Первые исследования в области генотерапии были направлены на восстановление или усиление экспрессии определенного гена.²¹ В прошлом эта цель достигалась путем введения в ядро искусственно созданной плазмидной ДНК (pDNA) (рис. 2).22 pDNA относится к кольцевым двухцепочечным молекулам ДНК, которые отличаются от хромосомной ДНК клетки. Использование pDNA часто применяется, когда требуется долгосрочная или постоянная экспрессия. Для введения pDNA в ядро необходимы векторы. В зависимости от типа вектора экспрессия может сохраняться в течение длительного периода времени или неопределенно долго. Например, лентивирусы (LVs) интегрируют pDNA в геном хозяина, что приводит к постоянной экспрессии с риском вызвать инсерционный мутагенез.²² Другие вирусные векторы, такие как аденовирус (AV) или адено-ассоциированный вирус (AAV), не интегрируют pDNA в геном хозяина вообще (AV) или только в ограниченной степени (AAV), что приводит к длительной, но в конечном итоге преходящей экспрессии.²³ Невирусные векторы также не приводят к постоянной экспрессии; pDNA, которая не интегрирована, в конечном итоге теряется из-за эффекта разбавления в делящихся клетках.²⁴



Figure 2. Enhancing expression

To restore or augment the level of a particular protein, synthetic mRNA can be delivered into the cytosol or artificially constructed pDNA can be introduced into the nucleus, producing either transient or long-term/permanent effects, respectively.

В настоящее время экспрессия генов также может быть восстановлена или усилена путем доставки в цитозоль синтетической мРНК.²⁵ Одним из ключевых преимуществ использования мРНК является то, что после интернализации клетками она может быть непосредственно переведена в белок для оказания терапевтического воздействия внутриклеточно или внеклеточно, не требуя дальнейших этапов транспортировки или обработки. Еще одним преимуществом является переходная природа мРНК, что снижает риск потенциальных побочных эффектов. Как следствие, терапевтические препараты на основе мРНК обеспечивают больший контроль над продолжительностью воздействия, что позволяет избежать непрерывной экспрессии белков в течение длительного времени после того, как болезни утихнут. Несмотря на меньшее количество барьеров для доставки, чем у pDNA, мРНК также остается сложной для доставки из-за ее неблагоприятных физико-химических свойств (например, большой размер, отрицательный заряд и подверженность деградации нуклеазами). Таким образом, мРНК не может быть легко доставлена в клетки и поглощена ими. Поэтому синтетические мРНК часто включают в невирусные векторы (например, наночастицы или липосомы) для целей доставки и защиты.

В 1998 году Fire и др.²⁶ опубликовали революционную статью о РНК-интерференции (RNAi) - мощном эндогенном механизме, который может быть использован для уничтожения практически любого гена. С момента своего открытия RNAi быстро стала незаменимым инструментом в функциональной геномике и разработке лекарств. Чтобы получить RNAi, малая интерферирующая РНК (siRNA) или pDNA, кодирующая короткую шпилечную РНК (shRNA), должна быть доставлена в цитозоль или ядро, соответственно (Рисунок 3).²⁷ siRNA представляют собой короткие (20-25 п.н.) двухцепочечные молекулы РНК с направляющей (анти-смысловой) и пассажирской (смысловой) нитями. Попадая в цитозоль, siRNA сначала включается в комплекс RNA-induced silencing complex (RISC), после чего пассажирская нить освобождается, а направляющая нить сохраняется. Активированный RISC впоследствии связывает мРНК с последовательностью, комплементарной направляющей нити. Целевая мРНК затем расщепляется и высвобождается, что приводит к деградации образовавшихся фрагментов мРНК под действием нуклеаз. После этого активированная RISC может быть повторно использована в новом цикле для деградации другой молекулы мРНК.



Figure 3. Silencing expression

After entering the cytosol, siRNA can induce RNAi, a process that leads to the degradation of specific target mRNA. Alternatively, pDNA-encoding shRNA can be delivered into the nucleus to achieve long-term/permanent gene silencing.

Подобно синтетической мРНК, siRNA обычно имеет ограниченный внутриклеточный период полу-жизни, составляющий до нескольких дней, и, следовательно, вызывает только временные эффекты.^25,28 Невирусные векторы можно использовать для улучшения поглощения отрицательно заряженных молекул siRNA в легких. ²⁹ Для достижения долговременного или постоянного молчания в ядро может быть доставлена shRNA-кодирующая pDNA. shRNA относится к молекулам РНК длиной ~70 п.н. и самокомплементарным сайтам, которые отжигаются с образованием устойчивой шпильки.³⁰ Однако, прежде чем shRNA сможет индуцировать замалчивание генов, необходимы дополнительные этапы процессинга рибонуклеазами Drosha и Dicer, чтобы превратить ее в миРНК. Полученная миРНК впоследствии индуцирует RNAi, как описано ранее. Хотя этот подход очень эффективен для подавления экспрессии генов в течение длительного периода времени, он может привести к нежелательным побочным эффектам. Drosha и Dicer, например, также участвуют в процессинге эндогенно экспрессируемых микроРНК (miRNAs), которые регулируют экспрессию многочисленных генов. Воздействие этого механизма обработки может сильно повлиять на фенотип клеток.³¹

Механизм RNAi также использует микроРНК, которые представляют собой эндогенно экспрессируемые одноцепочечные молекулы РНК длиной ~22 п.н.³² В цитозоле эти молекулы подавляют экспрессию генов путем расщепления или дестабилизации мРНК мишени или просто препятствуя трансляции. (Рисунок 4). Кроме того, исследования показали, что экспрессия специфических miRNAs подавляется при различных заболеваниях, таких как IPF. ³³ Таким образом, синтетические miRNAs кажутся многообещающими терапевтическими агентами. Потенциальное преимущество miRNAs заключается в том, что они часто нацелены на несколько генов одновременно, тогда как siRNA нацелены только на один конкретный ген. На самом деле, поскольку большинство miRNAs демонстрируют частичную комплементарность последовательности с соответствующей им мРНК, отдельная miRNA может нацеливаться на вплоть до 100 различных мРНК. ³³ Из-за этой частичной комплементарности последовательностей мРНК-мишени редко разрезаются. Вместо этого, будучи включенными в механизм RNAi, miRNAs либо дестабилизируют молекулы мРНК, способствуя деаденилированию и последующему decapping, либо предотвращают трансляцию, стерически препятствуя удлинению рибосомами.



Figure 4. Repressing expression

Upon entering the cytosol, miRNA uses RNAi machinery. Depending on the sequence complementarity, target mRNA can be either cleaved or destabilized or its translation can be hindered. To achieve long-term/permanent effects, pDNA encoding pri-miRNA may be delivered into the nucleus.

Однако, несмотря на потенциал терапевтических средств на основе микроРНК, следует принять во внимание несколько соображений. Подобно миРНК, синтетическая миРНК заряжена отрицательно, что означает, что ее поглощение может быть усилено с помощью невирусных векторов. Кроме того, доставка miRNA в цитозоль вызывает только временные эффекты. В качестве альтернативы, длительная или постоянная экспрессия может быть достигнута путем введения в ядро pDNA, кодирующей первичную микроРНК (pri-miRNA). После транскрипции ферменты Drosha и Dicer, среди прочих, необходимы для процессинга pri-miRNA в miRNA. Следует соблюдать осторожность при выборе этого подхода, поскольку аппарат процессинга pri-miRNA может стать насыщенным, что приведет к измененной экспрессии ряда эндогенно экспрессируемых miRNAs. Хотя плейотропные эффекты миРНК часто воспринимаются как полезные, они также могут вызывать опасения по поводу безопасности. По этой причине целевые транскрипты мРНК для miRNA должны быть тщательно картированы, чтобы избежать репрессии экспрессии основных генов.

Генотерапия явно предоставляет много возможностей для лечения болезней. Поэтому мы рассмотрели опубликованные исследования на животных, поскольку клинические исследования еще не опубликованы. Чтобы найти соответствующие публикации, мы провели поиск в базе данных PubMed/MEDLINE. См. Рисунок S1 для получения дополнительной информации о поиске литературы. Мы обнаружили 53 публикации, в большинстве из которых описывалось использование одного подхода к генотерапии, хотя в некоторых сообщалось об использовании двух. Как показано, первоначальная работа в этой области была сосредоточена исключительно на повышении экспрессии генов в терапевтических целях (рис. 5). Однако в последние годы интересы изменились в пользу подавления генов, которое в настоящее время является наиболее часто публикуемым подходом. Наименее часто сообщается о репрессии экспрессии генов, вероятно, потому, что miRNAs и их эффекты на заболевания все еще находятся в стадии тщательного изучения. Тем не менее, судя по количеству публикаций, существует большой интерес к изучению применения генотерапии для лечения IPF, независимо от используемого подхода. Следовательно, в этом разделе представлены основные результаты и основные моменты выявленных исследований на животных.



Figure 5. Publication trends

(A and B) This figure illustrates the total (A) and cumulative (B) number of publications for each gene therapy approach (i.e., enhancing, silencing, or repressing gene expression).

В 17 публикациях описаны стратегии восстановления или усиления экспрессии в терапевтических целях (Таблица 1). В этих исследованиях для доставки pDNA в ядра клеток использовались либо наночастицы, либо вирусные векторы. Использование терапии на основе мРНК не было описано для лечения фиброза легких in vivo. Если не указано иное, векторы доставки вводились интратрахеально (i.t.). В одном из самых ранних сообщений Эпперли и др.34 описали, что избыточная экспрессия супероксиддисмутазы 2 (SOD2), которая катализирует расщепление супероксида, защищает мышей от фиброза легких после облучения. Однако остается неизвестным, был ли этот результат обусловлен прямым влиянием SOD2 на фиброз или тем, что SOD2 снижала окислительный стресс и, впоследствии, воспаление. В последующем исследовании Эпперли и др.35 дополнительно изучили влияние избыточная экспрессии SOD2. Удивительно, но авторы наблюдали более длительную выживаемость, но не обнаружили заметных изменений в морфологии тканей. Расхождение между результатами этих двух исследований, вероятно, вызвано различиями в векторах доставки (аденовирусы против липосом), дозах радиации (850-950 против 2 000 сГр) или штаммах животных (мыши nude против мышей C57BL/6). В том же году Накао и др.36 сообщили, что фиброз у мышей, вызванный блеомицином, может быть частично подавлен путем избыточной экспрессии члена семьи SMAD 7 (SMAD7), который ингибирует TGF-β сигнализацию путем блокирования образования комплексов SMAD2/SMAD4. Однако подавление сигнала TGF-β может привести к серьезным побочным эффектам, таким как нарушение заживления ран и аберрантная иммунная активация.⁵¹ Первая попытка лечения сформировавшегося фиброза была описана Sisson и др.³⁷ Чтобы стимулировать фибринолиз у мышей, обработанных блеомицином, они вводили аденовирусы, кодирующие plasminogen activator urokinase (PLAU). Хотя у мышей, экспрессирующих PLAU, отложение коллагена было менее обширным, фиброзные очаги почти не обнаруживали экспрессии PLAU, это указывает на то, что терапия предотвратила прогрессирование фиброза, а не привела к деградации существующих коллагеновых отложений. Это наблюдение ясно подчеркивает важность проверки того, достигают ли векторы доставки желаемых целевых участков.

Подавление экспрессии генов является наиболее часто публикуемым подходом, о чем свидетельствует 31 публикация (табл. 2). Примерно в 50% этих исследований сообщалось об использовании голой siRNA, в 25% - об использовании наночастиц, содержащих siRNA, и в 25% - об использовании вирусных векторов, экспрессирующих shRNA. Часто эти агенты вводились интратрахеально, если не указано иное. Для краткости мы остановились на отдельных работах, в которых представлены особенно примечательные терапевтические подходы, дизайн исследований или результаты. В одном из первых исследований Fichtner-Feigl и др.⁵² показали, что подавление субъединицы альфа 2 рецептора интерлейкина 13 (IL-13RA2), который, как считалось ранее, служит только в качестве рецептора-приманки для IL-13, защищает мышей от фиброза, вызванного блеомицином. Авторы описали механизм, вызывающий этот эффект, и обнаружили, что IL-13 активирует промотор TGF-β1 через IL-13RA2 в STAT6-независимой и AP1-зависимой манере. Помимо терапевтического применения, siRNA также продемонстрировали свою незаменимость в исследованиях потери функции, как это было показано в работе Li et al.⁵³ , которые наблюдали больше фиброзных поражений у обработанных блеомицином мышей при подавлении ACE2. Более того, это исследование было одним из первых, показавших, что местное введение голой siRNA может быть использовано для подавления экспрессии генов в альвеолярных эпителиальных клетках без использования трансфекционных реагентов. Использование голой siRNA было также описано Hecker и др.⁵⁴ , которые ослабили TGF-β1- индуцированную дифференцировку миофибробластов, а также отложение коллагена путем глушения NADPH оксидазы 4 (NOX4) у мышей, подвергшихся воздействию блеомицина или FITC. Однако иммуногистохимическое окрашивание показало отсутствие подавления NOX4 в фиброзных очагах, это указывает на то, что голая siRNA не диффундировала в фиброзный ECM. В следующем году Senoo et al.⁵⁵ сообщили, что подпвление члена 1 (PAI1) семейства серпинов Е способствует фибринолизу у мышей с фиброзом, вызванным блеомицином. В этом случае авторы интраназально вводили голую siRNA, которая была поглощена только бронхиальным эпителием и эпителиальными клетками, выстилающими фиброзные очаги. Эти исследования показывают, что голая siRNA может быть непригодна для подавления генов, которые экспрессируются исключительно в сформировавшихся фиброзных очагах, возможно, из-за нарушения диффузии.



Table 2. Silencing expression in vivo

Лечение было либо профилактическим, когда его проводили в период зарождения фиброза, либо терапевтическим, когда его проводили животным с уже сформировавшимся фиброзом. Уменьшение фиброза обозначено стрелками, направленными вниз , а усугубление - стрелками, направленными вверх. Более подробную информацию о соответствующих наночастицах см. в таблице S1.

Несмотря на эту потенциальную проблему доставки, голые siRNA все же могут быть использованы для подавления развития фиброза в непораженных участках легких. Например, Kim и др.⁵⁷ изучали, обеспечивает ли подавление катенина бета 1 (CTNNB1), который является посредником передачи сигналов Wnt/β-катенина, защиту от фиброза, вызванного блеомицином. Ингибирование этого пути с помощью голой siRNA успешно снизило содержание коллагена в легких мышей, не повлияв на воспаление. Очевидно, что siRNA можно использовать и для блокирования других сигнальных путей. Например, Dong и др.⁵⁸ подавляли экспрессию SMAD3, чтобы предотвратить передачу сигналов TGF-β1. В результате авторы наблюдали меньше гистопатологических изменений у мышей с фиброзом, вызванным паракватом. В продолжение работы Kim и др.⁵⁷ , которые показали, что подавление CTNNB1 подавляет фиброз, вызванный блеомицином, Wang и др.⁶⁴ провели исследование, чтобы определить, можно ли наблюдать аналогичный эффект у мышей с фиброзом, вызванным кремнеземом. Тестирование терапии на разных моделях является полезным, поскольку патологические особенности значительно отличаются друг от друга (например, повреждение клеток блеомицином по сравнению со стимуляцией тканевой реакции на частицы кремнезема).⁸² В конечном итоге, данное исследование подтверждает ранее полученные результаты, поскольку силикотические узелки были значительно меньше и менее многочисленны у мышей, прошедших лечение. Однако остается неясным, какие клетки больше всего страдают при подавлении CTNNB1. Некоторые данные указывают на участие эндотелиальных клеток легочных капилляров (PCECs), как показали Cao и др.⁶⁵ , которые обнаружили, что сигналы Wnt/β-катенина в PCECs способствуют развитию фиброза путем повышения уровня jagged canonical Notch ligand 1 (JAG1), который, в свою очередь, усиливает сигналы Notch в близлежащих периваскулярных фибробластах. Фактически, подавление JAG1 с помощью внутривенно вводимых лентивирусов, экспрессирующих shRNA, было показано для подавления фиброза, вызванного блеомицином, у мышей. Таким образом, ингибирование этих сигнальных путей представляется мощной стратегией для контроля фенотипа миофибробластов. При этом мало что известно о долгосрочных последствиях; возможно, активируются механизмы компенсации для противодействия анти-фибротическим эффектам.⁸³

Достоинство тестирования генотерапии на различных моделях фиброза также было продемонстрировано Yoon et al.,⁶⁷ которые исследовали, защищает ли подавление факторов роста амфирегулина (AREG) и фактора 2 клеточной коммуникационной сети (CCN2) после воздействия блеомицином и TGF-β1. -трансгенных мышей от фиброза. Независимо от модели фиброза и пути введения (интраназально или внутривенно) содержащие siРНК наночастиц заметно улучшали морфологию легочной ткани и снижали продукцию COL1A1 и FN. Это исследование также показало, что при внутритрахеальном введении наночастицы легко поглощались клетками дыхательных путей и альвеолярного эпителия, мезенхимными клетками, макрофагами и Т-клетками. Zhao et al.⁶⁸ также использовали две модели фиброза (т. е. вызванный блеомицином и FITC-индуцированный фиброз). После подавления экспрессии discoidin domain receptor tyrosine kinase 2 (DDR2) у мышей с помощью интраназально вводимой голой siRNA авт. наблюдали снижение дифференцировки миофибробластов в обеих моделях. Интересно, что поскольку DDR2 в основном экспрессируется мезенхимальными клетками в фиброзных поражениях, это исследование предполагает, что голая siRNA действительно диффундирует в фиброзные поражения, тем самым противореча обсуждавшимся ранее публикациям. Это несоответствие, однако, не может быть легко объяснено и требует последующих исследований, чтобы охарактеризовать кинетику диффузии голой siRNA в имеющиеся фиброзные поражения. Та же рекомендация применима к исследованиям, проведенным Kurundkar et al.,⁶⁹ которые подавляли фиброз, вызванный блеомицином, у мышей путем интраназального введения голой siRNA для подавления экспрессии фактора клеточной коммуникационной сети фактора роста 1 (CCN1), тем самым ингибируя передачу сигналов TGF-β1/SMAD2-3. CCN1 обычно экспрессируется в зонах активного фиброза, но поскольку siRNA доставлялась во время начала фиброза, было невозможно определить, может ли голая siRNA влиять на уже имеющиеся фиброзные поражения. В качестве альтернативы, передача сигналов TGF-β1/SMAD2-3 также может быть подавлена путем подавления экспрессии фукозилтрансферазы 8 (FUT8), которая способствует активности субъединицы β TGF-β1 и тромбоцитарного фактора роста. Активация (PDGFβ) посредством фукозилирования ядра, как описано Sun et al. ⁷¹. В этом исследовании на мышах, получавшим блеомицин, внутривенно вводили экспрессирующие shRNA аденовирусы, что приводило к меньшему отложению коллагена.

В последнее время разрабатываются методы лечения с использованием нескольких siRNA, поскольку они позволяют одновременно подавлять различные пути. Вдобавок ко всему, использование нескольких миРНК в сочетании с антифибротическим соединением может быть еще более эффективным из-за синергетического эффекта, как продемонстрировали Garbuzenko и др. ⁷³. Это исследование изящно показало, что фиброз, вызванный блеомицином у мышей, более эффективно подавлялся с помощью наночастиц, содержащих простагландин E2 (PGE2), а также siРНК, нацеленный на матричную металлопептидазу 3 (MMP3), хемокиновый лиганд 12 с мотивом CC (CCL12) и субъединицу альфа фактора 1, индуцируемого гипоксией (HIF1A), чем наночастицы, содержащие только PGE2 или siRNAs. Альтернативный подход к уменьшению накопления миофибробластов был протестирован Ding et al.,⁷⁸ которые попытались стимулировать фибринолиз путем подавления PAI1 при одновременном ингибировании C-X-C-хемокинового рецептора типа 4 (CXCR4)-опосредующего рекрутирование фиброцитов. В этом случае авторы инкапсулировали в наночастицы производные siRNA и cyclam с высоким сродством к CXCR4, которые оказывали сильное анти-фибротическое и противовоспалительное действие у мышей с фиброзом, вызванным блеомицином. Терапевтические эффекты, однако, в основном были связаны с подавлением активности PAI1, потому что наночастицы, ингибирующие CXCR4, сами по себе вызывали лишь скромные эффекты. Ding et al.⁷⁹ также разработали комбинированную терапию для лечения фиброза. Их цель состояла в том, чтобы определить, может ли одновременное подавление секретируемого протеина, кислого и богатого цистеином (SPARC), хемокинового рецептора 2 с мотивом CC (CCR2) и SMAD3 защитить мышей от фиброза, вызванного блеомицином. Поэтому siRNAs инкапсулировали в наночастицы и вводили внутрибрюшинно (i.p.). Хотя авторы не охарактеризовали биораспределение этих наночастиц, они наблюдали успешное подавление соответствующих генов-мишеней в легких, что приводило к уменьшению отложения коллагена и воспалению. Остается неизвестным, вызывало ли одновременное замалчивание SPARC, CCR2 и SMAD3 синергические эффекты, поскольку эффекты отдельных siRNAs не тестировались. В любом случае, эти исследования показывают, что экспрессия специфических генов может быть подавлена, чтобы ослабить множество процессов, связанных с фиброзом, с использованием либо голой siRNA, либо siRNA-содержащих наночастиц, либо вирусных векторов, экспрессирующих shRNA.

Только в нескольких исследованиях изучалось, подходит ли добавление миРНК для лечения фиброза (таблица 3). В этих исследованиях уровни miRNA у животных дополняли с использованием либо голых miRNA, miRNA, конъюгированных с холестерином, либо вирусных векторов/наночастиц, экспрессирующих pri-miRNA. Эти агенты вводили интратрахеально, если не указано иное. В одном из первых отчетов Xiao et al.⁸⁴ исследовали, ослабляет ли добавление miR-29b вызванный блеомицином индуцированный фиброз. Чтобы дополнить miR-29b, авторы внутривенно вводили мышам наночастицы, кодирующие pri-miRNA, что приводило к уменьшению отложения коллагена и инфильтрации макрофагов. Однако экспрессия α-гладкомышечного актина (α-SMA) оставалась неизменной. Это указывает на то, что miR-29b влияет на синтез ECM, но не на накопление миофибробластов. В последующих исследованиях Montgomery et al.⁸⁵ дополнительно изучили эффекты miR-29b. В этом исследовании мышам, получавшим блеомицин, внутривенно вводили устойчивую к нуклеазе конъюгированную с холестерином miR-29b. Эти конструкции поглощались легкими, где они подавляли выработку коллагена и провоспалительных цитокинов. В качестве следующего шага все взаимодействия miRNA-mRNA должны быть всесторонне картированы, чтобы определить, как miR-29b влияет на фиброз. Конъюгированные с холестерином микроРНК также использовались Ji et al.,⁸⁶ которые защищали мышей от фиброза, вызванного блеомицином и силикагелем, путем добавления miR-486-5p. Последующие анализы показали, что miR-486-5p по меньшей мере частично снижает отложение коллагена за счет связывания мРНК SMAD2 в 3'нетранслируемой области (UTR), тем самым ингибируя передачу сигналов TGF-β1. Чтобы оценить эффекты добавки miR-503, Yan et al. ⁸⁷ вводили голую miRNA мышам, получавшим кремнезем, и наблюдали снижение EMT, а также меньшее количество гистопатологических изменений. Инициация ЕМТ, вероятно, была затруднена из-за взаимодействия между miR-503 и 3' UTR мРНК фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K). Кроме того, хотя распределение голой miR-503 в легких не изучалось, эти данные указывают на то, что не только голая siRNA, но и голая miRNA способна трансфицировать клетки легкого без использования реагентов для трансфекции.



Table 3. Repressing expression in vivo

Лечение было либо профилактическим, когда его вводили в начале фиброза, либо терапевтическим, когда его вводили животным с установленным фиброзом. Уменьшение фиброза показано стрелками, направленными вниз , а обострение - стрелками, направленными вверх . См. Таблицу S1 для получения более подробной информации о соответствующих наночастицах.

Поскольку подавление miR-18a-5p усугубляет фиброз in vivo, Zhang et al. ⁷² исследовали, обеспечивает ли добавление miR-18a-5p защиту от установившегося фиброза, вызванного блеомицином. Мышам внутрибрюшинно вводили лентивирусы, кодирующие pri-микроРНК, которые трансдуцировали клетки в легочную ткань и впоследствии уменьшали отложение коллагена путем ингибирования передачи сигналов TGF-β1/SMAD2-3. Вскоре после этого Zhang et al.⁸⁸ сообщили, что добавление miR-30a подавляло накопление миофибробластов и уменьшало количество фиброзных поражений у мышей, подвергшихся воздействию блеомицина. Тем не менее, еще неизвестно, подходит ли miR-30a для лечения фиброза, поскольку она также нацелена на белок B-клеточной лимфомы 6 (BCL6), опухолевой супрессор p53 (P53) и с runt-related transcription factor 2 (RUNX2), среди прочего. , потенциально вызывая широкий спектр побочных эффектов. Влияние miR-200b/c на фиброз было оценено Cao et al. ⁷⁷ Добавление miR-200b/c мышам, получавшим LPS, улучшало внешний вид ткани и снижало выработку TGF-β1. EMT также был ослаблен, вероятно, потому, что miR-200b/c регулирует E-box цинковые пальчики, связывающий гомеобокс 1 (ZEB1) и ZEB2, которые, как известно, способствуют EMT. Наконец, Yuan et al. ⁸⁹ исследовали, может ли внутривенная инъекция устойчивой к нуклеазе голой miR-542-5p обратить вспять имеющийся фиброз, вызванный силикагелем, у мышей. Этот подход эффективно подавлял производство COL1A1 и FN, а также степень ЕМТ. Было также показано, что miR-542-5p связывается с 3' UTR мРНК интегрина альфа 6 (ITGA6), что приводит к нарушению передачи сигналов киназы фокальной адгезии (FAK)/PI3K/AKT. В совокупности публикации, обсуждаемые в этом разделе, демонстрируют, что терапевтические средства на основе микроРНК обладают большим потенциалом, поскольку они одновременно репрессируют несколько генов, связанных с фиброзом. Несмотря на эти многообещающие результаты, не все взаимодействия микроРНК-мРНК были картированы, что вызывает опасения по поводу безопасности, поскольку в конечном итоге могут развиться побочные эффекты. Методы профилирования транскриптома, такие как секвенирование нового поколения, следует чаще использовать для характеристики таких взаимодействий.

За прошедшие годы был достигнут значительный прогресс в применении генотерапии для лечения легочного фиброза in vivo. Действительно, данное исследование литературы подтвердило, что генотерапия предлагает захватывающие и многообещающие новые возможности для ослабления широкого спектра процессов, участвующих в развитии фиброза (рис. 6). Хотя все три подхода генотерапии (т.е. усиление, глушение или подавление экспрессии) показали свою эффективность, использование siRNA представляется наиболее перспективным, поскольку она имеет более благоприятный профиль безопасности, чем миРНК, и поскольку siRNA должна преодолевать меньше биологических барьеров, чем pDNA. На данный момент трудно выделить конкретную мишень, которая является наиболее подходящей, поскольку практически все они ослабляли фиброз. Это может указывать на то, что генотерапия должна быть направлена одновременно на различные процессы. В большинстве случаев терапия либо подавляла, либо останавливала прогрессирование фиброза. Однако в одном исключительном случае фиброз был частично обращен вспять (например, путем усиления экспрессии TERT); необходимо провести последующие исследования, чтобы проверить, насколько безопасен этот подход. Несмотря на эти обнадеживающие результаты, мы выявили несколько проблем, которые необходимо решить, прежде чем переводить терапию в клинические испытания. В этом разделе мы обсудим эти проблемы, касающиеся выбора и использования животных моделей, а также разработки векторов доставки и лекарственных форм, и дадим рекомендации для будущих исследований.



Figure 6. Successful gene therapy approaches

Enhancing gene expression and supplementing miRNA levels are denoted by upward-pointing arrows and gene silencing by downward-pointing arrows .

Тщательный выбор животных моделей необходим для углубления нашего понимания предлагаемых методов лечения животных с легочным фиброзом. До сих пор наиболее часто сообщается об использовании блеомицина (рис. 7). Лишь в нескольких публикациях описывается использование различных моделей, и еще меньше - использование более чем одной модели. Хотя блеомициновая модель позволила получить ценные сведения о патогенезе легочного фиброза и потенциальных терапевтических мишенях, она не отражает всех патофизиологических особенностей IPF, равно как и другие модели не учитывают всех аспектов. Фактически, каждая модель демонстрирует свой патологический фенотип.^20,82,90 Например, фиброз, вызванный кремнеземом, характеризуется незначительной или умеренной инфильтрацией иммунных клеток, а также образованием узелковых фиброзных поражений, тогда как фиброз, вызванный блеомицином и паракватом, характеризуется сильным воспалением и более диффузным фиброзом.⁸² Кроме того, известно, что паракват вызывает геморрагические поражения. Учитывая эти различия, важно определить, оказывают ли успешные методы лечения антифибротический эффект и в других соответствующих не блеомициновых моделях. Кроме того, появляются новые данные о том, что пожилые мыши более восприимчивы к фиброзу и демонстрируют ухудшенное разрешение и регенерацию после повреждения, что более точно отражает патогенез IPF.⁹¹ Поэтому оценка генной терапии на пожилых мышах может быть целесообразной, если анти-фибротический эффект уже продемонстрирован на молодых мышах. Однако использование пожилых мышей не рекомендуется на ранних стадиях исследований из-за значительных финансовых и практических трудностей, связанных с содержанием когорты пожилых животных.



Figure 7. Animal models

(A and B) This figure depicts the total (A) and cumulative (B) number of publications for each disease model (e.g., bleomycin, radiation, silica).

Другая проблема заключается в том, что большинство видов терапии применяли профилактически до или вскоре после воздействия на животных фиброгенных агентов, таких как блеомицин (рис. 8). Это проблема, поскольку у пациентов обычно диагностируется установленный фиброз, а начало экспериментального фиброза часто обусловлено воспалением, а это означает, что терапевтические результаты, скорее всего, будут искажены противовоспалительным эффектом терапии.²⁰ Блеомицин, например, вызывает триггеры. сильное воспаление в течение первых 2 недель после заражения. Вклад воспаления в IPF, однако, менее очевиден.⁹² На самом деле было показано, что иммуносупрессивная терапия увеличивает смертность и госпитализацию среди пациентов, как показало исследование PANTHER-IPF (ClinicalTrials.gov: NCT00650091), в котором комбинация преднизона, азатиоприна и N-ацетилцистеина сравнивали с плацебо. Кроме того, существуют заметные различия в молекулярных и гистологических особенностях между ранним и развившимся фиброзом; некоторые процессы более выражены на ранней стадии (например, острое воспаление), в то время как другие становятся более заметными позже (например, сшивка коллагена)⁹⁴. Это приводит к зависимому от времени синтезу белков ВКМ⁹⁵. Таким образом, ранний фиброз с большей вероятностью предотвратит прогрессирование фиброза, а не улучшит существующие фиброзные поражения. Чтобы улучшить их клиническую трансляцию, генотерапию следует назначать животным, когда воспаление в значительной степени стихло и началось отложение внеклеточного матрикса (например, через 14-28 дней после интратрахеальной инстилляции блеомицина). генные терапии.



Figure 8. Treatment strategy

(A and B) This figure shows the total (A) and cumulative (B) number of publications for each treatment strategy. Treatments were prophylactic when administered during the onset of fibrosis or therapeutic when administered to animals with established fibrosis.

После определения терапевтических концепций можно предпринять шаги для разработки подходящих лекарственных форм. Легочное введение явно предпочтительнее, так как оно приводит к доставке генетического материала в определенные места в легкие и ограничивает побочные эффекты в других органах, включая нежелательное накопление векторов доставки в печени.96 Местное введение также значительно улучшает период полувыведения генетического материала благодаря предотвращению почечного клиренса и нуклеолитической деградации. Однако перед выбором ингаляционных устройств и составов может потребоваться разработка векторов доставки, чтобы гарантировать, что генетический материал будет доставлен (в) в клетки-мишени, такие как макрофаги, эпителиальные клетки или миофибробласты. Из всех разработанных векторных технологий доставки ионизируемые липидные наночастицы являются наиболее клинически продвинутыми. США и Европейский союз в 2018 г.⁹⁸ Преимущество ионизируемых липидных наночастиц заключается в том, что их можно использовать для эффективного переноса миРНК, микроРНК и мРНК в цитозоль клеток. Общие побочные эффекты патисирана носят легкий характер и включают периферические отеки и инфузионные реакции. Хотя такие побочные эффекты не обязательно исключают терапевтический успех, частое введение и соответствующие побочные эффекты могут привести к тому, что пациенты либо воздержатся от терапии, либо прекратят ее.

В зависимости от типа генетического материала и клеток-мишеней транспортировка и поглощение могут быть относительно легкими или (чрезвычайно) трудными. Поглощение siRNA и miRNA, например, может происходить без использования векторов доставки, тогда как поглощение pDNA ядром невозможно, поэтому требуется использование наночастиц или вирусных векторов. Однако использование векторов доставки сильно влияет на то, какие клетки могут быть достигнуты. Миофибробласты, например, встроены в огромное количество богатого коллагеном плотно сшитого ВКМ, что ограничивает диффузию больших молекул и наноразмерных структур ECM вообще.⁹⁹ Способствующие факторы включают стерические взаимодействия (столкновения между генетическим материалом и матриксными белками), гидродинамические взаимодействия (уменьшение движения окружающих молекул воды) и электростатические взаимодействия (силы притяжения или отталкивания между заряженными компонентами).¹⁰⁰ Диффузия голых миРНК и микроРНК, вероятно, также в некоторой степени нарушены, поскольку эти молекулы были преимущественно обнаружены в бронхиальном эпителии, но не так сильно в фиброзных поражениях. Поэтому крайне важно определить, достигает ли голый или инкапсулированный генетический материал нужных клеток-мишеней; клинические данные отсутствуют и весьма желательны.

Выбор ингаляторов также требует тщательного обдумывания. Обычно используются небулайзеры, ингаляторы с мягким туманом, dry powder inhalers (DPIs) и дозирующие ингаляторы под давлением.⁹⁶ Из всех этих ингаляторов DPIs предпочтительны для доставки генетического материала, который значительно более стабилен в сухом состоянии, чем в водном растворе.¹⁰¹ DPIs также относительно недороги и эффективно доставляют лекарственные препараты в легкие, если частицы порошка имеют аэродинамический диаметр от 1 до 5 м.¹⁰² Тем не менее, в настоящее время неясно, подходят ли DPIs для пациентов, страдающих IPF; доставка частиц порошка к фиброзным поражениям может быть сильно затруднена из-за искажения архитектуры легких. Однако есть основания полагать, что DPIs подходят для лечения пациентов с IPF. В 2016 году компания Galecto Biotech (Копенгаген, Дания) успешно завершила исследование фазы 1b/2a (ClinicalTrials.gov: NCT02257177) по изучению безопасности, переносимости и фармакокинетики ингибитора галектина 3 GB0139 (который принимался один раз в день с помощью DPI в течение 2 недель) у здоровых добровольцев и пациентов с IPF. Хотя результаты этого клинического исследования еще не опубликованы, компания Galecto Biotech недавно объявила в пресс-релизе, что DPI-формула GB0139 была безопасной и хорошо переносилась пациентами. Поэтому компания Galecto Biotech начала международное исследование фазы 2b (ClinicalTrials.gov: NCT03832946) для дальнейшей оценки клинической эффективности и безопасности GB0139 у пациентов с IPF. Очевидно, что необходимы дальнейшие исследования для подтверждения того, действительно ли DPI хорошо переносятся пациентами с IPF, а также для определения того, осаждаются ли сухие порошковые препараты в субплевральных областях, где присутствуют фиброзные поражения.

Был достигнут значительный прогресс в разработке генной терапии для лечения ИПФ. Данное литературное исследование подтвердило, что различные подходы генной терапии были успешно применены in vivo для ослабления широкого спектра процессов, связанных с фиброзом, включая дифференцировку миофибробластов, синтез ECM, EMT и многие другие. Наиболее перспективным представляется использование siRNA, поскольку она имеет более благоприятный профиль безопасности, чем miRNA, и поскольку siRNA должна преодолевать меньше биологических барьеров, чем pDNA. Однако в настоящее время невозможно точно определить конкретную (лекарственную) мишень, которая является наиболее подходящей, поскольку почти все они ослабляли фиброз. В большинстве случаев терапия либо замедляла, либо останавливала прогрессирование фиброза. В исключительном случае, однако, было показано, что установленный фиброз можно частично обратить вспять путем усиления экспрессии TERT. Несмотря на эти многообещающие результаты, мы выявили ряд проблем, связанных с дизайном экспериментов на животных, а также с разработкой векторов доставки и лекарственных форм. Для более точного прогнозирования терапевтических результатов у пациентов с IPF необходимо исследовать анти-фибротическое действие генотерапии в различных моделях фиброза, когда воспаление в значительной степени спало, а фиброз явно начался. Кроме того, крайне важно проверить, достигает ли генетический материал, будь то голый или сформулированный в векторах доставки, клеток-мишеней, особенно если они локализованы в фиброзных поражениях. Эффективные методы лечения предпочтительно применять с помощью DPI, поскольку ингаляция обычно обеспечивает специфическую доставку в легкие, ограничивая при этом побочные эффекты в других органах. Однако, поскольку архитектура легких у пациентов с IPF искажена, необходимо начать клинические испытания для изучения эффективности и хорошей переносимости DPI. Учет этих соображений еще на один шаг приблизит потенциально жизненно важные генные терапии к клиническим испытаниям, а значит, и к пациентам.