Для анализа ESE использовался сайт http://crispinator.com/ko/ для определения расположения ESEs вдоль кодирующей области NRF2 (искалось как NFE2L2). Все исходные критерии поиска были оставлены без изменений.

Предыдущие работы нашей лаборатории показали, что генетическое нарушение NRF2 в клетках A549, клеточной линии, полученной из аденокарциномы легкого [6, 7, 21, 22], приводит к повышению химиочувствительности [6]. В данной работе мы расширяем эти исследования, используя серию комплексов CRISPR/Cas, разработанных для расщепления и разрушения NRF2 в различных местах гена. На рисунке 1 представлен обзор нашей стратегии редактирования генов с помощью CRISPR/Cas9. Одна guide RNA (gRNA), обозначенная (1), была использована для нацеливания на экзон 2, который кодирует домен Neh2 белка. Отдельная пара gRNAs, обозначенная (2) и (3), использовалась для нацеливания на экзон 4, который кодирует первую половину домена Neh5. Также был использован подход двойной gRNA, при котором обе gRNAs (2) и (3) были одновременно трансфецированы для создания больших фрагментов делеций в экзоне 4. Нацеливаясь на два несмежных экзона NRF2, мы можем проанализировать последствия молекулярных перестроек, индуцированных активностью CRISPR/Cas в клетках A549.

Fig. 1 CRISPR design and NRF2 sequence target. The top panel displays the structural domains of the NRF2 protein aligned to the exons of the NRF2 gene. Three guide RNAs were designed to cleave within exon 2 and exon 4 of the gene. The top panel provides a schematic diagram of the cleavage sites of each guide RNA in relation to the gene and protein. The bottom panel presents sequence alignment and actual cleavage sites of each guide RNA. Guide RNA (1) was designed to target the beginning of exon 2 whereas guide RNA (2) and (3) were designed to target the beginning and end of exon 4, respectively.

Генетический анализ нокаута NRF2 - в частности, генотип клонов 1-17, 2-16 и 2-23 - представлен на рис. 2А. Эти клоны были созданы путем нацеливания на экзон 2 с помощью одной guide RNA (gRNA (1)). Геномные indels для каждого клона были деконволюционированы с помощью программы DECODR [23] путем парного анализа, в котором используется как прямое, так и обратное секвенирование каждого клона. DECODR представляет распределение indels в каждом клоне из необработанных данных последовательности, а процентное соотношение соответствует indels для каждого аллеля. В данном случае большинство клонов представлены с тремя аллелями, так как клеточная линия A549 известна как гипотриплоидная [24]. 100% (например, клон 1-17, клон 2-16) означает, что все аллели содержат указанный indel. 84/16% (например, клон 2-23) означает, что 84% геномной ДНК относится к дикому типу, а около 16% содержит делецию двух пар оснований. Это примерно соответствует двум аллелям дикого типа и одному мутантному аллелю. Наш генетический анализ показывает, что клон 1-17 содержит делецию двух пар оснований в целевом сайте во всех трех аллелях, вызывающую мутацию со сдвигом рамки считывания, которая образует стоп-кодоны ниже по течению. Клон 2-16 содержит делецию одной пары оснований выше по течению от целевого сайта, также вызывающую сдвиг рамки считывания, который образует стоп-кодоны ниже по течению. Клон 2-23, напротив, содержит единственное аллельное нарушение в виде делеции двух пар оснований в целевом сайте, вызывающее мутацию со сдвигом рамки считывания и образующее стоп-кодоны ниже по течению. Два других аллеля гена NRF2 в клоне 2-23 относятся к дикому типу.

Fig. 2: Genomic and transcript analyses of A549 clonal cell lines created by CRISPR targeting.

A Genomic DNA from clonal cell lines, 1-17, 2-16 and 2-23, was isolated and amplified across exon 2 of the NRF2 gene. Amplicons were sanger sequenced and analyzed for indels at the CRISPR target site. Raw sequence files were aligned using the software program, DECODR, to display the NRF2 allele-specific indel pattern (listed as INDEL and %). B The first column lists the cell line and clonal identification number with the associated guide RNA (blue) used to target NRF2. The second column lists the genomic NRF2 sequence of each clone and the allele-specific indel patterns with the normal genomic sequence are listed before each set. The guide RNA sequence is depicted in blue and the PAM in orange with the cleavage site represented by the vertical line. Exonic splicing enhancers are highlighted in green within the second column. The third column lists the population of mRNA transcripts of each clonal cell population.

Мы стремились выяснить, повлияет ли генетическое нарушение NRF2 на типы популяций мРНК в клетке-мишени (рис. 2B). В первой колонке указан идентификационный номер клона с соответствующей gRNA, использованной для нацеливания на NRF2. Во второй колонке перечислены геномная последовательность NRF2 каждого клона и аллель-специфические отступы, индуцированные указанными гgRNAs. Нормальная геномная последовательность указана перед каждым набором клонов с изображением последовательности gRNA синим цветом, PAM - оранжевым, а сайт расщепления представлен вертикальной линией. В третьем столбце перечислена популяция транскриптов мРНК, возникающих в каждой клональной клеточной линии, образовавшейся в результате действия CRISPR-направленного редактирования генов. Например, индель (т.е. 2), указанный в третьем столбце, означает, что этот indel, первоначально идентифицированный при геномном секвенировании, также проявляется в популяции транскриптов мРНК. В большинстве клональных клеточных линий вторая популяция транскриптов может возникнуть в результате пропуска экзонов, вероятно, индуцированного ESEs [19], которые выделены зеленым цветом. Обилие усеченных транскриптов, образующихся в результате CRISPR-направленного редактирования генов, заставило нас изучить последовательности ДНК, расположенные ближе к целевому сайту. CRISPinatoR, разработанная Tuladhar и др., представляет собой веб-платформу для конструирования sgRNA для CRISPR/Cas9, которая ищет сайты ESE, позволяющие модифицировать транскрипты на геномном уровне. Мы подозревали, что активность CRISPR/Cas9 модифицирует некоторые регуляторные последовательности, которые впоследствии позволят или исключат пропуск экзонов в гене NRF2 и вокруг него (Дополнительный рис. 1). Несмотря на то, что о феномене пропуска экзонов сообщалось ранее, мы посчитали важным продемонстрировать генетическую перестройку по отношению к пропуску экзонов в отдельной клеточной линии. Поэтому мы смогли подтвердить наличие подобных перестроек в гене NRF2 в отдельной клеточной линии, H1703, с помощью различных конструкций gRNA (Дополнительный рис. 2A). Использование различных gRNAs для достижения пропусков экзонов, связанных с CRISPR-направленным редактированием генов, демонстрирует широкую природу этой метаболической активности.

Клоны 1-17 и 2-16 содержат две различные популяции транскриптов, первая из которых отражает изменения, вызванные CRISPR, присутствующие в геномной ДНК, а вторая популяция демонстрирует пропуск экзонов. Интересно, что, несмотря на наличие геномного indel на одном аллеле в дополнение к двум аллелям дикого типа в локусе NRF2, клон 2-23 содержит только одну популяцию транскриптов дикого типа. Сайт расщепления gRNA(1) находится между двумя первыми нуклеотидами (G-C) пятого сайта ESE в экзоне 2. Расположение каждого ESE относительно целевого сайта CRISPR, по-видимому, играет ключевую роль в событиях пропуска экзонов.

В нижней части рис. 2В представлены две клональные клеточные линии (1-40 и 2-11), созданные путем нацеливания на экзон 4 NRF2 с помощью двух отдельных gRNAs, как описано ранее [6]. Генетический анализ выявил различные паттерны отступов в целевом сайте в каждом клоне. Клон 1-40 несет два аллеля с одинаковым рисунком indels и один аллель дикого типа, тогда как клон 2-11 содержит три уникальных indels в целевом сайте. Интересно, что при анализе популяций транскриптов в обоих клонах мы обнаружили только транскрипты, отражающие изменения, наблюдаемые в геномной ДНК, без пропусков экзонов. По-видимому, когда первоначальная активность расщепления CRISPR/Cas9 происходит дистальнее последовательностей, идентифицированных как ESEs [19], целостность этих цис-действующих элементов последовательности сохраняется, что позволяет им функционировать должным образом.

Чтобы оценить универсальность явления пропуска экзонов, мы использовали двойную систему из gRNA (2) и gRNA (3) (см. рис. 3A), направленную на разрушение экзона 4 и создание еще одного семейства клональных вариантов (рис. 3B). Подход двойной направляющей РНК был разработан для удаления фрагмента из 103 пар оснований из середины экзона 4. Из тридцати двух клональных клеточных линий десять были размножены и дополнительно охарактеризованы. Каждый клон демонстрирует разнообразие геномных признаков, включая потерю трех сайтов ESE. Однако из десяти охарактеризованных клонов только клон 33 показал пропуск экзона 4. Интересно, что клональные клеточные линии 31, 33 и 44 отличаются только одной парой оснований, однако клоны 31 и 44 не производят популяцию транскриптов с пропуском экзонов. Клоны 33 и 21 содержат делеции размером 101 п.н., но только клон 33 демонстрирует пропуск экзонов. Вместе взятые, наши данные свидетельствуют о том, что результаты генетического нокаута, даже на уровне одного нуклеотида из-за активности негомологичного соединения концов (resection) могут вызывать или подавлять пропуск экзонов.

Fig. 3: Genomic and transcript analyses of A549 clonal cell lines created by dual CRISPR targeting.

A Schematic diagram of the actual cleavage sites of guide RNA (2) and (3) and the resulting 103 base pair fragment deletion caused by using the dual guide RNA approach. The exon splicing enhancers are shown in green. B The first column lists the cell line and clonal identification number with the associated guide RNA used to target NRF2. The second column lists the genomic NRF2 sequence of each clone and the allele-specific indel patterns with the normal genomic sequence is listed before each set. The guide RNA sequence is depicted in blue and the PAM in orange with the cleavage site represented by the vertical line. Exonic splicing enhancers are highlighted in green within the second column. The third column lists the population of mRNA transcripts of each clonal cell population.

Поскольку мы картировали генетические результаты CRISPR-направленного редактирования генов на уровне генома и транскриптов, мы стремились визуализировать активность пропуска экзонов на уровне белков. Вестерн-блот анализ NRF2 в различных клеточных линиях был особенно сложен из-за различий в предсказанной и фактической молекулярной массе NRF2 [25, 26]. Тем не менее, нам удалось обнаружить дикий и модифицированный NRF2 с помощью рекомбинантного антитела против NRF2, приобретенного у Abcam (Кембридж, Англия), как в клеточной линии A549 (рис. 4), так и в клеточной линии NCI-H1703 (Дополнительный рис. 2B). Как показано на рис. 4А, NRF2 дикого типа (клетки A549) хорошо виден, мигрирует в диапазоне от 95 до 110 кДа, что соответствует предыдущим наблюдениям [26]. Две полосы появляются при ~90 кДа, которые отражают то, что было широко описано как ядерный (верхняя полоса) и цитоплазматический NRF2 (нижняя полоса) [25, 27-29]. Полоса 2 содержит лизат целых клеток из клона 1-17, клональной клеточной линии, которая содержит популяцию транскриптов с пропуском экзонов 2 и 3, а также транскрипты с делецией двух пар оснований (см. рис. 2). Как и было предсказано, видимый белок, мигрирующий на уровне 90 кДа, отсутствует, поскольку транскрипт не производит белок, однако полоса, мигрирующая на уровне ~75 кДа, представляет собой укороченный транскрипт. На третьей полосе полоса 90 кДа отсутствует, что также указывает на то, что транскрипт с делецией одной пары оснований не производит белок; более низкая полоса, наблюдаемая на этой полосе, отражает пропущенный экзон 2 транскрипта, который мы идентифицировали как часть популяции транскриптов мРНК. На четвертой полосе лизат целых клеток клона 2-23 обнаруживает слабую, но видимую полосу на уровне 90 кДа и связанную полосу ниже нее, как и на первой полосе с родительскими клетками A549. Как указано на рис. 2, клон 2-23 несет два аллеля дикого типа и один мутировавший аллель; следовательно, мы ожидаем, что будет продуцироваться белок дикого типа. Последние две полосы представляют собой лизаты целых клеток клона 1-40 и клона 2-11, соответственно, которые были созданы путем нацеливания на экзон 4. На пятой полосе клон 1-40 дает две видимые полосы на уровне 90 кДа, что отражает популяцию мРНК, обнаруженную в клональной клеточной линии. Этот клон содержит аллель дикого типа и два аллеля с делецией 9 пар оснований. На шестой полосе цельноклеточный лизат из клона 2-11 обнаруживает две полосы на 90 кДа, менее заметные, чем в клоне 1-40, что соответствует indels со сдвигом рамки (-1, -10) на двух аллелях и indels без сдвига рамки (-6) на третьем аллеле, который, вероятно, является транскриптом, обеспечивающим экспрессию белка.

Fig. 4: Representative western blot analysis of CRISPR-engineered A549 clonal cell lines.

Clonal cells were harvested for western blot analysis using an antibody directed against NRF2 and GAPDH was used as a loading control. A This image displays the detection of NRF2 protein from A549 clonal cell lines targeted with a single CRISPR guide RNA in both exon 2 and exon 4, as marked. Lanes 2-6 contain whole cell lysates from NRF2 modified clonal cell lines. B This image displays the detection of NRF2 protein from A549 clonal cell lines targeted with two CRISPR guide RNAs in exon 4.

Дальнейший анализ белков генно-инженерных клональных изолятов представлен на рис. 4В. Первая полоса, после белковой лестницы, отражает появление NRF2 дикого типа (95 кДа), полученного из лизата родительских клеток A549. На второй полосе - лизат целых клеток из клона 15 с видимой полосой при 90 кДа. Этот клон содержит делецию из 1, 103, 102 пар оснований в геномной ДНК, что отражено в транскрипте мРНК. Делеция 1 и 103 пар оснований является кадровым сдвигом и, вероятно, подвергается деградации. Однако делеция 102 пар оснований находится в рамке и, скорее всего, транскрибируется в мутантный белок, который визуализируется на вестерн-блоте. Делеция на 102 пары оснований представляет собой потерю 34 аминокислот, что приводит к уменьшению размера белка примерно на 4 кДа. Та же концепция применима к четвертой полосе, которая содержит лизат целых клеток клона 32. Клон 32 содержит делеции 103, 104 и 102 пар оснований, которые видны в геномной ДНК и отражены в транскрипте мРНК. Делеции 103 и 104 пар оснований сдвинуты по рамке и, скорее всего, деградируют, тогда как 102 пара оснований, как и в клоне 15, находится в рамке и экспрессируется как мутантный белок. На третьей полосе - цельноклеточный лизат клона 21, который содержит делеции 1, 103 и 101 п.н. в gDNA и отражен в мРНК. В данном случае все три indels вызывают сдвиг рамки и, вероятно, являются причиной полного нокаута NRF2. На пятой полосе - лизат целых клеток клона 33, который содержит гомозиготную делецию 101 пары оснований в геномной ДНК, что приводит к пропуску экзона 4 в мРНК. Поскольку делеция 101 пары оснований является кадровым сдвигом, белок, который обнаруживается на вестерн-блоте, является белком, с пропуском в экзоне 4. Пропуск экзона 4 - это потеря 192 пар оснований или 64 аминокислот, в результате чего размер белка уменьшается примерно на 7 кДа. Судя по картине экспрессии белка в этих четырех клонах, каждая клональная клеточная линия производит аллель-специфический белок (обобщенная информация представлена на Дополнительном рис. 3).

Как показано на рис. 2 и 3, после CRISPR-изменений гена NRF2 многие клональные клеточные линии представили альтернативно сплайсированные транскрипты NRF2. Это было подтверждено секвенированием кДНК, которое показало наличие двух популяций транскриптов - одна отражает пропуск экзонов, а другая отражает картину indels, отмеченную в геномной ДНК. В отличие от результатов секвенирования кДНК, вестерн-блот анализ предположительно показал, что в этих клональных клеточных линиях экспрессируются только изоформы с пропуском экзона. Для подтверждения экспрессии и клеточной локализации этих измененных изоформ, мы использовали одномолекулярную флуоресцентную гибридизацию in situ (smFISH) для визуализации транскриптов, производимых в этих клональных клеточных линиях (A549 клон 1-17 и 2-16) по сравнению с родительской клеточной линией A549 (WT) (рис. 5). РНК-зонды были разработаны для экзонов 2, 3 и 5 NRF2 и впоследствии помечены различными флуоресцентными метками, чтобы иметь возможность различать измененные и полноразмерные транскрипты. РНК-зонды, специфичные для экзона 5, были помечены Alexa 594. Поскольку экзон 5 присутствует во всех выявленных популяциях транскриптов, маркировка экзона 5 позволяет получить универсальный снимок присутствующих транскриптов. Чтобы отличить транскрипты с пропущенным экзоном, зонды для экзона 2 и экзона 3 были помечены cy5. Как показано на схеме рис. 5А, ко-локализация обоих флуоресцентных зондов приводила к слиянию флуоресцентных сигналов (желтый цвет) и указывала на присутствие полноразмерного транскрипта. Транскрипты, не содержащие экзоны 2 или 3, связывали только зонды, меченные Alexa 594, предназначенные для экзона 5, что приводило к появлению одиночного флуоресцентного сигнала (показан зеленым цветом).

Fig. 5: Detection of altered NRF2 transcripts by smFISH imaging.

A Schematic diagram of the hybridization of labeled RNA probes to wildtype and altered NRF2 transcripts and the resulting fluorescence signal. B Representative images from A549 clone 1-17 cells labeled with probes for exon 2 and exon 3 labeled with cy5 and exon 5 labeled with Alexa 594. C Representative images from A549 clone 2-16 cells labeled with probes exon 2 labeled with cy5 and exon 5 labeled with Alexa 594. The gray-scale images in the two panels are merged images (z-stacks) from each fluorescence color channel followed by the merged image with Exon 2 and Exon 3 or just exon 2 pseudo colored as red, and the exon 5 signal pseudo colored as green. The images are merged with DAPI staining shown in blue and overlaid with circles obtained after analysis using custom-written program in MATLAB image processing software. D Quantification of the smFISH data after analysis of at least 100 cells of each type. The error bars indicate 95% confidence interval. The scale bar is 5?µm. ***P<0.001.

На рисунке 5B и C показаны репрезентативные изображения smFISH клеток A549 клона 1-17 и клона 2-16. На рисунке 5B показан smFISH, сравнивающий родительские клетки A549 и клетки A549 клона 1-17. Эти клональные клетки содержат две популяции транскриптов - одна отражает делецию двух пар оснований, наблюдаемую в геномной ДНК, а другая - пропуск экзонов 2 и 3. Используя smFISH, мы можем визуализировать и количественно оценить транскрипты, производимые в клетке. Как было подтверждено секвенированием кДНК, клон 1-17 производит транскрипты NRF2 "полной длины" (желтый сигнал); однако преобладающая популяция транскриптов, визуализируемая в этих клетках, - транскрипты с пропуском экзонов (зеленый сигнал - экзон 5) (рис. 5D). На рисунке 5C показан smFISH, сравнивающий родительские клетки A549 и клетки A549 клона 2-16. Эти клональные клетки также содержат две популяции транскриптов - одна отражает делецию одной пары оснований, наблюдаемую в геномной ДНК, а другая - пропуск экзона 2. Как и клон 1-17, клон 2-16 также продуцирует "полноразмерные" транскрипты NRF2 (желтый сигнал), однако преобладающей популяцией транскриптов в этих клетках являются транскрипты с пропуском экзона (всего экзон 5 - зеленый сигнал) (рис. 5D). На основании данных, представленных на рис. 5, мы можем подтвердить, что в обеих клональных клеточных линиях измененный транскрипт приводит к экспрессии белка и влияет на нижележащие пути.

Обнаружение и характеристика популяций транскриптов в нокаутных линиях клеток NRF2, обусловленных CRISPR, заставило нас задаться вопросом, повлияют ли такие молекулярные изменения на уровне ДНК и РНК на функцию NRF2. Одной из его ключевых функций является защита клеток от избыточного стресса путем активации генов, участвующих в цитопротекторных путях. Таким образом, NRF2 обеспечивает устойчивость к химиотерапии, и поэтому отключение NRF2 должно снизить устойчивость и повысить химиочувствительность [6, 7, 21].

Для оценки изменений химиорезистентности в различных клональных клеточных линиях мы использовали анализ жизнеспособности MTS, колориметрический метод для измерения метаболически активных и жизнеспособных клеток в анализах пролиферации, цитотоксичности и химиочувствительности. На рисунке 6A показана относительная пролиферация клеток A549s и производных клонов, 1-17, 2-16 и 2-23, при обработке различными концентрациями цисплатина. Было проведено два отдельных эксперимента с использованием каждого клона в квадруплете, в результате чего было собрано восемь точек данных для каждой концентрации каждого клона.

Fig. 6: Proliferation capacity of wild type and NRF2 modified A549 clonal cell lines in response to cisplatin treatment.

Proliferation was measured via bioreduction of MTS to a formazan product. Cells were treated with increasing concentrations of cisplatin for 72?h then evaluated for cell proliferation. The average relative proliferation of cells in response to cisplatin is graphed above. Exon 2 modified clonal cells are presented in A and exon 4 modified clonal cells are presented in B. C Data compiled from previous graphs for comparison of clonal cell lines with altered NRF2 expression. Error bars represent ±SEM, n=8. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs. A549 WT cells with the same treatment.

Для оценки изменений химиорезистентности в различных клональных клеточных линиях мы использовали анализ жизнеспособности MTS, колориметрический метод для измерения метаболически активных и жизнеспособных клеток в анализах пролиферации, цитотоксичности и химиочувствительности. На рисунке 6A показана относительная пролиферация клеток A549s и производных клонов, 1-17, 2-16 и 2-23, при обработке различными концентрациями цисплатина. Было проведено два отдельных эксперимента с использованием каждого клона в квадруплете, в результате чего было собрано восемь точек данных для каждой концентрации каждого клона. Мы расширили этот анализ, проведя эксперименты со вторым набором клональных клеточных линий, клонами 15, 21, 32 и 33, и родительскими клетками A549 (рис. 6B). Каждая клональная клеточная линия содержит уникальный состав молекул мРНК (перечислены на рис. 2). Клональные клеточные линии 33 и 21 имеют схожий ответ на лечение цисплатином. Ответ клона 33 предсказуем, поскольку он содержит две популяции транскриптов - одна популяция с пропуском экзона 4, а в другой отсутствует 101 пара оснований, что соответствует картине инделов, наблюдаемой в геномной ДНК. Клон 21 содержит делеции 1, 103 и 101 п.н. в геномной ДНК, что отражено в мРНК. Как видно из вестерн-блота на рис. 4B, клон 21 не поддерживает обнаруживаемую экспрессию белка NRF2, поэтому потеря NRF2 должна сенсибилизировать клетки к химиотерапии. Как и было предсказано, клон 21 действительно демонстрирует повышенную чувствительность к цисплатину даже при более низких концентрациях. Напротив, клоны 15 и 32 демонстрируют химиорезистентность, подобную той, что наблюдается у родительской клеточной линии A549.

На рисунке 6A и B представлена генетически разнообразная популяция клеток, нацеленных с помощью CRISPR на разрушение NRF2. Каждая клональная клеточная линия имеет уникальный молекулярный результат, который диктует ее ответ на химиотерапию. Чтобы обобщить различия в чувствительности к химиотерапии из-за пропуска экзонов в NRF2, мы собрали данные этих клональных клеточных линий на рис. 6C вместе с полным нокаутом NRF2, наблюдаемым в клоне 21, для сравнения. Как видно на графике, картина ответа на увеличение концентрации цисплатина сходна среди всех четырех клональных клеточных линий по сравнению с родительскими клетками A549. Этот интересный результат будет изучен более детально, чтобы соотнести генетическую перестройку с фенотипическим ответом, таким как химиотерапия, иммунотерапия или даже лучевая терапия. Мы будем продолжать следовать этой линии исследования, нацеливаясь на дополнительные гены, такие как EGFR, TP53 и даже CDKN2A, хотя в данной работе для фундаментального установления пропуска экзонов в NRF2 было проведено глубокое аналитическое исследование в клетках A549 и H1703 соответственно.

Поскольку редактирование генов под руководством CRISPR проходит через процесс клинических испытаний [30-32], необходимо, чтобы исследователи проанализировали спектр генетических последствий, вызванных этой прорывной генетической технологией. В прошлом генетические лекарства быстро продвигались вперед, и многие узнали о печальных результатах. Хотя генетическая модификация обладает необъятным потенциалом для пациентов с раком и наследственными заболеваниями, предыдущие итерации не оправдали ожиданий. Мы осознаем эти факты и, продвигая редактирование генов в качестве вспомогательной терапии солидных опухолей, мы намеренно использовали редукционистский и методологический подход для оценки разнообразия популяций раковых клеток, подвергшихся редактированию, на генотипическом, фенотипическом и функциональном уровнях.

Наши эксперименты были разработаны специально для оценки того, как опухолевые клетки будут реагировать на CRISPR/Cas, и наши результаты показывают, что образуется гетерогенная популяция, экспрессирующая вариации NRF2. Мы обнаружили, что пропуск экзонов не только активен в ответ на расщепление ДНК с помощью CRISPR/Cas, но в некоторых случаях измененные транскрипты доминируют в популяции. Главный вывод нашей работы заключается в том, что наличие и положение ESE должно серьезно учитываться при разработке gRNAs - фундаментального компонента системы CRISPR/Cas. Фактически, можно утверждать, что нарушение ESEs более вредно, чем более разрекламированная возможность мутагенеза вне сайта-мишени. Как мы описывали ранее [6], мутагенез окально оказывает прямое влияние на экспрессию генов, нарушая регуляцию механизмов контроля.

Результаты, представленные в настоящей рукописи, получены в ходе экспериментов, проведенных с помощью серии направляющих РНК, нацеленных на несмежные экзоны с использованием стратегий одиночного и двойного нокаута. Этот матричный рабочий процесс был специально разработан для того, чтобы мы могли убедиться в том, что информация, полученная в ходе таких исследований, не обусловлена только уникальным участком в NRF2. Более ранние работы нашей лаборатории послужили основой для создания комбинаторных экспериментальных конструкций в связи с разнообразием генетических результатов деятельности CRISPR/Cas на генах млекопитающих [33-37]. Здесь мы подтверждаем существование такого генетического разнообразия и на уровне РНК: из генетически измененного гена возникает множество транскриптов. Более того, эти транскрипты транслируются в белки с измененной функцией. Наш предварительный анализ изменений экспрессии генов в этих клональных клеточных линиях выявил подавление и активацию генов, на которые, как предполагается, влияет нокаут NRF2.

Ранее мы установили, что CRISPR-направленный нокаут NRF2 в экзоне 4 нарушает сигнал ядерного экспорта интактного белка, изменяя фенотип и достигая желаемого результата [6]. Пока NRF2 транслируется в усеченный белок, он не может проникнуть в ядро, и поэтому его способность активировать гены стрессового ответа в значительной степени блокируется. Как и было предсказано, генетическая перестройка NRF2 значительно снижает устойчивость к убивающему действию различных видов химиотерапии. Хотя это, безусловно, дало толчок для разработки клинической стратегии, сохраняющееся присутствие белка NRF2, который, по общему признанию, не имеет очевидных функций, побудило нас более глубоко изучить молекулярные последствия нокаута гена NRF2 с транскрипционной точки зрения.

В рамках детального анализа мы создали серию клональных изолятов, различающихся по степени нокаута аллеля NRF2. Один из этих клональных изолятов иллюстрирует сложность и разнообразие клеточного ответа на CRISPR-направленное редактирование генов. Клон 1-17 содержит делецию двух пар оснований в сайте расщепления CRISPR во всех аллелях NRF2 в клетках A549. В результате в популяции клонированных клеток присутствует смешанная популяция транскриптов. Эта смешанная популяция состоит из транскриптов с делецией двух пар оснований, как предсказано на основе геномной информации, в то время как другая популяция транскриптов лишена экзонов 2 и 3. С помощью smFISH мы подтвердили, что транскрипты NRF2 с пропуском экзонов в основном определяют фенотипический ответ, и потеря этих экзонов приводит к функциональным последствиям (рис. 6). Отсутствие экзонов два и три приводит к потере функциональных доменов Neh2 и Neh4, соответственно. Потеря домена Neh2, вероятно, не наносит ущерба клетке, поскольку Neh2 кодирует домен связывания белка KEAP1, а в клетках A549 эта функция неактивна из-за мутации в первом повторе Келча KEAP1. Таким образом, именно потеря домена Neh4, вероятно, приводит к повышенному фенотипу химиочувствительности клетки, поскольку он участвует в трансактивации и транскрипции нижележащих генов-мишеней NRF2 [38, 39].

Точность мутагенеза на месте [33, 37], приводящего к созданию измененных транскриптов, удивительна. Например, потеря двух нуклеотидов в середине пятого ESE в экзоне 2 (клон 1-17) нарушает ESE и влияет на функциональность, тогда как делеция одной пары оснований в клоне 2-16 предшествует четвертому ESE экзона 2, оставляет функцию ESE нетронутой. Нарушение сайтов ESE и окружающих оснований приводит к пропуску экзона 2 в обоих клонах. Мы обобщили, как тонкие изменения могут привести к развитию измененных транскриптов на Дополнительном рис. 4.

Образование транскриптов, в которых отсутствуют отдельные экзоны, может явно повлиять на эффективность терапии первой линии. Убедительное доказательство этому можно найти в данных, представленных на рис. 5. Здесь мы установили корреляцию между тяжестью нокаута NRF2 и клеточной пролиферацией/токсичностью при воздействии цисплатина на клетки-мишени. Таким образом, разнообразие генетических результатов на уровне ДНК и РНК в целевой популяции опухолевых клеток должно быть понято для обеспечения правильного дозирования терапии первой линии для достижения максимальной эффективности.

Мы не первые, кто сообщает о CRISPR-индуцированном пропуске экзонов. Предыдущие публикации включают анализ активности различных нуклеаз Cas [40, 41], редакторов оснований [42, 43] и экспрессионных систем CRISPR [44]. Некоторые из этих исследований выявляют новые изоформы мРНК, которые приводят к аберрантной функции белка, возникающей в результате CRISPR-индуцированного пропуска экзонов [45-49]. Как отмечают Tuladhar et al. [19], существуют и другие факторы, способствующие сплайсингу, например, структурные изменения РНК. В значительной степени нарушение ESE приводит к усеченным или альтернативно сплайсированным транскриптам, что мы и наблюдаем в наших экспериментах.

Мы предлагаем исследователям провести аналогичный детальный анализ изменений последовательности ДНК, вызванных CRISPR/Cas, чтобы оценить, как небольшие точные изменения, созданные дизайном и исполнением gRNAs, могут иметь драматические последствия для фенотипических результатов. Наши исследования, представленные здесь, демонстрируют важность таких анализов. Например, важно, какие белковые домены удаляются путем пропуска экзонов, поскольку отсутствие определенных белковых доменов может привести к различным ответам на химиотерапию, лучевую терапию или даже иммунотерапию. Мы не хотим сказать, что CRISPR/Cas не является и не будет являться чрезвычайно ценным инструментом для генетической медицины, а скорее призываем внимательно изучить генетические результаты, возникающие в результате действия инновационных биотерапевтических препаратов на ранних этапах клинической разработки.