognates[166]. Эффект оптимизации кодонов печени был также подтвержден in vivo в мышиной модели гемофилии А, когда ET3-LCO обеспечил 3-4-кратное увеличение экспрессии по сравнению с ET3-миелоидной оптимизацией кодонов и ET3-не-кодоновой оптимизацией [166].

Оптимальная емкость генома вектора rAAV составляет приблизительно 4,7-4,9 кб [93,157,173]. Векторы rAAV-FVIII обычно превышают эту идеальную длину векторного генома из-за большого размера трансгена и необходимости наличия некодирующих вирусных элементов и элементов контроля регуляции экспрессии генов, что приводит к неадекватной упаковке и доставке трансгена.

Как минимум, геном rAAV-FVIII должен включать промотор, трансген FVIII, сигнал polyA и инвертированные терминальные повторы rAAV, фланкирующие обе стороны кассеты. Только инвертированные терминальные повторы и трансген FVIII требуют 4664 п.н. из имеющихся 4900 п.н.; таким образом, промотор, сигнал polyA и любые другие необходимые последовательности должны уместиться на оставшихся 246 п.н.. Doering и коллеги [166] использовали как случайный комбинаторный, так и рациональный дизайн in silico для решения этой проблемы, создавая синтетические промоторы, которые более компактны, чем существующие промоторы, но при этом способны вызывать сильную экспрессию в гепатоцитах, сохраняя эквивалентную или превосходную транскрипционную производительность. После 3 последовательных раундов конструирования/оптимизации они определили синтетический промотор длиной 146 п.н., названный HCB, который обеспечивает в 20 раз большую продукцию FVIII, чем установленный золотой стандарт промотора HLP, и при этом более чем на 100 п.н. короче. Испытания HCB включали в себя переходную трансфекцию клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы печени человека HepG2 и гидродинамическую инъекцию голой плазмидной ДНК, кодирующей соответствующий геном AAV, мышам модели гемофилии А [166].

Усиленный биосинтез трансгена ET3 обеспечивает значительно лучший терапевтический потенциал по сравнению со стандартной генной терапией гемофилии А, согласно результатам доклинических исследований (Рисунок 4).



Figure 4. AAV Vector Delivery of Tissue-Optimized Transgene Cassettes.

FVIII. Три трансгена, AAV2/8 HCB-HSQ-LCO, AAV2/8-HCB-ET3-LCO и AAV2/8-HLP-V3co, вводили внутривенно в дозе 1 ? 1011 вг/кг мышиной модели гемофилии А (n = 4/группа). Измерялась активность FVIII в плазме в течение 16 часов. Трансген ASC618 продуцировал значительно большую активность FVIII, чем стандартный и контрольный трансгены (рис. 6 C из Brown et al. [166] воспроизведено с разрешения издательства).

ET3 и HSQ сравнивали в неклинических экспериментах по безопасности и эффективности на модели мышей C57Bl/6, на модели обезьян циномольгус и на модели гуманизированной печени мыши (FRG-KO). Во всех трех моделях вектор, содержащий трансген ET3, обеспечивал более высокие уровни FVIII по сравнению с вектором, содержащим трансген HSQ [174].

В мышиной модели C57Bl/6, AAV2/8 HCB-ET3-LCO в дозах 5 x 10¹⁰, 5 x 10¹¹, и 5 x 10¹² vg/кг приводило к стабильной экспрессии человеческого FVIII со средним уровнем ET3 FVIII 50% (0,5 МЕ/мл), 300% (3 МЕ/мл) и 350% (3,5 МЕ/мл) от нормы, соответственно. С другой стороны, лечение AAV2/8 HCB-HSQ-LCO в дозах 5 x 10¹¹ и 5 x 10¹² vg/кг привело к снижению уровня экспрессии HSQ FVIII в 7 раз и 3 раза, соответственно, а при дозе 5 x 10¹⁰ vg/кг. В экспериментах с макаками-циномольгусами наблюдалась аналогичная тенденция; AAV2/8 HCB-ET3-LCO в дозе 5 x 10¹¹ vg/кг вызывал уровень экспрессии почти на 30% (0,3 МЕ/мл) выше нормального. В модели гуманизированной печени FRG-KO лечение ET3 в дозе 3 x 10¹² vg/кг вызывало средние уровни экспрессии человеческого FVIII до 480% (4,8 МЕ/мл) по сравнению с нормой, по сравнению с только приблизительно 30% после лечения HSQ. Более того, в модели FRG-KO гепатоцитов человека введение ASC618 приводило к высокой экспрессии мРНК ET3, как было оценено с помощью анализа RNAScope. Во всех трех моделях исследования безопасности, включая клинические наблюдения, измерение потребления пищи, массы тела и температуры, а также оценку ферментов печени и грубой патологии, не выявили токсичности. Таким образом, ASC618 хорошо переносился в животных моделях и продемонстрировал потенциал для оказания терапевтической пользы пациентам при сниженных дозах вектора [174].

Гемофилия хорошо изучена в качестве мишени для генотерапии. Как доклинические, так и клинические данные указывают на потенциал генной терапии в улучшении качества жизни пациентов путем индукции достаточного синтеза и секреции FVIII для нормализации активности фактора свертывания крови. Однако некоторые ограничения не позволяют доступным в настоящее время методам генотерапии стать окончательным лекарством для всех пациентов. На длительность лечения и долгосрочную безопасность влияет ряд факторов, особенно развитие анти-AAV нейтрализующих антител, ингибиторы продукции трансгенов, гепатоксичность, клеточный стресс и возможность опухолевого генеза.

С целью увеличения продолжительности лечения интенсивные неклинические и клинические исследования направлены на выяснение причин и смягчение клеточного стресса в гепатоцитах, вызванного пост-трансляционным сворачиванием белка FVIII. Всесторонняя оценка демографических, генетических и других индивидуальных факторов также необходима для понимания значительной вариабельности активности FVIII, наблюдаемой у пациентов, получающих лечение.

Генотерапия следующего поколения должна улучшить синтез и секрецию FVIII, одновременно ограничивая развитие анти-AAV нейтрализующих антител и развитие клеточного стресса. Эта цель может быть достигнута с помощью стратегий трансгенной инженерии, которые максимизируют экспрессию трансгена и минимизируют пост-трансляционный клеточный стресс, который потенциально может привести к апоптозу трансфицированных гепатоцитов. Доклинические исследования химерной конструкции человек-свинья в печени мышей дикого типа, гуманизированных мышей и не-человекообразных приматов продемонстрировали 10-100-кратное увеличение синтеза FVIII и снижение клеточного стресса. В ближайшее время будут начаты клинические исследования химерного человек-свинья трансгена FVIII (ASC618, NCT04676048), которые могут подтвердить результаты доклинических исследований, показавших, что по сравнению с полностью человеческим трансгеном фактора VIII химерный человек-свинья трансген позволяет использовать меньшие дозы AAV, обеспечивая при этом достаточный уровень FVIII в сыворотке крови и более длительный эффект лечения.

Развитие генотерапии потребует лучшего понимания клеток-мишеней, например, физиологии гепатоцита как биофабрики для FVIII. Выяснение факторов, влияющих на транскрипцию, трансляцию, пост-трансляцию и секрецию белка, будет иметь решающее значение для повышения эффективности, безопасности и, особенно, долговечности генотерапии. Будущие генные заместительные терапии должны решать задачи продления долговечности экспрессии трансгенов и повышения эффективности терапии у детей. Существующие методы генотерапии ограничены, поскольку трансген не реплицируется в клетке, и поэтому экспрессия трансгена разбавляется и теряется со временем; это особенно актуально для детей. В настоящее время ASC Therapeutics реализует программу редактирования генов с использованием метода редактирования генома in vivo на основе CRISPR/Cas9. Этот метод включает в себя негомологичное соединение концов, которое обеспечивает постоянную хромосомную интеграцию модифицированного человеческого FVIII с удаленным B-доменом в локусе альбумина в клетках печени для предотвращения потери вектора AAV из-за пролиферации гепатоцитов. Такой подход может произвести революцию в лечении гемофилии у молодых пациентов, которые в настоящее время не подходят для стандартной генотерапии.

Прогресс в механистическом понимании введения трансгенов в гепатоциты значительно улучшит наше понимание генотерапии, направленной на печень, для других показаний и заболеваний печени, таких как неалкогольная жировая болезнь печени, алкогольная болезнь печени и гепатит. Создание безопасной, долговечной и стабильной терапии для замены или дополнения недостающих или дефектных белков при широком спектре заболеваний при одновременном снижении бремени для общества и пациентов является конечной целью генотерапии, и последние достижения в этой области обеспечивают многообещающие успехи в ближайшем будущем.