Болезнь Альцгеймера (AD) является одной из основных мировых проблем здравоохранения с огромными социальными и экономическими последствиями [1]. Медленное снижение когнитивных функций и необратимая потеря нейронов являются основными этиологическими проявлениями заболевания. AD - это хроническое нейродегенеративное заболевание, при котором когнитивные функции и формирование памяти постепенно ухудшаются из-за необратимой потери нейронов. Оно характеризуется образованием и накоплением амилоида-бета 42 (A β42) и фосфорилированного tau, а также чрезмерной активацией глиальных клеток. Кроме того, важными характеристиками AD являются нарушение синаптической функции и недостаточная передача сигналов нейротрофинов. Основные симптомы включают потерю памяти, апатию, депрессию и раздражительность [2]. Несмотря на значительные исследования, этиология, патофизиология и механизмы когнитивных нарушений и синаптической дисфункции изучены недостаточно хорошо. Кроме того, имеющиеся варианты терапии являются лишь симптоматическими и поддерживающими, с такими побочными эффектами, как спутанность сознания, головокружения, депрессия, запор и диарея [3]. Несмотря на обширные знания о молекулярных основах AD, прогресс в разработке эффективного лечения, модифицирующего болезнь, оказался сложным. Например, в ходе нескольких клинических испытаний не удалось достичь стандартов эффективности в отношении выработки, накопления и токсичности Aβ Это ставит под сомнение гипотезу об амилоидной бета-кислоте и способствует поиску дополнительных стратегий лечения. Одна из очень важных и недавно изобретенных стратегий, стало использование системы кластеризованных регулярно перемежающиеся коротких палиндромных повторов/CRISPR-ассоциированного белка 9 (CRISPR/Cas9) редактирования генов, которая привлекла внимание из-за возможных преимуществ в управлении и лечении AD. Эта новая технология является относительно простой, недорогой и точной, что привело к повышенному интересу к ней для лечения нейродегенеративных заболеваний (NDDs). Это может быть использовано как прямой подход к лечению или может помочь в создании лучших моделей на животных, которые точно воспроизводят NDDs человека. Эта технология уже показала свою перспективность при других NDDs, таких как болезнь Хантингтона (HD) и болезнь Паркинсона (PD). Однако потенциал этой технологии в лечении AD нигде подробно не обсуждался и не документировался. Поэтому целью данного обзора было изучение потенциальной полезности CRISPR/Cas9 в качестве метода лечения AD путем воздействия на определенные гены, включая те, которые вызывают раннее начало AD, а также те, которые являются значительными факторами риска позднего начала AD, например, ген аполипопротеина Е4 (APOE4). В обзоре также обсуждаются различные системы доставки, которые помогают правильно и целенаправленно доставлять груз CRISPR/Cas9 в клетки.

AD - это повсеместная форма деменции, которая влияет на здоровье миллионов людей во всем мире. Несмотря на то, что об этом заболевании известно уже более ста лет, ответы на многочисленные вопросы о его патофизиологии еще не найдены. Стандартные клинические характеристики AD проявляются снижением когнитивных способностей, включая память, распознавание, суждения и решение проблем [4-6]. Исследования мозга при AD выявили нейропатологические изменения, которые представляют собой отличительные признаки заболевания, такие как внутриклеточные нейрофибриллярные клубки (NFTs), включающие гиперфосфорилированный tau и накопление внеклеточных бляшек А β [7-9]. При раннем начале AD симптомы проявляются у лиц в возрасте от 30 до 65 лет и являются преимущественно генетическими, что наблюдается более, чем в 92% случаев [6], в то время как при позднем начале AD симптомы начинаются после 65 лет. По данным отчета за 2019 год, только в Соединенных Штатах (США) диагноз AD был поставлен более 5,8 миллионам человек, из которых 45% пациентов относятся к группе 75-84 лет [10]. Постоянно растущее число больных приводит к прогнозам, что к 2050 году в США будет около 14 миллионов человек c AD [11].

В основном считается, что заболевание обусловлено внешними факторами, а не генетической предрасположенностью. Амилоидная гипотеза объясняет образование и агрегацию A β в мозге. Согласно этой гипотезе, белок-предшественник амилоида бета (APP) подвергается протеолизу в результате согласованной деятельности α-, β- и γ-секретаз. Повышение активности β-секретазы 1 (BACE1) приводит к развитию AD вследствие агрегации мономеров Aβ в олигомеры и, следовательно, к образованию и отложению бляшек Aβ Более того, расщепленный BACE1 APP приводит к образованию фрагмента C99, который далее расщепляется γ-секретазой с образованием мономеров Aβ40 и Aβ42. Интересно, что α-секретаза также может расщеплять APP в различных местах, тем самым сворачивая образование мономеров Aβ (рис. 1A) [12].



Fig. 1. Schematic showing Amyloid beta and Tau hypothesis that have been suggested to give an explanation for the most common characteristic hallmarks of AD. APP, amyloid precursor protein; AICD, APP intracellular domain; NFTs, neurofibrillary tangles; GSK, glycogen synthase kinase; CDK5, cyclin-dependent kinase 5; PP2A, protein phosphatase 2A.

Амилоидная гипотеза объясняет образование Aβ; точно так же образование NFT в мозге при AD объясняется популярной гипотезой tau. Tau, хорошо известный белок, связанный с микротрубочками, играет ключевую роль в формировании и стабилизации цитоскелета bp микротрубочек [13]. Сообщается, что из шести изоформ Tau в аксонах взрослого человека преобладают 3R и 4R. Множество фосфатов и киназ являются мишенью для Tau. В головном мозге при AD изоформы Tau 3R и 4R могут накапливаться в гиперфосфорилированной форме и вызывать образование NFT в нейронных тканях, если они присутствуют в аксонах и телах нейронных клеток, 'то приводит к патологии Tau. Как было недавно предположено, олигомеры tau могут быть микроструктурами, опосредующими нейропатологию, или потенциальными молекулярными инициаторами AD (рис. 1B) [14]. Кроме того, сообщалось о возможной молекулярной связи между отложением Aβ и формированием NFT. Последние, как сообщается, подавляет жизнеспособность нейронов, нейропластичность, изменяет сборку микротрубочек, а также ингибирует транспорт митохондрий по микротрубочкам. Следовательно, нейротоксичность tau может вызывать событие, происходящее ниже по течению после полимеризации Aβ и ответственно за нейротоксичность, вызванную tau [15]. Однако эта гипотеза нуждается в экспериментальном подтверждении.

Выдвижение гипотезы амилоида бета дало направление для разработки и тестирования терапевтических агентов для модификации заболевания, которые взаимно усиливают удаление токсичных пептидов из мозга и предотвращают образование Aβ [16]. К сожалению, более 400 клинических испытаний, проведенных за десятилетие, когда был одобрен последний препарат для лечения AD, потерпели неудачу. Препарат обеспечивал лишь временное лечение симптомов AD. Анализ различных клинических испытаний, проведенных в период с 2002 по 2012 год, показал, что общий процент успешных результатов составил всего 0,4%, а процент неудач - 99,5% [11]. Несмотря на множество вероятных причин неудач этих клинических испытаний, общепризнанным мнением является то, что стадия заболевания была слишком запущена, чтобы какие-либо препараты против АД могли повлиять на познавательный процесс. В связи со значительным провалом современных подходов, направленных на модификацию заболевания, необходимы другие вероятные методики лечения, такие как методы редактирования генома. В настоящее время существует три основных распространенных инструмента редактирования генома, включая CRISPR/Cas9, нуклеазы с эффектором, подобным активатору транскрипции (TALENs), и нуклеазы с цинковыми пальчиками (ZFNs). Каждый из этих инструментов имеет свои достоинства и недостатки [17]. Однако в настоящем обзоре рассматривается, главным образом, возможная роль CRISPR/Cas9 в лечении AD благодаря его низкой стоимости, высокой скорости, эффективности и точности по сравнению с другими инструментами редактирования генома.

CRISPR/Cas9 - недавно открытый и перспективный революционный инструмент для редактирования генома, который позволяет лечить заболевания с ограниченными или скудными возможностями лечения. Этот инструмент был первоначально идентифицирован Ishino в 1987 году [18] (рис. 2). С тех пор в ряде исследований сообщалось, что система CRISPR/Cas9 является неотъемлемой частью иммунной системы бактерий, которая обеспечивает защиту от нежелательной интеграции мобильных генетических элементов, таких как плазмиды и вирусы. Далее, благодаря новаторским усилиям Doudna и Charpentier's, CRISPR/Cas9 была применена в лабораторных условиях для изучения ее потенциала [19]. В последнее время были проведены углубленные исследования CRISPR/Cas9, которые значительно повысили эффективность редактирования и минимизировали нецелевые эффекты, а также широко использовались для фундаментальных и трансляционных исследований [19], [20].



Fig. 2. The CRISPR/Cas9 timeline, crRNA: CRISPR-derived RNA; CRISPR/Cas9, clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins 9 system.

CRISPR/Cas9 состоит из двух основных компонентов: фермента Cas9 и single-guide RNA (sgRNA). Последовательность ДНК-мишени распознается sgRNA, при этом в процессе конструирования учитываются различные параметры для повышения специфичности. Белок Cas9, являясь эндонуклеазой, действует как молекулярные ножницы для разрезания двойных нитей ДНК (рис. 3). Системы CRISPR/Cas делятся на класс 1 (тип I, тип III и тип IV) и класс 2 (тип II, тип V и тип VI). Класс 1 содержит множество белков Cas, которые работают вместе, в то время как Класс 2 использует один белок Cas, что делает его простым и желательным для редактирования генома [21]. Среди класса 2 система CRISPR/Cas9 типа II является одной из наиболее изученных и используемых систем в фармацевтической разработке. Белок Cas9 генерирует двойной стандартный разрыв после распознавания последовательности гена мишени. Впоследствии для восстановления этого разрыва могут быть запущены два различных пути: гомологично направленная репарация (HDR) или негомологичное соединение концов (NHEJ). NHEJ приводит к вставке и делеции, что приводит к возникновению преждевременного стоп-кодона и/или к сдвигу рамки считывания ДНК, в конечном итоге приводя к инактивации гена, в то время как путь HDR помогает заменить мутировавшую/неправильную последовательность на правильную. Для запуска HDR, благодаря помощи шаблона (матрицы) донорской ДНК, нужные последовательности ДНК встраиваются в нужный участок [22]. Кроме того, HDR ограничен фазой G или S, в то время как NHEJ может происходить в любой фазе клеточного цикла. В целом, путь HDR обеспечивает высоконадежный механизм восстановления ДНК, хотя его эффективность ниже, чем у пути NHEJ. Существует три возможных способа редактирования нужного гена с помощью системы CRISPR/Cas9: очищенные комплексы Cas9/sgRNA, система CRISPR/Cas9 на плазмиде или комбинация Cas9-мРНК и sgRNA. Как показано в таблице 1, каждая стратегия имеет свои достоинства и недостатки .



Fig. 3. A schematic cartoon illustrating the steps involved in CRISPR/Cas9 technique. (A) Specially designed sgRNA (guide RNA) which matches with genomic DNA sequence containing mutation, attaches with Cas9 (CRISPR-associated endonuclease), a DNAase capable of inducing a double strand break, thereby, forming Cas9-sgRNA complex. (B) Association of Cas9-sgRNA complex with the target genomic DNA. Cas9 searches for appropriate sequence in target DNA with the help of sgRNA and recognises it with the help of PAMs (protospacer adjacent motifs) sequence, usually 2-6 base pair long, found 3-4 nucleotide downstream from cut site generally serve as a tag. (C) Cas9 mediated DNA cleavage leads to the formation of double strand break (DSB). (D) Formation of DSB leads to the activation of DNA repair mechanism to correct the break by sealing the gap either by Non-Homologous End Joining (NHEJ) or Homology Directed Repair (HDR).

Table 1. Different strategies that have been utilized by CRISPR/Cas9 tool in genome editing...

Генетические мутации составляют приблизительно 1% семейных случаев AD; таким образом, редактирование генома с помощью CRISPR/Cas9 может быть полезным при семейной AD (FAD) в целом с минимальными или незначительными преимуществами при спорадической AD (SAD). Однако, учитывая вовлеченность разрегулированного метаболизма Aβ в FAD и SAD, ограничение производства Aβ может предложить терапевтический подход независимо от начала заболевания, будь то семейное или спорадическое (рис. 4). В таблице 2 приведен краткий обзор исследований, которые продемонстрировали преимущества технологии CRISPR/Cas9 в качестве экспериментального терапевтического подхода при FAD и SAD.



Fig. 4. Illustration showing the possible CRISPR/Cas9 mediated gene editing approach in AD. GWAS, genome-wide association studies.

Table 2. Summary of various reported studies on AD treatment involving CRISPR/Cas9 technique.

Лечение с помощью CRISPR/Cas9 может оказаться нецелесообразным, поскольку начало и прогрессирование большинства случаев AD носит спорадический характер и связано с неизвестными триггерами. На самом деле, только в нескольких случаях AD (менее 1%) существуют реальные или известные мутации в ассоциированных генах, которые приводят к выработке APP, способствуя процессингу APP для образования Aβ Однако мутации составляют лишь небольшую часть случаев AD, но вызывают повышенную выработку Aβ Аналогично, мутации в генах пресенилина 1 (PSEN1) и пресенилина 2 (PSEN2) также вызывают раннее начало AD [32], [33], поскольку они приводят к ускоренной выработке Aβ1-42, возможно, за счет изменения сайта расщепления APP [34]. В большинстве случаев эти мутации проявляются в возрасте до 60 лет и, следовательно, относятся к раннему началу AD. Метод CRISPR/Cas9 может значительно исправить эти аутосомно-доминантные мутации. Недавние исследования также подтверждают потенциал этой системы редактирования генов, которая, как сообщалось, исправляет аналогичные типы мутаций. Например, система CRISPR/Cas9 была использована в холинергических индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPSC) базальной части переднего мозга, полученных из нейронов человека с мутацией PSEN2N141I, для коррекции аутосомно-доминантных мутаций [35], что привело к коррекции и стабилизации соотношения Aβ42/40. Более того, мутация PSEN2, исправленная с помощью этой системы редактирования, также обратила вспять электрофизиологический дефицит. Предыдущие исследования, в которых CRISPR/Cas9 использовался для исправления мутаций гена PSEN при FAD с помощью iPSCs, полученных от пациента, подтвердили эти результаты [36], [37]. В другом исследовании сообщалось, что эта система помогает нокаутировать шведскую мутацию APP в фибробластах, полученных от пациентов, обнаружив снижение Aβ на 60% [38]. Известно, что шведская мутация быстро приcоединяется к сайту β-секретазы в APP [39]. Исследователи также разрушили эту мутацию у мышей Tg2576, у которых наблюдалась многократная шведская мутация APP.

Для этого ДНК, кодирующая направляющие РНК и Cas9 в векторах AAV, была введена в гиппокамп трансгенных мышей. После инъекций наблюдались такие нарушения, как вставки одной пары оснований в гене APP Swedish. Однако нам необходимо понять, могут ли такие манипуляции улучшить поведение и патологический дефицит у мышей Tg2576. Примечательно, что когда CRISPR/Cas9 вводили непосредственно в гиппокамп, это привело к тому, что только 2% трансгенов были нарушены в месте введения [38]. Это можно объяснить тем, что у мышей Tg2576 на один нейрон приходится примерно 100 копий трансгенов, и поэтому уровень вводимого CRISPR/Cas9 кажется недостаточным для исправления шведской мутации. Хотя этот анализ обещает заманчивые перспективы, необходимо более систематическое изучение клеток гиппокампа-мишени для распознавания и повышения эффективности редактирования и перевода эффектов в естественные условия.

Эти результаты открыли путь для оценки редактирования генов с помощью CRISPR/Cas9 у людей с ранним началом AD, но как быть со sporadic AD (SAD), которые, к сожалению, составляет подавляющее большинство случаев в СШA . Чтобы проверить эффективность этой технологии редактирования генов при SAD, Sun и др. продемонстрировали редактирование эндогенного APP на крайнем С-конце для уменьшения β-расщепления и образования Аβ [27]. При этом они ингибировали дальнейшее взаимодействие с BACE1 в эндосомах, избегая, таким образом, наиболее важного события разрезания для образования Aβ [40]. Результаты исследований в iPSC-нейронах человека, культивируемых нейронах, клеточных линиях и мозге мыши показали, что это ограничивает физический контакт APP и BACE1 и, следовательно, уменьшает образование Aβ [28]. Аллель APOE4 является еще одним значительным фактором риска, способствующим развитию поздней стадии AD [41]. APOE существует в трех изоформах: APOE2, APOE3 и APOE4. Все они различаются только заменой одной аминокислоты, что приводит к замене цистеина на аргинин в позициях 112 и 158 [42]. При этом разные изоформы обладают разными свойствами, например, вероятность развития AD снижается на 40% при наличии одной копии аллеля E2, который является самой редкой формой APOE. APOE3, один из распространенных аллелей, не влияет на риск развития AD, в то время как APOE4, присутствующий примерно у 10-15% людей, снижает возраст начала AD и повышает риск развития AD [43]. Риск, который может увеличиться в 2-3 раза при носительстве одной копии E4 (E3/E4), тогда как двойные копии E4 (E4/E4) могут повысить его примерно в 10-15 раз. Фактически, 65-80% всех пациентов с диагнозом AD имеют ~ 1 аллель APOE4 [43], [44]. Хотя некоторые неблагоприятные эффекты APOE4 связаны с накоплением Aβ, недавнее исследование показало, что фосфорилирование tau в нейронах, полученных из человеческих iPSCs, может стимулироваться APOE4, независимо от Aβ [45], [46]. В этом исследовании редактирование генов с помощью нуклеазы с цинковыми пальчиками для преобразования APOE4 в APOE3 предотвратило патологию, связанную с APOE4, в их модельной системе [46]. Следовательно, CRISPR/Cas9 также может выступать в качестве потенциального инструмента редактирования для преобразования APOE4 в APOE2 или E3. Примечательно, что одно исследование указывает на важные структурные особенности APOE4, которые отличают его от APOE2 и E3, и обусловливают взаимодействие доменов, осуществляемое через солевой мостик между аминокислотами Arg-61 и Glu-255 [47]. Таким образом, изменение одной из этих аминокислот с помощью CRISPR/Cas9 может эффективно нейтрализовать риск, связанный с аллелем APOE4. Далее в таблице 3 рассматривается терапевтическая роль CRISPR/Cas9 в исправлении специфических последовательностей генов.



Table 3. Overview of reported clinical trials on AD therapeutics using CRISPR/Cas9 technique.

Геномное редактирование CRISPR/Cas9 открывает большие перспективы в лечении AD. Хотя эффективные и безопасные системы доставки все еще отсутствуют, это огромная задача, требующая перевода этого технологического подхода в реальное терапевтическое применение. На сегодняшний день существуют вирусные и невирусные методики доставки систем CRISPR/Cas9.

Использование вирусных векторов для доставки CRISPR/Cas9 является классическим методом в экспериментальных моделях, включая клеточные линии и животных, и одной из наиболее динамичных систем для адресной доставки CRISPR/Cas9 на основе плазмид. Более того, они могут включать мутации, которые имеют значительные негативные последствия. Адено-ассоциированный вирус (AAV) является часто используемым вектором из-за его высокой инфекционности, низкой иммуногенности и низкой степени интеграции в геном человека [24], [25]. Геном AAV состоит из одноцепочечной ДНК и имеет более 200 вариантов [26]. В одном исследовании сообщалось об использовании двух отдельных векторов AAV, упаковывающих APPsw-специфическую gRNA и Cas9, нацеленных на вызывающую AD мутацию APP KM670/671NL. Вирусы были протестированы in vitro в первичных нейрональных клетках из эмбрионов мышей Tg2576 и in vivo путем инъекции внутрь гиппокама мышам Tg2576. Такое лечение снизило выработку Aβ примерно на 60% в фибробластах человека [38]. Из-за низкой способности к упаковке 4,7 кб AAV может потребоваться совместное введение двух вирусов. Однако это еще больше усложнит процедуру, поскольку оба вируса не могут одновременно инфицировать одну и ту же клетку. Лентивирусы содержат длинные ДНК-вставки, состоящие из 8-10 кб, но их эффективность распространения по мозгу ниже [27]. Однако, в отличие от AAV, лентивирусы не так легко производить в больших количествах, и они могут быть встроены в геном человека, тем самым вызывать иммунные реакции [25]. Однако исследования показали возможность использования лентивирусов для воздействия на три гена, а именно APOE4, APP и каспазу-6, при SAD и семейном AD [28], [29], [30].

Невирусные векторы были признаны перспективными для целевой доставки CRISPR/Cas9, что объясняется их большей экономичностью, относительной простотой, осуществимостью и гибкостью. Следовательно, они чрезвычайно подходят для применения при AD. Очень легко сформировать нано-комплексы, объединив положительно заряженные пептиды CRISPR/Cas9 с отрицательно заряженным нуклеиново-кислотным грузом. По сравнению с вирусными векторами они менее иммуногенны; кроме того, они могут помочь в многочисленных применениях, поскольку совместимы с лигандами. Хотя доставка нано-комплексов в мозг является сложной задачей, поскольку при системном введении они не могут должным образом преодолеть гематоэндотелиальный барьер (BBB), а ретикулоэндотелиальная система (RES) также активно удаляет их из крови. Поэтому стандартно использовались инъекции в желудочки мозга и интратекальные инъекции. Однако при методах прямой инъекции для обеспечения правильного распределения по мозгу требуется несколько инъекций, что ограничивает их применение. Park и др. использовали рибонуклеопротеин Cas9-sgRNA, специфически нацеленный на BACE1, в комплексе с нано-комплексами из пептида R7L10 [49], и сообщили об успешном целенаправленном воздействии, снижении экспрессии BACE1 без существенных внецелевых мутаций in vivo. В дополнение к доставке CRISPR/Cas9, несколько других транспортных средств могут переносить короткие интерферирующие РНК (siRNAs) для осуществления воздействия на AD через BBB. В недавних докладах использовались полимерные нано-комплексы носители Poly(mannitol-polyethyleneimine) (PMT), дополненные rabies infection glycoprotein (RVG) [27]. Полимер был разработан для образования комплекса с siRNA, нацеленной на ген BACE1. Предполагалось, что нано-комплексы будут обладать повышенной способностью передачи благодаря присутствию лиганда RVG, который улучшает проникновение через BBB и сфокусируется на нервных клетках. Polyethylene glycol (PEG) снижает эффективность трансфекции, создавая положительно заряженную защиту, которая препятствует связыванию с клеточными мембранами. Было предложено решить эту проблему с помощью лиганда RVG, тем самым улучшив клеточное поглощение нано-комплексов. Снижение уровня Aβ1-42 в коре головного мозга еще раз подтвердило способность нано-комплексов к замалчиванию. Однако значительная потеря терапевтического потенциала может быть обусловлена неизвестным пока распределением в организме, поэтому пригодность такого подхода к доставке должна быть исследована на различных моделях AD.

Следующие системы являются перспективными для применения при AD. ДНК-наноклубки могут доставлять комплекс Cas9-sgRNA. Традиционная сборка наноструктур ДНК, основанная на сопряжении оснований, сложна и требует много времени. Sun и др. сообщили, что ДНК-нано-стержни представляют собой ограниченные нано-размерные молекулы ДНК, включающие полиэтиленимин для нанесения положительного заряда для эндосомального просачивания и улучшения клеточного поглощения [60]. Нано-клубки, несущие комплекс sgRNA-Cas9, нацеленный на усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), локально вводились мышам, несущим опухоли. После десяти дней лечения это привело к снижению экспрессии EGFP на 25% [60]. Однако наночастицы могут вызывать иммуногенный ответ, что требует дальнейшего изучения. Важно отметить, что полимерные наночастицы и липидные наночастицы также демонстрируют потенциал в качестве инструментов доставки CRISPR/Cas9. Эти наночастицы широко использовались для переноса инструментов редактирования генов при гепатите, раке и некоторых вирусных инфекциях [61], [62]. Однако их потенциальное применение при AD требует дальнейшего изучения. Кроме того, Wang и др. использовали AuNPs для исследования [63]. Ген CXCR4, нацеленный с помощью CRISPR-Gold, достиг эффективности HDR около 3-4% во многих типах клеток человека. Более того, локальное введение CRISPR Gold в икраножныую мышцу и переднюю большеберцовую мышцу мышей mdx привело к коррекции мутировавшего гена дистрофина, вызывающего врожденную мышечную дистрофию Дюшенна [63]. Однако после введения CRISPR Gold не было обнаружено значимых изменений в профиле воспалительных цитокинов, что указывает на низкую токсичность. Недавно внимание было привлечено к терапевтической доставке CRISPR/Cas9 через микровезикулы. Как правило, клеточная линия "производитель" трансфицируется белком-провокатором микровезикул (белки RAB), sgRNA и белками Cas9 [64]. Клетки производят микровезикулы, состоящие из комплексов Cas9-sgRNA, которые опускаются в среду, впоследствии стерилизуемую и используемую для доставки инструментов редактирования генов в клетки-мишени.

В предыдущем разделе мы подробно остановились на возможной роли CRISPR/Cas9 в лечении AD. Однако важно также рассмотреть последствия применения этой технологии при других NDDs, а также для управления и лечения аномалий мозга. Недавно эта технология была применена для лечения нескольких нейродегенеративных заболеваний, включая PD и HD.

PD - это возрастное, прогрессирующее, многофакторное и одно из самых распространенных нейродегенеративных заболеваний, проявляющееся моторными и не-моторными двигательными признаками. Надлежащее лечение PD до сих пор отсутствует, поскольку патологический механизм и сигнальная ось, ответственные за прогрессирование заболевания, до конца не изучены. Однако CRISPR/Cas9 может быть полезен в идентификации путей и белков, связанных с патогенезом PD (Таблица 4). Кроме того, эта технология может помочь в выявлении сложных взаимодействий между генетикой человека и факторами окружающей среды, приводящих к развитию PD [65]. Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) в гене SCNA (α-синуклеина) были проанализированы Soldner и др. с помощью этой системы, и они сообщили о наличии общего варианта не-кодирующего дистального усиливающего элемента, ответственного за усиление экспрессии SCNA [66]. Этот инструмент также помогает ученым в исследованиях PD получать изогенные клеточные линии для моделирования PD и, следовательно, может способствовать анализу фенотипов PD. В этой связи Arias-Fuenzalida и др. ввели флуоресцентные маркеры и систему CRISPR/Cas9 для получения популяций клеток с биаллельным геномом. Они назвали этот подход FACS-assisted CRISPR/Cas9 editing (FACE). Метод FACE помогает получить набор изогенных клеточных линий с мутированным α-синуклеином, ассоциированным с PD [67]. С другой стороны, мутации в киназе 2 с богатым лейциновым повтором (LRRK2) являются наиболее распространенной генетической причиной спорадической и семейной PD, которая вызывает токсичность в дофаминергических нейронах. Инструмент CRISPR/Cas9 был использован для редактирования мутировавшего LRRK2, что привело к уменьшению сложности нейритов в дофаминергических нейронах и снижению заболеваемости как спорадической, так и семейной PD [68].



Table 4. Overview of reported clinical trials on PD and HD therapeutics using CRISPR/Cas9 technique.

CRISPR также недавно был признан перспективной системой, помогающей понять взаимодействие между генами PD и выявить новые апоптотические каскады, прямо или косвенно связанные с PD. Например, регулятор паркина, THAP11, был недавно выявлен в исследовании CRISPR/Cas9-нокаутов в различных типах клеток, чтобы найти ранее не обнаруженные регуляторные перекрестные связи/сети [69]. Эта система также была использована для изучения нейровоспалительных механизмов, связанных с PD. Например, протеинкиназа Сδ (PKCδ), связанный с Mn-индуцированной апоптической гибелью клеток при PD, включает активацию PKCδ CRISPR/Cas9-опосредованное подавление PKCδ в дофаминергических нейронах (DA), значительно препятствует фрагментации ДНК, индуцированной Mn. Кроме того, эта система может также помочь понять пути нисходящего потока PKCδ