Клетки скелетных мышц (миофибриллы) обеспечивают физическое движение и часто повреждаются при напряженной деятельности, перегрузках и эксцентрических сокращениях (1, 2). Мутации, которые увеличивают хрупкость миофибрилл или препятствуют восстановлению, приводят к дегенерации мышц и мышечным дистрофиям (3). Миопатия Miyoshi (ММ) и мышечная дистрофия пояса конечностей 2B (LGMD2B) - две такие аутосомно-рецессивные мышечные дистрофии, которые проявляются в раннем взрослом возрасте и приводят к прогрессирующей слабости и истощению скелетных мышц (4). Эти заболевания (в совокупности называемые dysferlinopathy) вызываются мутациями в гене DYSF, который кодирует большой (237 кДа) белок мышечной мембраны - dysferlin (5, 6). Еще до открытой дегенерации мышц в миофибриллах пациентов с нарушениями dysferlin наблюдаются дефекты плазматической мембраны (сарколеммы), включая разрывы мембраны, экструзии, субсарколеммальное накопление везикул и вакуолей, а также утолщение базальной пластинки (7). Предполагается, что эти ранние аномалии вызваны плохим восстановлением сарколемных повреждений (7, 8). Повреждение сарколеммы миофибрилл восстанавливается в результате сложного сигнального процесса, активируемого вызванным травмой притоком внеклеточного кальция, который нарушается при дефиците дисферлина (9, 10). Нарушение или недостаток восстановления миофибрилл активирует хронические воспалительные реакции и приводит к дегенерации мышц, что является характерной особенностью скелетных мышц с дисферлинопатией (11-13).

Восстановление повреждений плазматической мембраны включает в себя кальцием запускаемую потерю и слияние везикул, чему способствуют кальций-связывающие белки, в том числе synaptotagmins (9, 14-22). Подобно синаптотагминам, дисферлин является членом семейства белков с доменом С2, которые связывают отрицательно заряженные мембранные фосфолипиды кальций-зависимым образом (23, 24). Мы показали, что дисферлин опосредует восстановление сарколеммы путем связывания лизосом с плазматической мембраной, способствуя немедленному экзоцитозу лизосом при повреждении мембраны (10). Это позволяет секретировать лизосомальный фермент acid sphingomyelinase (ASM) в течение нескольких секунд после повреждения сарколеммы, что необходимо для восстановления (25, 26). Отсутствие дисферлина задерживает и уменьшает вызванный травмой экзоцитоз лизосом, тем самым замедляя и снижая секрецию ASM поврежденной клеткой (10). Следовательно, снижение секреции ASM поврежденными дисферлинопатическими мышечными клетками или отсутствие выработки ASM в клетках с болезнью Нимана-Пика типа А (NPDA) нарушает восстановление их сарколеммы (10, 26). Эти недостатки предопределяют добавление внеклеточного ASM как потенциальный метод лечения для улучшения восстановления миофибрилл у пациентов с LGMD2B и NPDA.

После секреции во внеклеточную среду ASM гидролизует липиды сфингомиелина плазматической мембраны до церамида, что способствует удалению поврежденных участков плазматической мембраны путем сброса extracellular vesicle (ECV) и эндоцитоза (25, 27). Было обнаружено, что плазматическая мембрана, поврежденная поры образующими токсинами, подвергается как сбросу ECV, так и эндоцитозу в кавеолах (28, 29). Токсины колокализуются с гликозилфосфатидилинозитолом (GPI), который маркирует эндосомы, образованные клатрин-независимыми переносчиками (CLICs) (30, 31). Однако детали того, как ASM помогает восстанавливать физиологические (фокальные или механические) повреждения плазматической мембраны, остаются нерешенными. Понимание роли ASM в восстановлении физиологических повреждений мембраны имеет решающее значение для разработки методов лечения заболеваний, связанных с механически индуцированными повреждениями плазматической мембраны, которые поражают мышцы, легкие и другие органы.

Доклинические методы генотерапии LGMD2B, включающие повторную экспрессию гена дисферлина в скелетных мышцах, привели к неоднозначным, но в целом положительным терапевтическим перспективам (32-34). Однако продвижение этих методов лечения в клинику требует преодоления барьеров, связанных с эффективной упаковкой и доставкой в скелетные мышцы большого гена дисферлина (35). Лекарственные методы лечения предлагают альтернативу, но в настоящее время нет одобренных препаратов для лечения этого или другого заболевания этиологии дисферлинопатии. Доклинические исследования показывают, что препараты, стабилизирующие сарколемму, могут способствовать восстановлению миофибрилл и улучшению функции дисферлинопатических мышц (36, 37). Наши предыдущие исследования показали, что ASM улучшает восстановление дисферлинопатических миофибрилл (10). Доклинические и исследования на людях с использованием внутривенной доставки hASM и hASM, нацеленного на печень и доставляемого с помощью адено-ассоциированного вируса (hASM-AAV), показали их эффективность и при других показаниях (38-41). Недавние работы также продемонстрировали клиническую безопасность hASM для лечения NPDA (42, 43). Однако пригодность этого подхода для устранения дефицита скелетных мышц при LGMD2B или NPDA не проверялась. Здесь мы исследуем in vitro эффективность белка hASM и in vivo эффективность генотерапии hASM-AAV, не нацеленной на мышцы, для улучшения восстановления сарколеммы, используя мышечные клетки пациентов и мышиные модели LGMD2B. Мы также используем мышиную модель LGMD2B для изучения потенциала генотерапии hASM-AAV для хронического улучшения восстановления миофибрилл, мышечной гистопатологии и функции мышц.



Figure 6 Single dose of liver-targeted hASM-AAV improves muscle histology and function in LGMD2B model. (A) H&E-stained image of quadriceps (rectus femoris) muscle cross sections of B6A/J mice after treatment with a single intravenous dose of control-AAV or hASM-AAV (arrowheads mark inflammatory foci). (B) Images showing rectus femoris muscle cross sections labeled using anti-laminin antibodies (green) and DAPI (blue) to visualize basement membrane and myonuclei, respectively. (C) Plot showing quantification of inflammatory foci in the quadriceps (rectus femoris) muscle cross section similar to those shown in panel A (n = 5 mice per group). (D) Plot showing quantification of centrally nucleated myofibers across the rectus femoris muscle as shown in panel A, expressed as percentage of total fibers. (E) Distribution of myofiber cross-sectional areas across the entire quadriceps (n = 3,000 fibers per group). (F) Images and (G) quantification of Masson's trichrome staining of the rectus femoris muscle cross section (n = 5 per group). (H) Quantification of forelimb grip strength of mice treated as indicated, with the contractile force normalized to body weight (n = 5 mice per group, average of 5 repeat measures per mouse. (I) Images and (J) quantification of perilipin-positive area in the rectus femoris muscle cross section (red, perilipin; green, WGA). (K) Quantification of hindlimb grip strength of mice treated as in panel H. Data are presented as mean ± SEM. *P < 0.05 (hindlimb) vs. control-AAV (forelimb, P > 0.05). Scale bars: 100 &µm (A and I) and 200 ?m (B and F). Data were assessed via independent samples t test (C, D, and G-K) or Mann-Whitney U test (E), with α set at P < 0.05.

Восстановление клеточного дефицита, вызванного отсутствием белка дисферлина, может быть потенциальным терапевтическим подходом для LGMD2B. В дополнение к текущим усилиям по генотерапии, направленным на восстановление экспрессии большого белка дисферлина в мышцах пациентов с LGMD2B, наша работа предлагает альтернативный подход. Используя направленную на печень экспрессию белка (ASM), который почти в 4 раза меньше дисферлина, мы устраняем последствия дефицита дисферлина. Это дало доклинические преимущества, сравнимые с восстановлением дисферлина в скелетных мышцах. Ранее мы показали, что дисферлин обеспечивает быстрый и эффективный лизосомальный экзоцитоз, необходимый для своевременной секреции ASM, который помогает травмированным мышечным клеткам восстанавливать частые повреждения мембраны (10). Недостаточное выделение ASM поврежденными клетками - это дефицит, характерный как для пациентов с LGMD2B, так и для пациентов с NPDA (10, 26). Однако мы обнаружили, что в отличие от NPDA, в мышцах с дефицитом дисферлина не наблюдается недостаточной экспрессии ASM (Дополнительный рисунок 4). Увеличение внеклеточного hASM улучшает здоровье мышц в мышиной модели LGMD2B за счет улучшения восстановления плазматической мембраны посредством усиленного CLIC-опосредованного эндоцитоза (рис. 2 и 3). CLICs способствуют эндоцитозу дисферлина (44), локализуются с порs образующими токсинами, связанными с плазматической мембраной (30), и, как показано здесь, эндоцитоз CLIC тесно связан с восстановлением плазматической мембраны, опосредованным ASM (29).

Экзогенное введение hASM безопасно для человека и показывает терапевтическую эффективность в лечении симптомов, вызванных дефицитом ASM у пациентов с NPD (39, 55). Однако в этих исследованиях не оценивалась способность hASM улучшать восстановление мембраны и не оценивалась его эффективность в лечении LGMD2B - заболевания, вызванного не отсутствием выработки ASM, а его сниженной секрецией. Наши исследования позволили изучить репаративные свойства hASM и определить эффективную внеклеточную дозу hASM, способную восстановить способность к восстановлению мембран в мышечных клетках с дефицитом дисферлина (рис. 1). Мы обнаружили, что эта доза ниже, чем доза, которая использовалась для улучшения восстановления ASM-дефицитных клеток, поврежденных поры образующими токсинами (25). Эта доза hASM, которая эффективно улучшает восстановление плазматической мембраны, обнадеживает в плане ее клинического применения при LGMD2B, поскольку она значительно ниже установленной безопасной максимальной дозы hASM для использования у людей и в 100 раз ниже дозы, вызывающей гибель клеток (Дополнительный рисунок 5 и ссылка 56). Однако, учитывая короткий период полураспада введенного белка hASM (21-24 часа), терапия, основанная на прямой доставке hASM, потребует частого введения и повышения дозы препарата для поддержания эффективности, что снижает ее полезность для лечения такого хронического заболевания, как LGMD2B. Чтобы преодолеть это ограничение, мы протестировали более клинически осуществимый подход генетической доставки hASM через печеночную экспрессию этого белка с помощью AAV-опосредованной доставки. Благодаря превосходному профилю безопасности и высокой эффективности трансдукции AAVs в широкий спектр тканей, на сегодняшний день существует более 2 000 клинических испытаний, в которых используются эти векторы переноса генов (57). Из них терапевтические препараты на основе AAV, нацеленные на печень, обладают набольшей эффективностью при внутривенном введении, обеспечивают многолетнюю экспрессию трансгенов после однократного введения и эффективны при лечении дефицита белков плазмы (58-61). Несмотря на безопасность этого подхода, недавнее клиническое исследование I/II фазы (NCT03199469) для лечения Х-сцепленной миотубулярной миопатии (МТМ) с использованием эскалации дозы AAV8 белка МТМ1 (AT132) показало пагубные печеночные последствия у людей при использовании высокой вирусной нагрузки (1 х 10¹⁴ vg/кг до 3 х 10¹⁴ vg/кг). Наше исследование показывает терапевтическую эффективность hASM-AAV у мышей в дозе 1 х 10¹³ vg/кг (1 [ 10¹² vg/кг эквивалентная доза для человека). Эта значительно меньшая доза может обеспечить безопасное использование изложенного нами подхода к генотерапии. В поддержку безопасности мы не наблюдали признаков повреждения печени (повышение уровня ALT в сыворотке крови и гистопатологии печени) в течение 12 недель лечения hASM-AAV.

Использование hASM-AAV in vitro показало, что он позволяет производить секретируемый hASM клетками печени человека (клетки HepG2) на уровнях, достигающих терапевтически эффективных концентраций, и восстанавливает восстановление в мышечных клетках пациентов с дефицитом дисферлина (Рисунок 4). Эта эффективность также отражена при использовании этого вектора in vivo в доклинической мышиной модели дефицита дисферлина. Использование этого вектора в мышиной модели NPDA ранее продемонстрировало повышенную и стабильную продукцию hASM в 12-недельном исследовании (45). В нашем исследовании мы подтвердили этот потенциал hASM-AAV in vivo на мышиной модели LGMD2B, где были обнаружены высокие уровни печеночного и сывороточного hASM, которые эффективно восстанавливали способность миофибрилл к восстановлению через 12 недель после однократного введения вектора (рис. 5). Эти результаты, представляющие интерес для LGMD2B, также представляют интерес для пациентов с NPDA, поскольку мышиные модели NPDA также демонстрируют плохое восстановление сарколеммы (26).

Усиление дегенерации мышц требует большей регенерации мышц, и мы обнаружили, что улучшение восстановления дисферлин-дефицитных миофибрилл с помощью hASM-AAV снижает потребность в регенерации, вызывая 2-кратное снижение количества регенерированных миофибрилл. Также уменьшилась доля маленьких (недавно регенерированных) миофибрилл у мышей, обработанных hASM-AAV (рис. 6). Эти улучшения in vivo, достигнутые с помощью hASM-AAV, сравнимы с теми, которые были получены с помощью AAV-опосредованной генотерапии дисферлина (32), и демонстрируют, что секретируемая генотерапия на основе hASM так же эффективна в устранении дефицита восстановления миофибрилл LGMD2B, как и генотерапия, восстанавливающая экспрессию дисферлина в миофибриллах. Дополнительные последствия постоянного повреждения миофибрилл включают хроническое воспаление мышц (62). Мы обнаружили, что лечение hASM-AAV дисферлин-дефицитных мышей также ослабило это явление, возможно, благодаря улучшению способности к восстановлению in vivo дисферлин-дефицитных миофибрилл (рис. 6).

Постоянные травмы и плохое восстановление мембран также способствуют fibroadipogenic замещению мышц. Мы обнаружили, что hASM-AAV вызвал снижение фиброадипогенного замещения дисферлинопатической мышцы до степени, сравнимой со снижением, достигнутым при использовании генотерапии AAV-дисферлином (см. 32 и рис. 6). Эти результаты показали, что лечение hASM-AAV улучшает восстановление мышц и общее качество и здоровье мышц, а также должно сопутствовать сохранению функции мышц. В соответствии с этими улучшениями, мы наблюдали увеличение силы захвата задней конечности после лечения hASM-AAV. Сила сокращения передней конечности, которая, как известно, не подвержена влиянию в мышиной модели LGMD2B (63), не изменилась в результате лечения hASM-AAV. Кроме того, наблюдаемое улучшение силы сокращения задней конечности соответствует другим доклиническим подходам, которые предлагают терапевтические преимущества при дисферлинопатии (64-66).

В целом, представленные здесь результаты показывают, что белок hASM улучшает восстановление сарколеммы мышечных клеток LGMD2B зависимым от дозы образом. Они утверждают, что как очищенный белок hASM, так и AAV-опосредованный печеночный перенос генов hASM являются жизнеспособными стратегиями для улучшения способности к восстановлению дисферлинопатических миофибрилл. Использование метода переноса генов подтверждает его полезность в долгосрочной перспективе in vivo для снижения гибели миофибрилл и гистопатологии, а также для улучшения функции мышц. Необходимы клинические испытания для изучения терапевтической полезности этого подхода для лечения мышечной патологии у пациентов с LGMD2B и NPDA.