Техника послойного нанесения (Layer-by-Layer, LbL) как метод инженерии свойств коллоидных частиц была представлена почти два десятилетия назад [1]. Перспективы этих методов виделись в основном в элегантных и простых подходах к приданию различных функций коллоидным частицам разных видов. Широкий спектр коллоидных частиц различной природы и даже поверхности может быть покрыт многослойной пленкой полимеров, что придает полученной структуре определенную функцию [2]. Действительно, от попеременной перекомпенсации заряда на каждой стадии адсорбции полимерного слоя, техника перешла к другим движущим силам для обеспечения многослойной сборки, например, к водородной связи и комплиментарному взаимодействию. Главное преимущество подхода LbL основано на широкой функциональности, которую в настоящее время предлагает полимерная химия и макромолекулы, несущие достаточное количество зарядов или других групп связи, которые могут придать дополнительную чувствительность к pH, оптическим или температурным реакциям [3]. Все это совпадает с возможностью встраивания различных функциональных неорганических наночастиц (НЧ) между полимерными слоями, поскольку они также имеют заряды и в основном заряжают поверхность при адсорбции. Примерами НЧ, которые могут быть использованы для функционализации коллоидных частиц с покрытием, являются флуоресцентные нано-кристаллы для кодирования частиц и магнитные НЧ для придания магнитных свойств всему коллоидному транспорту [4].

Поскольку коллоидные частицы с LbL-инжинирингом в основном рассматривались для использования в качестве систем доставки, возник вопрос: как инкапсулировать биологически активные соединения внутри частиц до покрытия коллоидных частиц многослойными пленками. Было изучено несколько различных стратегий, в основном сосредоточенных на инкапсуляции активных веществ на ранней стадии в коллоидном ядре, перед созданием функционального многослойного покрытия. Этот подход может хорошо работать в случае изготовления частиц из активных соединений путем их осаждения в аморфных или полиморфных кристаллических структурах, или для сложных частиц с полимерами, такими как полимолочно-гликолевая кислота (PLGA) [5]. На практике каждый из этих методов очень специфичен для конкретных веществ, которые должны быть заключены в ядро, в зависимости от их молекулярного веса, растворимости и других физико-химических параметров. Очевидно, что идет постоянный поиск уникального и технологически подходящего подхода для удержания в капсулах широкого спектра биоактивных молекул. В настоящее время пористые микрочастицы карбоната кальция представляются подходящими для размещения ряда различных видов внутри пор перед нанесением многослойного покрытия. Основными преимуществами частиц карбоната кальция являются их биоразлагаемость и возможность приготовления частиц различных размеров, от 100 нм до 5 микрон и выше. Инкапсуляция веществ может осуществляться либо путем совместного осаждения во время формирования частиц карбоната кальция и захвата активных молекул в поры формирующихся карбонатных частиц, либо путем вливания раствора с биоактивными молекулами в поры предварительно сформированных высушенных частиц. Последний процесс недавно был усилен замораживанием, так как образование льда в растворе проталкивает молекулы в поры, увеличивая полезную нагрузку в частицах [6].

Одним из основных преимуществ частиц LbL является их способность поглощаться различными типами клеток. На сегодняшний день существует более 20 различных клеточных линий, для которых было продемонстрировано поглощение многослойных капсул. Физиологический процесс интернализации капсул напрямую зависит от их физико-химических свойств, таких как размер, форма и заряд [7]. Для клеточной интернализации нано- и микрокапсул существуют различные механизмы поглощения, включая фагоцитоз, микропиноцитоз, клатрин- и кавеола-зависимый и клатрин- и кавеола-независимый эндоцитоз [8]. Нано-размерные носители преимущественно интернализуются через клатрин-опосредованный путь [9], тогда как частицы размером более 1 µм в основном эндоцитируются через макропиноцитоз и фагоцитоз [10]. Это делает подход инкапсуляции LbL весьма перспективным для внутриклеточной доставки.

Доставка генетического материала в клетки является одной из актуальных тем биомедицинских исследований на протяжении десятилетий. Безусловно, метод LbL привлек значительное внимание с точки зрения того, как и может ли он помочь улучшить доставку ДНК или РНК. Очевидно, что легкое поглощение капсул LbL клетками является одним из преимуществ этого метода. Другой перспективный аспект связан с разнообразием методов, которые могут быть использованы для включения нуклеиновой кислоты в капсулы. Они могут быть включены в ядро, в том числе в пористый карбонат кальция; функциональная многослойная оболочка может быть сформирована на уплотненной форме ДНК, созданной с помощью уплотняющего агента, такого как протамин; и, наконец, нуклеиновая кислота, будучи отрицательно заряженным полимером, может быть использована в качестве компонента оболочки сама по себе, альтернативно собранная с поликатионами. В последнем случае возникает вопрос о пригодности поликатиона. Figure 1. Schematic illustration showing the different types of localization of nucleic acids (NA) incorporated in LbL delivery systems: hollow polyelectrolyte capsules, films and core-shell particles. Different macromolecular interactions that can be used for LbL assembly, clockwise from top left: electrostatic bonding, hydrophobic interactions, stereocomplexation, host-guest interactions, covalent bonding and hydrogen bonding

Универсальность систем LbL определяется также широким спектром возможностей их модификации, которые позволяют придать им дополнительные функциональные свойства, такие как чувствительность к свету или магнитному полю, способность к нацеливанию, каталитические или биоимиджинговые (bioimaging) свойства и другие [26,27]. Как и генетический материал, органические или неорганические нано-материалы могут быть либо включены между слоями полимеров во время процедуры LbL [28], либо прикреплены к поверхности частиц LbL [29], либо загружены в полость систем LbL [30-32] (рис. 2(a)). Figure 2. (a) Various physical triggering mechanisms that have influenced the permeability of capsules/core-shell particle walls to release the genetic cargo. Nanoparticles can be loaded inside the core (1), adsorbed on the surface (2) or incorporated in layers of LbL carriers (3). (b) The mechanism of LbL carriers pathway after their internalization by the cells via endocytosis. Endosomal escape occurs under the condition of influx and accumulation of Cl- ions inside the endosomal vesicle. (c) The mechanism of nucleic acid release and cell transfection via electroporation from LbL-assembled film modified with nucleic acid

Запущенное не-инвазивное высвобождение генных последовательностей обычно достигается путем включения неорганических наноагентов в структуру LbL-систем, таких как плазмонные, диэлектрические или магнитные NPs (рис. 2(a)). Для того чтобы максимизировать не-инвазивное высвобождение лекарств, эти агенты должны быть включены между полимерными слоями системы LbL. Встраивание плазмонных или диэлектрических NPs между полимерными слоями обеспечивает светочувствительность платформ доставки LbL. В частности, плазмонные NPs преобразуют часть световой энергии в тепловую за счет резонансного взаимодействия электромагнитного поля определенных частот с плазмонами (колебаниями электронов), это усиливает оптическое поглощение на резонансной частоте [33,34]. Диэлектрические NPs с высоким коэффициентом преломления (Si, Ge) также могут быть использованы в качестве эффективных нагревательных агентов при облучении светом благодаря квадруполюсному (quadrupole) резонансу [35]. Известно, что после эндоцитоза нано- и микрочастицы обычно собираются в эндо-/лизосомных компартментах клетки. Таким образом, тепло, исходящее от наночастиц, способно вызывать не только деформацию полимеров, но и разрыв эндо/лизосомального компартмента, и, следовательно, запускать цитозольное высвобождение лекарственного вещества [36].

Для того чтобы добиться триггерного высвобождения молекул груза в ближней инфракрасной области (NIR), что благоприятно для биомедицинских применений, необходимо изменить форму плазмонных NPs [31]. В этой новаторской работе по светоиндуцированному высвобождению генов из LbL-микросистем агрегаты сферических Au NPs были встроены между полимерными слоями и использованы в качестве нагревательных агентов, поскольку длина волны поглощения света такими нано-структурами смещена в NIR-область спектра. Эти агрегаты были встроены между полиэлектролитными слоями микрокапсул LbL, которые широко применяются в качестве везикул для доставки лекарств/генов. Действительно, Ott и др. доставили молекулы мРНК, кодирующие зеленый флуоресцентный белок, в клетки HeLa с помощью светочувствительных микрокапсул LbL. Не-инвазивное высвобождение мРНК было достигнуто с помощью NIR-облучения [37]. Володькин и др. сообщили о светоиндуцированном высвобождении ДНК из LbL-модифицированных поверхностей [38]. В более поздних работах сферические агрегаты Au были заменены на стержневые или звездообразные Au NPs, которые имеют плазмонный пик в NIR-области. Это улучшило как контроль над всей системой во время синтеза, так и эффективность высвобождения [31,33,39]. Отметим, что нано-стержни и нано-звезды Au использовались в качестве нано-нагревателей в исследованиях, посвященных доставке макромолекул (кроме нуклеиновых кислот). Однако мы считаем, что этот подход может быть успешно реализован для доставки генов в LbL. Системы LbL также могут быть модифицированы двумя различными типами неорганических NPs. Это придает LbL-системам многофункциональные свойства. Например, Ochs и др. модифицировали капсулы LbL, несущие мРНК, плазмонными NPs для обеспечения светового триггерного высвобождения и магнитными NPs для направления доставки капсул в клетки. Градиенты магнитного поля, созданные магнитом, смогли захватить капсулы, функционализированные магнитными NPs, и улучшить их интернализацию [40].

Как уже упоминалось, неорганические NPs могут применяться в качестве стержней для сборки самих LbL [41]. В таких структурах нуклеиновые кислоты могут быть включены между слоями во время сборки. Goyal и др. сообщили о нано-оболочках LbL, собранных из Au NPs, в качестве транспортных средств для внутриклеточной доставки микроРНК (миРНК). Доставка миРНК была исследована на трижды негативных клетках рака молочной железы, чтобы вызвать подавление опухоли [42]. Недавно было показано, что Au NPs могут нести более одного типа генетического материала. Bishop и др. продемонстрировали, что подход LbL позволяет загружать два типа нуклеиновых кислот в один носитель. Так, ДНК и siRNA поочередно наносились на поверхность Au NPs и доставлялись в первичные клетки рака мозга человека in vitro [43]. Свойства поглощения света Au NPs также могут быть успешно использованы для не-инвазивного запуска высвобождения при использовании Au NPs в качестве носителей генов. Так, Wang и др. прикрепили системы CRISPR-Cas9 к поверхности Au NPs с помощью электростатических взаимодействий и далее инкапсулировали Au NPs в липиды. Лазерное облучение (514 нм) всей системы обеспечило эффективный нокаут целевого гена как in vitro, так и in vivo [44]. Светочувствительность систем доставки генов может быть обеспечена не только плазмонными или диэлектрическими NPs, но и фотосенсибилизаторами, чтобы придать дополнительные функциональные возможности системам LbL. Wang и др. разработали инженерную многослойную платформу-носитель на основе так называемых upconversion NPs (UCNPs), которые способны поглощать фотоны низкой энергии и излучать фотоны с более высокой энергией [45,46]. Эти UCNP были загружены Chlorin e6 и siRNA, что позволило проводить фотодинамическую терапию при облучении NIR-светом и одновременно глушить polo-like kinase 1 (Plk1), вызывающую значительный апоптоз раковых клеток [47].

Интересно, что сама ДНК может быть использована в качестве строительного блока для стимул-реактивных носителей. Liao et al. описали синтез микрокапсул, сшитых аптамер-ДНК, которые реагируют на молекулы аденозинтрифосфата (АТФ). В присутствии АТФ микрокапсулы диссоциируют благодаря образованию комплексов аптамер-АТФ с последующим высвобождением загруженных молекул груза [48]. Такая система на основе ДНК может быть усовершенствована путем дополнительной функционализации плазмонными NPs для обеспечения опосредованного светом высвобождения [49].

Системы LbL также могут быть разработаны таким образом, чтобы быть чувствительными к изменениям pH. С этой целью для создания носителей генов LbL обычно используются рН-чувствительные (в основном органические) молекулы. Общий механизм, на котором основана чувствительность к рН используемых органических соединений, заключается в их протонировании/депротонировании, что приводит к конформационным изменениям и, следовательно, к разборке носителя LbL. Chen и др. разработали pH-чувствительную систему доставки LbL из амфифильного CS и гиалуроновой кислоты (HA), нанесенных на липосомы, с целью доставки ингибитора апоптоза (IAP) survivin-shRNA гена [50]. В другом исследовании металлоорганические каркасы, покрытые PEI, использовались для доставки плазмидной ДНК. Внутриклеточное высвобождение генов запускалось кислыми значениями pH, что приводило к успешной экспрессии генов с высокой эффективностью трансфекции по сравнению с коммерческими трансфекционными реагентами [51]. Jin и др. сообщили об умных pH-чувствительных полимерных NPs, которые использовались для переноса двух типов siRNA в клетки. Высвобождение генетического материала достигалось при внутриклеточных значениях pH. Исследования in vivo продемонстрировали ингибирование роста опухоли и увеличение выживаемости лабораторных животных после доставки siRNA, которая эффективно снижала экспрессию мРНК и белка survivin [52].

Эффективность трансфекции генных векторов зависит от различных параметров, таких как тип клеток, тип носителя, генетический материал и условия инкубации [53]. Однако существуют попытки повысить эффективность трансфекции путем использования добавок, которые вызывают изменения внутри клеток (в основном повышение эндосомного/лизосомного значения pH, чтобы избежать разрушения нуклеиновых кислот кислой микросредой), провоцируя усиление трансфекции. Вышеупомянутые катионные соединения являются агентами, которые часто используются для повышения эффективности трансфекции. Как только эти соединения попадают в эндосомы/лизосомы, они стимулируют эндосомальный/лизосомальный выход груза в цитозоль через так называемый эффект протонной губки, точный механизм которого все еще обсуждается. В конечном итоге, эффект протонной губки буферизирует эндосомальные/лизосомальные значения рН за счет притока и накопления ионов Cl- и, таким образом, набухания и разрыва эндосом/лизосом [54,55] (Рисунок 2(b)). Li и др. сообщили о повышении эффективности трансфекции с помощью катионных липидов (дидодецилдиметиламмоний бромид), которые использовались для покрытия Au NPs [56]. Wang и др. разработали многослойную систему с инкапсулированным PEI для усиления трансфекции клеток ДНК in vitro и in vivo [57]. Поликатионный полимер (полиамидоаминовый дендример, поли(амидоамин)), обогащенный либо аргинином, либо лизином, использовался в качестве эффективного невирусного трансфекционного агента и сравнивался с коммерчески доступным Lipofectamine [58]. Ганас и др. модифицировали микрокапсулы LbL с PEI для повышения эффективности трансфекции в клетках HeLa с использованием siRNA, что привело к снижению токсичности PEI, которая обычно ассоциируется со значительным уровнем гибели клеток, а также к облегчению цитозольного высвобождения siRNA [12]. В другом исследовании многослойные upconversion NPs, покрытые PEI (либо с одним, либо с двумя слоями), использовались для трансфекции клеток с плазмидной ДНК, прикрепленной к поверхности NPs. Авторы показали, что системы LbL с двумя слоями PEI демонстрируют повышенную эффективность трансфекции. Однако эта повышенная эффективность трансфекции наблюдалась только в бессывороточной среде [59]. Влияние присутствия сыворотки в среде клеточных культур также изучалось в недавней работе [60]. Было показано, что инкубация клеток HeLa сначала 4 ч в бессывороточной среде, а затем 20 ч в полной среде привела к повышению эффективности трансфекции по сравнению с прямой инкубацией (24 ч) в культуральной среде, дополненной сывороткой. Авторы предположили, что повышение эффективности трансфекции в бессывороточной среде может быть связано с повышенным поглощением носителей LbL вследствие голодания клеток. В той же работе авторы попытались повысить эффективность трансфекции, добавив в культуральную среду хлорохин, который, как известно, повышает лизосомальный рН за счет протонирования в кислой среде лизосом. Было продемонстрировано, что добавление хлорохина привело к увеличению уровня трансфекции на 2-5% [60]. В другой работе хлорохин рассматривался в качестве слоя при сборке LbL на микроносителях. Авторы показали увеличение эффективности трансфекции до 20% при использовании носителей, инкорпорированных хлорохином [61]. Помимо хлорохина, другие лизосомотропные агенты, например, PVP и сахароза, могут быть использованы для того, чтобы вызвать повышение лизосомного pH и таким образом повысить эффективность трансфекции [62].

Усиление трансфекции может быть достигнуто не только при применении систем LbL с частицами, но и при использовании поверхностей. Yamauchi и др. продемонстрировали LbL-сборку катионных липидов и ДНК на подложке. Выращивание клеток непосредственно на слое, нагруженном ДНК, привело к переносу ДНК в прилипшие клетки [63]. Fujimoto и др. показали, что трансфекция генов методом электропорации может быть улучшена путем создания поликатионных слоев (PEI) на подложке. В результате было достигнуто увеличение поверхностной плотности загруженной siRNA и подавление/усиление соответствующих белков [64] (Рисунок 2(c)). В рассмотренных работах эффективность трансфекции многих систем на основе полимеров не превышала 30-60%, варьируя в зависимости от различных полимеров и LbL-структур [60,61]. Это ниже по сравнению с вирусными системами доставки (например, AVV, LVV и др.), где известная эффективность трансфекции клеток очень высока, вплоть до 100%, для многих типов клеток. Однако существует множество негативных побочных эффектов или доставка генов с помощью вирусных систем. Вирусные векторы могут вызывать как системные, так и местные негативные эффекты из-за интеграции генома хозяина и иммуногенности, чего можно избежать при использовании биодеградируемых невирусных носителей.

Как было описано выше, применение систем LbL в области доставки генов приобретает все больший интерес благодаря их способности безопасно загружать генетический материал и, кроме того, возможности загрузки нескольких молекул в один носитель, что повышает эффективность трансфекции. Загрузка генов с помощью LbL может осуществляться различными способами, в зависимости от типа генетического материала, области воздействия и цели доставки генов [65]. Если рассматривать системы, собранные из LbL, то проницаемость стенки капсулы можно контролировать для генетического материала с разным молекулярным весом. По сравнению с вирусными системами доставки, невирусные носители, изготовленные по технологии LbL, более эффективны и безопасны [66]. LbL-сборка носителей может использоваться для доставки различных нуклеиновых кислот (NA): плазмидной ДНК, малой интерферирующей РНК, мРНК и инструментов редактирования генома. Для целей доставки генов могут быть использованы все перечисленные системы LbL - частицы с оболочкой ядра, полые капсулы, плоские поверхности, но на практике используются в основном частицы.

Плазмидная ДНК (pDNA) является одной из наиболее часто используемых форм нуклеиновой кислоты для генотерапии. Эта круглая двухцепочечная молекула является предпочтительным выбором генных векторов, поскольку она менее восприимчива к нуклеазам и испытывает меньшее физическое воздействие при доставке по сравнению с линейными молекулами ДНК и РНК, что в целом исключает необходимость добавления ингибиторов нуклеаз в систему LbL. Плазмиды способны нести множество генов, которые могут экспрессироваться одновременно или в различных условиях, если используются различные промоторы и другие регуляторные элементы. Способность плазмид к клонированию, простота манипуляций с помощью различных подходов клонирования и легкость производства в больших масштабах также делают их генетическим носителем выбора для доставки. Однако использование плазмид в качестве генетического материала для доставки имеет и ряд недостатков. Экспрессия генов, закодированных на плазмидах, требует ядерной локализации доставляемой нуклеиновой кислоты. Более того, не-метилированная двухцепочечная ДНК (dsDNA) может быть распознана как потенциально опасный агент рецепторами врожденной иммунной системы, включая Toll-подобный рецептор (TLR) 9, стимулятор генов интерферона (STING) и инфламмасомы, содержащую пириновый домен семейства NLR 3 (NLRP3). Таким образом, предварительная обработка клеток специфическими ингибиторами этих путей или совместная доставка этих ингибиторов вместе с плазмидной ДНК может привести к повышению эффективности трансфекции и более высоким уровням экспрессии [67].

Капсулы и частицы с оболочкой ядра, полученные методом LbL, обеспечивают защитный барьер от нуклеаз и агрессивных факторов внеклеточной жидкой среды. Несмотря на то, что плазмиды являются стабильными молекулами, помещение их в такую систему доставки может защитить pDNA от любой деградации при перемещении в ядро клетки. Поскольку ДНК является полиэлектролитом, она может быть электростатически включена в систему в виде слоя путем чередования с поликатионами (PLA [68], PLL [69], PEI [70], PAAm [71] или PLGA [72]). Например, было показано, что частицы ядро-оболочка из poly( β-amino ester)/pDNA способны трансфицировать клетки. pDNA, использованная в сборке LbL, была признана функциональной после трансфекции клеток [24]. Kakade и др. использовали плазмиду, кодирующую секретируемую щелочную фосфатазу (SEAP) и PEI для создания LbL-сборки на поверхности микрочастиц из полистирола и PLGA. При трансфекции макрофагов J774.1 полученными частицами с оболочкой ядра наблюдалась дозозависимая экспрессия SEAP [73]. ДНК также может быть инкапсулирована во внутреннее пространство полых капсул, используя технику предварительной загрузки шаблона. Комплекс ДНК/спермидин (Sp) может быть абсорбирован на поверхности микрочастиц карбоната марганца с последующим формированием слоя из PLA и поли[β-глюкуроновой кислоты-(1->3)-N-ацетил- β-галактозамин-6-сульфата-(1?4)]. Ядро MnCO₃ было растворено 0,01 М HCl. Поэтому pDNA, инкапсулированная таким образом, сохранила свою естественную двухспиральную структуру, демонстрируя, что метод упаковки не приводит к конформационным изменениям ДНК [74]. pDNA, несущая ген Cas9 и последовательность, кодирующую gRNA, была соосаждена в частицы шаблона CaCO₃, которые затем были покрыты PLA/DS. Растворение ядра CaCO₃ осуществлялось 0,1 М этилендиаминтетрауксусной кислотой (EDTA) [75] (рис. 3(a), слева внизу). Также было показано, что модифицированные амином мезопористые микросферы кремнезема могут накапливать олигонуклеотиды за счет электростатических взаимодействий в их порах, многослойного наращивания водородных связей PMA и PVP с последующим травлением шаблонов кремнеземного ядра, что приводит к образованию полых капсул с олигонуклеотидами, инкапсулированными в их внутреннем пространстве [76].

Figure 3. The LbL fabricated systems used for gene transfer: (a) SEM/TEM images of hollow polymeric capsules (top left, bottom left), polymer scaffolds (top middle, bottom middle), core-shell CaCO3 (top right) and gold (bottom right). particles SEM or TEM images of capsules, scaffolds and particles obtained via layer-by-layer technique. (b) Microscope images of cells, transfected with different genetic material: plasmid DNA (pDNA), small interfering RNA (siRNA), messenger RNA (mRNA) and genome editing (GE) tools. pDNA - MDA-MB-231 cells incubated with capsules containing the PEI/DNA complex. siRNA - Capsule internalization in A549 cells and intracellular distribution of fluorescently labeled siRNA. mRNA - Fluorescence of MDA-MB-231 cell incubated with degradable SiO2 capsules loaded with mRNA encoding GFP. GE - Transfection of HEK293T with capsules containing the CRISPR-Cas9 system resulting in efficient editing of the dTomato gene. Figure 3 (top left) reproduced from [77] with permission of Wiley publishing group. Figure 3 (bottom left) reproduced from [75] with permission of the Elsevier publishing group. Figure 3 (top middle) reproduced from [120] with permission of Elsevier publisher. Figure 3(a) (bottom middle) reproduced form [78] with permission of Royal Society of Chemistry. Figure 3(a) (top right) reproduced form [79] with permission of Wiley publishing group. Figure 3(a) (bottom right) reproduced form [80] with permission of American Chemistry Society Publications. Figure 3(b) (pDNA) reproduced from [12] with permission of Elsevier publisher. Figure 3(b) (siRNA) reproduced from [92] with permission of authors. Figure 3(b) (mRNA) reproduced from [37] with permission of American Chemistry Society Publications. Figure 3(b) (GE tools) reproduced from [75] with permission of Wiley publishing group and American Chemical Society

РНК-интерференция находит широкое применение в качестве стратегии подавления генов для лечения генетических и приобретенных заболеваний. Малая интерферирующая РНК (siRNA) гомологичная определенной целевой мРНК и способна устранять ее экспрессию с помощью внутриклеточных механизмов, таких как Dicer и RISC, вызывая тем самым биологический эффект [81]. siRNA имеет важные ограничения в биомедицинском применении, которые могут быть связаны с ее гидрофильной природой, низкой стабильностью и деградацией в кровотоке в присутствии нуклеаз: неэффективное поглощение клетками, цитотоксичность и стимуляция иммунных реакций. Вирусные векторы широко используются для доставки siRNA, что позволяет преодолеть проблему низкой трансфекции. Однако вирусные векторы имеют ряд ограничений, таких как необходимость активного деления клеток для трансдукции генов, онкогенный потенциал, низкие титры и глушение генов [82]. Поэтому наиболее важной задачей для siRNA-опосредованного in vivo сайленсинга является разработка безопасных (невирусных) систем доставки для доставки siRNA в конкретные ткани и органы.

Многослойные полиэлектролитные носители, полученные путем само-сборки LbL, могут быть перспективными инструментами для доставки siRNA [83,84]. Поликатионные полимеры, такие как PLA [85], PLL [86], PEI [87], PAH [88], хитозан [89] и PLGA [90], были успешно применены для приготовления невирусных систем доставки молекул siRNA. Было проведено несколько исследований по нокауту зеленого флуоресцентного белка в раковых клетках с помощью системы LbL [12] (рис. 3(b) pDNA). Наша группа также показала, что сборка LbL дает возможность доставки клинически значимых siRNA, например, siRNA гриппа, что может стать перспективным подходом в противогриппозной терапии [91]. Бродская и др. разработали метод доставки терапевтического коктейля siRNA (нацеленного на наиболее консервативные области трех генов вируса гриппа А (IAV): нуклеопротеина (NP), неструктурного белка (NS) и субъединицы РНК-полимеразы (PA)) и предложили, что предварительная обработка клеток смесью siRNA PA-1630, NP-717 и NS-777, доставленных гибридными микроносителями, обеспечивает более сильное ингибирование экспрессии вирусной мРНК M1 и контроль уровня белка NP после вирусной инфекции, чем одиночная предварительная обработка любой из трех инкапсулированных siRNA [92] (Рисунок 3(b) siRNA). NPs LbL могут быть успешно поглощены фибробластами и доставлять специфическую siRNA SPARC (секретируемый белок, кислый и богатый цистеином), белок, участвующий в развитии рака простаты [93]. Системы LbL были протестированы для доставки специфических siRNA для нокаута экспрессии генов Tspan8 и E-Cadherin в клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-361 и первичных стволовых раковых клетках (BCSC) с высокой эффективностью сайленсинга генов (около 80%) [84]. Перспективная стратегия системы LbL позволяет модифицировать широкий спектр частиц, таких как золотые NPs, которые подходят для применения в качестве шаблона для доставки активной siRNA в клетки [94]. Потенциально NPs LbL также могут быть использованы в качестве носителей для терапии глаукомы. Покрытые гиалуронаном NPs с загруженной siRNA могут обеспечить подавление генов в первичных клетках трабекулярной сетки человека, что приводит к значительному снижению экспрессии фактора роста соединительной ткани [95].

Было проведено несколько исследований для оптимизации доставки siRNA в определенные ткани и системы органов in vivo [96,97]. Доставка siRNA in vivo с использованием системы полимеров осуществлялась в саркому Юинга (саркома мягких тканей) [98], мозг [99], меланому (рак кожи) [100] и модификацию макрофагов [101]. LbL-сборка демонстрирует высочайшую эффективность и стабильность для переноса функциональных молекул siRNA, что весьма актуально, учитывая их потенциальное клиническое применение.

мРНК - это биомолекула, опосредующая трансляцию генетической информации от генов, закодированных в ДНК, к белкам, расположенным по всей клетке. Физические и биологические характеристики мРНК позволили использовать ее в качестве безопасного генетического материала для генотерапии, поскольку мРНК, в отличие от ДНК, не требует ядерной локализации для экспрессии генов и обеспечивает быструю экспрессию белков, в том числе в трудно трансформируемых клетках, таких как Т-клетки, дендритные клетки и гемопоэтические стволовые клетки [102]. Поэтому мРНК представляет большой интерес для применения в иммунотерапии. Разработка новых терапевтических методов на основе мРНК была ограничена из-за ее нестабильности в условиях окружающей среды. Так, внутривенное введение не-модифицированной мРНК без материала доставки приводит к быстрой деградации мРНК под действием рибонуклеаз и может активировать иммунную систему. Вирусные векторы широко используются для доставки мРНК, но обладают потенциальными иммунологическими побочными эффектами и токсичностью. Невирусные стратегии, такие как электропортация, генная пушка и сонопортация, предлагают лучшие перспективы для доставки мРНК, однако они также имеют определенные ограничения.

В настоящее время существует множество невирусных систем доставки, используемых для доставки мРНК [103]. Но большинство из этих систем имеют ограничения по трансфекции соответствующих популяций иммунных клеток, что препятствует их медицинскому применению. Некоторые невирусные методы показывают низкую эффективность трансфекции [104]; некоторые имеют более высокую эффективность, но при этом демонстрируют высокую токсичность [105]; некоторые трудно производить [106]. Протамин обладает способностью улучшать трансфекцию мРНК, и несколько комплексов протамин-мРНК в настоящее время оцениваются в клинических испытаниях (NCT02692976) на раковых больных. Комплекс мРНК-протамин, инкапсулированный в поли(ε-капролактон) (PCL) NPs, приводит к внутриклеточной доставке молекул мРНК [107]. Различные полипептиды могут образовывать комплексы с нуклеиновыми кислотами и служить платформой для их доставки, они также демонстрируют высокую эффективность трансфекции [108]. Несколько амфипатических пептидов, таких как RALA [109] и LAH-4 [110], также использовались для доставки мРНК. NPs на основе полисахаридов (на основе хитозана) также эффективно использовались для адресной доставки мРНК вакцины [111]. Однако полипептиды и полисахариды в качестве платформы для доставки мРНК не способны обеспечить длительную защиту переносимого материала. Среди множества невирусных векторов доставки [112], NPs считаются наиболее перспективными. Липосомы, являясь естественной системой клеточных взаимодействий, имеют большой потенциал в качестве системы для доставки РНК [113]. Основными преимуществами липосом по сравнению с другими распространенными носителями, например, NPs на основе липидов, являются их высокая проникающая способность, эффективность доставки и биосовместимость. Однако, поскольку NPs на основе липидов имеют низкую эффективность загрузки, особенно для молекул РНК, для формирования липосом требуются сложные, дорогостоящие и длительные манипуляции; таким образом, система, которая разделяет преимущества, но лишена недостатков липосом, была бы привлекательной альтернативой.

Для клинического применения PEI не является подходящей платформой доставки, поскольку он не биоразлагаем, обладает высокой токсичностью и низкой эффективностью трансфекции [114]. PLL является альтернативным биосовместимым шаблоном для доставки мРНК. Эффективность трансфекции достигает 90% в клетках рака простаты человека [115]. Uzgün и др. изучали, как полиэтиленгликозилирование комплекса поли(N,N-диметиламиноэтилметакрилат)-мРНК влияет на эффективность трансфекции [116]. В настоящее время также активно набирает популярность разработка системы мРНК-вакцин, доставляемых методом LbL [117]. Полимерные и гибридные микро- и нано-капсулы более подходят в качестве платформы для безопасной и эффективной доставки мРНК в раковые клетки [37] (Рисунок 3(b) мРНК), мезенхимные стволовые клетки [118] и другие клинически значимые типы клеток, такие как Т-клетки, дендритные клетки и гемопоэтические стволовые клетки [84]. Модификация полимерных носителей ингибиторами РНКаз позволяет повысить эффективность трансфекции за счет защиты мРНК от внешних воздействий [25].

Доставка инструментов редактирования генома (GE) с помощью невирусных носителей стала широко изучаемой темой исследований. Технология LbL может способствовать развитию методов доставки нуклеиновых кислот, которые могут быть использованы для невирусной доставки инструментов редактирования генома. Одним из наиболее перспективных методов GE является CRISPR/Cas9, за который Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпантье недавно получили Нобелевскую премию. Нуклеаза Cas9 нацеливается на определенный участок ДНК с помощью последовательности направляющей РНК (gRNA). Затем Cas9 производит двухцепочечный разрыв (DSB) в намеченном месте, после чего происходит активация систем репарации DSB. Индуцированный разрыв может быть восстановлен путем негомологичного концевого соединения (NHEJ), микрогомологичного концевого соединения (MMEJ), гомологичного концевого соединения (HMEJ) или гомологичной рекомбинации (HR). Репарация двунитевого разрыва в генах-мишенях может привести к делециям, вставкам или точечным мутациям.

Как ген Cas9, так и гРНК могут кодироваться плазмидной ДНК, которая транскрибируется в цитозоле клеток-мишеней. Также в качестве кодирующей нуклеиновой кислоты для инструментов GE может использоваться мРНК. Более того, носители LbL могут доставлять не только нуклеиновую кислоту, но и белки, таким образом, Cas9/gRNA может быть доставлена уже в виде функционального рибонуклеопротеина (RNP) [119]. Различные варианты технологии LbL используются для изготовления носителей для доставки инструментов GE или генов, кодирующих эти инструменты.

Было показано, что система CRISPR/Cas9 может быть доставлена с помощью полимерных нано-носителей, изготовленных из PLA и DS [75]. (Рисунок 3(b) Инструменты GE). Таким образом, капсулы из PLA/DS были загружены pDNA, кодирующей Cas9 и gRNA. Упакованная pDNA затем высвобождается внутри клетки, транскрибируются мРНК Cas9 и gRNA, после чего транслируются белки Cas9, они образуют РNPs с gRNA и переносятся в ядро. Эти капсулы показали более эффективную трансфекцию по сравнению с трансфекцией на основе липосом (более 70% против более чем 50% для мРНК, более 40% против 20% для плазмидной ДНК) и высокий процент клеток, отредактированных генами. Дополнительным преимуществом является то, что поверхность таких капсул может быть модифицирована лигандами, способными нацеливать, например, антитела или фрагменты антител (например, scFvs и однодоменные антитела) или не из антител каркасы (например, альфатела, аффибодии или дарпины) против различных мембранных белков клеток. Поскольку нуклеиновые кислоты находятся внутри капсулы, они защищены от деградации.

Другие типы носителей LbL также могут быть загружены функциональными комплексами RNP с Cas9 и gRNA. RNP могут находиться внутри слоистого носителя или могут быть ковалентно связаны с поверхностью частицы [66]. Однако наиболее популярным методом является размещение рДНК, кодирующей механизм CRISPR/Cas9, внутри частицы, которая высвобождается из эндосом и деградирует в цитозоле. Методы инкапсуляции отличаются по молекулам, составляющим различные слои носителя, и зависят от типа внутреннего пространства частицы.

Другой метод LbL, используемый для доставки системы CRISPR/dCas9, - покрытие нано-волоконных каркасов самособирающимся пептидом (SAP) [120] (Рисунок 3(a), вверху посередине). Нано-волокна PCL покрываются первым слоем SAP за счет сильных гидрофобных взаимодействий, а комплексы pDNA и положительно заряженный SAP затем поглощаются за счет электростатических взаимодействий. Такой подход позволяет клеткам, растущим на поверхности каркасов, непосредственно поглощать комплексы, иммобилизованные на этих каркасах. Таким образом, было показано, что покрытые SAP каркасы повышают эффективность трансфекции pDNA в клетках млекопитающих: пролиферация клеток при трансфекции привела к покрытию более 90% площади каркаса в течение 3 дней, что свидетельствует о приемлемой жизнеспособности клеток. В целом, нано-волоконные каркасы с покрытием LbL представляют собой перспективную платформу доставки для редактирования генома.

Существует множество перспективных подходов к использованию техники LbL для доставки инструментов редактирования генов в клетки. Такие методы безопаснее и эффективнее, чем доставка с помощью вирусных векторов. Технология LbL поможет нам расширить применение технологий редактирования генома, особенно для терапевтического применения in vivo.

Протоколы процедур переноса генов ex vivo гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и мезенхимных стволовых клеток (МСК) были успешно внедрены в клиническую практику [121,122]. Так, препарат Стримвелис, основанный на ex vivo ретровирусной трансдукции гемопоэтических стволовых клеток, был одобрен Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA) и Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) для лечения дефицита аденозиндеаминазы - тяжелого комбинированного иммунодефицита (ADA-SCID). Другим примером такого успеха является генная модификация Т-клеток ex vivo, особенно при CAR Т-клеточной терапии, с использованием ретровирусных или лентивирусных векторов. Кроме того, другие типы соматических стволовых клеток могут быть модифицированы с помощью генной инженерии и показали многообещающие результаты для терапевтического применения (рис. 4). Следует отметить, что трансфекция генов клинически значимых типов клеток обычно осуществляется с помощью вирусных векторов или невирусных физических методов, например, электропортации [123]. Клиническая осуществимость и безопасность должны быть выделены как важнейшие аспекты и в то же время как основные проблемы для развития генной модификации клеток ex vivo. Хотя лентивирусные векторы являются одними из самых эффективных вирусных векторов, они могут нести риск реактивации и непрерывной экспрессии вирусных генов. Кроме того, в результате интеграции вирусного вектора в геном хозяина могут возникнуть инсерционные мутации [124]. Физические методы, включая электропортацию, генную пушку и т.д., всегда требуют оптимального протокола для трансфекции и могут привести к серьезной токсичности. Использование невирусных химических методов (например, липосомы, мицеллы, неорганические NPs) можно рассматривать как альтернативный способ безопасной и эффективной генной модификации клеток. В этом отношении капсулы LbL представляют собой перспективные невирусные системы доставки генов для модификации клеток. Использование капсул LbL для модификации мезенхимных стволовых клеток человека (hMSCs) было описано в нескольких публикациях. В частности, наша группа впервые сообщила о намагничивании hMSCs с помощью магнитных многослойных микрокапсул [125]. Модификация hMSCs микрокапсулами была основана на простой совместной инкубации hMSCs с микрокапсулами в течение 24 часов, что привело к высокой эффективности интернализации магнитных капсул hMSCs, что делает их чувствительными к внешним магнитным полям, позволяя проводить магнитную сортировку. Более того, наша группа использовала этот принцип магнитного манипулирования hMSCs с импрегнированными капсулами для получения чистой популяции трансфицированных генами hMSCs с помощью магнитной сортировки [118]. В другом исследовании Reibetanz и др. провели фундаментальное исследование способности индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) взаимодействовать с носителями LbL и продемонстрировали потенциал носителей LbL для манипуляций с iPSCs, включая генную модификацию [124].

Figure 4. Illustration of clinically relevant cell types and their possible application after additional modification via LbL carriers with genetic material. IPSC - Induced pluripotent stem cells, HSC - Hematopoietic stem cells, NK - Natural killer cells, MSC - Mesenchymal stem cells

Помимо капсул LbL, с помощью метода LbL была изготовлена ген-функционализированная титановая пленка для дифференциации МСК in situ [126]. Авторы продемонстрировали, что pDNA, кодирующая усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP) и человеческий костный морфогенетический белок-2 (hBMP-2), может быть трансфецирована в клетки с помощью титановой пленки, изготовленной методом LbL. Свойства поверхностно-опосредованной трансфекции генов открывают широкие возможности для разработки генно-стимулирующих биоматериалов, предназначенных для генной модификации клеток ex vivo. В частности, клеточные культуральные пластины, используемые для адгезии или культивирования клеток, могут быть покрыты ген-трансфецированными полимерами посредством LbL-сборки для проведения генной трансфекции клеток после их адгезии или прикрепления на поверхности клеточных пластин. Более того, благодаря своей исключительной гибкости и мультипотентности, полимерное покрытие поверхности LbL было широко исследовано для создания биомиметических клеточных микросред, наделенных необходимыми физико-химическими характеристиками для модуляции поведения клеток [127], включая адгезию, миграцию и дифференциацию.