Аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC) является третьей ведущей причиной смертности от рака в США и седьмой ведущей причиной во всем мире. Ее заболеваемость увеличивается на 0,5-1,0% в год, и считается, что к 2030 году она станет второй основной причиной смерти от рака [1]. Поскольку её ранняя диагностика очень трудна, примерно 80% пациентов имеют локально расположенное или метастатическое заболевание [2]. PDAC часто демонстрирует устойчивость к нескольким терапевтическим методам и более высокий процент рецидивов после хирургического лечения [3]. Адъювантная химиотерапия 5-фторурацилом, лейковорином, иринотеканом и оксалиплатином (FOLFIRINOX), без пилюли фторурацила (модифицированный FOLFIRINOX) приводит к средней общей выживаемости (OS) 54,4 месяца среди пациентов после резекции рака поджелудочной железы [4]. Однако комбинированная химиотерапия, такая как FOLFIRINOX или nab-paclitaxel plus gemcitabine при распространенном раке поджелудочной железы, оказывает минимальное влияние на OS в диапазоне от нескольких недель до нескольких месяцев [5,6]. Кроме того, в ряде клинических испытаний были протестированы специфические для данного пути целенаправленно воздействующие терапевтические средства, такие как ингибиторы фактора роста эндотелия сосудов и мультикиназные ингибиторы, отдельно или в сочетании с обычной химиотерапией при метастатическом раке поджелудочной железы, но они не продемонстрировали клинически значимых преимуществ [7]. Хотя ингибиторы иммунных контрольных точек, такие как цитотоксический белок Т-лимфоцитов 4 (CTLA4) и белок программируемой клеточной гибели 1 (PD-1), показали многообещающие результаты в лечении многих видов рака, эти агенты демонстрируют ограниченную реакцию при лечении пациентов с PDAC, вероятно, из-за множества иммунорегуляторных путей в микроокружении опухоли поджелудочной железы (TME) [8].

В настоящее время механизмы возникновения PDAC относительно хорошо изучены. Большинство PDAC развивается из пред-злокачественных образований, называемых панкреатическими интраэпителиальными неоплазиями (PanINs) которые поэтапно прогрессируют от низкой степени к высокой степени в типах 1, 2 и 3. Впоследствии они переходят в инвазивные поражения с накоплением различных генетических изменений. Приблизительно 90% PDAC всех классов имеют точечные мутации в онкогене KRAS (особенно в кодоне 12). Кроме того, мутационная инактивация генов опухолевых супрессоров, включая ингибитор циклин-зависимой киназы 2A, tumor protein 53 (TP53), and SMAD family member 4 (SMAD4)), часто обнаруживается в поражениях 2 и 3 типа. Эти данные позволяют предположить, что мутации KRAS связаны с инициацией опухоли, а последующие мутации генов являются лимитирующим шагом для прогрессирования опухоли [2,9]. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе метастатического распространения, все еще требуют уточнения. TME PDAC гетерогенна и характеризуется плотной стромой, состоящей из пролиферирующих миофибробластов (панкреатических звездчатых клеток), белков внеклеточного матрикса и опухолевого сосудистого русла, а также воспалительных клеток, включая макрофаги, тучные клетки, плазматические клетки и лимфоциты [10]. Обширная десмопластическая строма и выраженное недостаточное кровоснабжение PDAC затрудняют эффективную доставку терапевтических агентов к клеткам PDAC и ассоциируются с плохим прогнозом и повышенной инвазией опухоли и метастатическим распространением [11]. В настоящее время проводится оценка ряда терапевтических агентов для воздействия на TME или ее изменения, но они показали неудовлетворительные и противоречивые результаты из-за многогранной природы опухолевой стромы. Геномное профилирование сделало возможным применение новых терапевтических средств для небольшой группы пациентов, однако существующие подходы требуют дальнейшего тестирования в более крупных клинических испытаниях [12].

Нанотехнологии привели к значительным достижениям в диагностике и лечении различных злокачественных опухолей. Для успешного лечения PDAC необходима эффективная доставка лекарств в TME а также в опухолевые клетки. Доставка с помощью систем носителей на основе наноматериалов усиливает противоопухолевую активность традиционных химиотерапевтических препаратов, включая гемцитабин, флуороурацил, доксорубицин и паклитаксел. Разработка и применение этих препаратов для лечения рака поджелудочной железы были всесторонне рассмотрены в другом месте [13]. Кроме того, были достигнуты большие успехи в разработке эффективных систем доставки генов для лечения рака. Невирусные системы доставки генов являются высокоэффективными, более безопасными и простыми в синтезе, чем системы доставки с использованием вирусных векторов. Для успешной генотерапии был разработан и исследован целый ряд систем доставки, включая липосомы, полимеры и неорганические наночастицы, с молекулами, нацеленными на рак [14].

В этом обзоре мы представляем терапию на основе РНК-интерференции (RNAi) с использованием нано-медицинских систем доставки, которые в настоящее время исследуются в клинических испытаниях для лечения PDAC. Недавно мы разработали новую терапевтическую стратегию, направленную одновременно на мутации KRAS и TP53 с помощью липосомной доставки CRISPR/Cas9 комплексов рибонуклеопротеинов (РНП) и single-guide RNA (sgRNA) для преодоления лекарственной устойчивости при PDAC, и это лечение значительно усилило противоопухолевую активность гемцитабина (gemcitabine) [15]. Кроме того, рассматриваются современные достижения в применении технологии редактирования генома для исследования PDAC. Наконец, мы представляем наш взгляд на развитие генотерапии с использованием нанотехнологий для будущего клинического применения.

RNAi - это процесс регулирования генов мишеней с помощью двухцепочечных РНК (dsRNAs), которые связываются с последовательностями, комплементарными кодирующей последовательности гена, что приводит к деградации соответствующих мРНК и последующему ингибированию трансляции в белки. Это может быть достигнуто с помощью трех основных различных типов молекул RNAi: малой интерферирующей РНК (siRNA), микроРНК (miRNA) и короткой шпилечной РНК (shRNA). RNAi инициируется опосредованной ферментом Dicer обработкой dsRNAs до меньших фрагментов (~22 нуклеотида) siRNA, которые затем включаются в комплексы РНК-индуцированного замалчивания [16]. Генотерапия с использованием RNAi терапевтических средств является многообещающей и улучшает точную доставку генов для лечения заболеваний человека, включая различные виды рака. Патисиран (Patisiran)- это siRNA, заключенная в липидные NPs, которая ингибирует печеночный синтез транстиретина (TTR) и улучшает некоторые клинические проявления наследственного TTR-опосредованного амилоидоза (HTA) [17]. Он был одобрен в 2018 году в качестве первой терапии на основе RNAi-технологий Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США и Европейским союзом для лечения HTA у взрослых [18]. Однако существует ряд ограничений терапии на основе RNAi, включая легкую деградацию под действием нуклеаз в жидкостях организма, таких как сыворотка, и неэффективную доставку в нужные клетки, ткани и органы. Для преодоления этих проблем были разработаны различные нано-носители, которые являются весьма привлекательными, поскольку они безопаснее и легче синтезируются, чем системы доставки с использованием вирусных векторов. Они делятся на две категории: органические комплексы (липидные комплексы, конъюгированные полимеры и катионные полимеры) и неорганические НП (магнитные НП, квантовые точки, углеродные нанотрубки и золотые НП).

miRNAs имеют длину 18-25 нуклеотидов и являются эндогенными некодирующими молекулами РНК, которые связываются, по крайней мере частично, с комплементарными последовательностями мРНК, впоследствии вызывая расщепление и деградацию мРНК мишени. В отличие от siRNA, miRNA могут регулировать не одну, а несколько мРНК. miRNA играют важную роль в экспрессии генов, вовлеченных в инициацию, рост, прогрессирование, метастазирование, лекарственную устойчивость и терапию рака. Кроме того, miRNAs , секретируемые экзосомами раковых клеток, регулируют процессы межклеточной коммуникации в ТМЕ [19]. В PDAC некоторые miRNAs аберрантно экспрессируются и регулируют инициацию, прогрессию и инвазию рака.

miR-21 функционирует как онкоген и играет важную роль в пролиферации, дифференцировке и выживании раковых клеток в дополнение к инициации и прогрессировании рака, что позволяет предположить, что она может быть перспективной терапевтической мишенью при PDAC [20]. miR-21, miR-196a, miR-196b и let-7i экспрессируются на высоком уровне и обычно связаны с низкой выживаемостью у пациентов с PDAC [21,22]. Исследователи разработали анти-miR-21 олигонуклеотидом нагруженные проникающие в опухоль комплексы, состоящие из С-концевого проникающего в клетку пептида iRGD и N-концевой группы жирных кислот для усиления гидрофобных взаимодействий при самосборке NPs (TPN-21). TPN-21 ингибирует экспрессию miR-21 и рост PDAC в PDO, а также повышает уровень фосфатазы и гомолога тензина и фактора programmed cell death 4, что приводит к сильному подавлению роста опухоли. Li и др. разработали полиэтиленгликоль-полиэтиленимин-магнитные NPs на основе оксида железа, конъюгированные с одноцепочечными вариабельными фрагментами анти-CD44v6 для совместной доставки анти-смысловых олигонуклеотидов miR-21 и гемцитабина в клетки PDAC [23]. Эти NPs вызывают апоптоз и подавляют рост и метастазирование опухоли in vitro и in vivo, что свидетельствует о синергетическом противоопухолевом эффекте замалчивании гена miR-21 и химиотерапии в PDAC.

Xie et al. разработали систему локальной доставки, сочетающую подавление miR-210, KRAS^G12D и блокаду с C-X-C мотивом хемокинового рецептора 4 (CXCR4) с помощью cholesterol- modified polymeric CXCR4 antagonist (PCX) NPs для совместной доставки анти-miR-210 и siKRAS^G12D [24]. Холестерин конъюгируется для повышения эффективности enhanced permeability and retention (EPR)-независимой доставки. PCX NPs блокируют взаимодействие рак - строма, т.к. анти-miR-210 инактивирует строма-продуцирующие панкреатические звездчатые клетки, а siKRAS^G12D убивает клетки рака поджелудочной железы. В данном исследовании NPs были доставлены путем внутрибрюшинного введения в ортотопическую модель мыши PDAC в качестве эффективного EPR)-независимого подхода для воздействия на опухоли брюшины. Накопление NPs в опухоли при локальной доставке через IP было почти в 15 раз выше по сравнению с внутривенной доставкой (IV).

Wu и др. обнаружили, что miR-9 положительно связан с чувствительностью к доксорубицину (DOX), и разработали супрамолекулярные NPs, cконденсированные с химерным пептидом плектина-1 (PL-1) на основе аргинина для связывания РНК и воздействия на PDAC. PL-1/miR-9 NPs значительно усилили эффективность DOX в клетках PDAC и рост опухоли из PDX, что позволяет предположить, что miR-9/eIF5A2 может быть новым потенциальным препаратом для синергетической терапии PDAC [25].

miRNA-150 является опухолевым супрессором, который снижен в большинстве тканей рака поджелудочной железы человека, что позволяет предположить, что восстановление miR-150 может быть терапевтической стратегией для лечения рака поджелудочной железы [26]. Arora и др. разработали нано-препарат на основе поли(D,L-лактид-со-гликолида) (PLGA) для доставки miR-150 в клетки рака поджелудочной железы, и лечение им привело к снижению роста, клоногенности, подвижности и инвазии посредством значительного снижения регуляции гена мишени муцина 4 in vitro [27].

Хотя несколько доклинических исследований продемонстрировали эффективность генотерапии на основе miRNAs для лечения PDAC, многие попытки разработки miRNAs -терапевтических препаратов не увенчались успехом в клинических испытаниях [28]. Кроме того, до настоящего времени клинические испытания терапевтических препаратов на основе miRNAs для лечения PDAC не проводились.

siRNA - это короткая некодирующая ds-РНК из 21-23 нуклеотидов, которая после введения в клетки млекопитающих может индуцировать обусловленное RNAi молчание, не вызывая появление неспецифического интерферона. Она способна заставить замолчать гены, кодирующие белки, которые не могут контролироваться малыми молекулами и программируемыми препаратами [29]. Невирусные системы доставки с использованием NPs улучшают накопление в опухолевых клетках посредством EPR в результате действия нескольких факторов, включая ускользание от иммунной системы, улучшенное попадание в опухоль и поглощение клетками, а также длительное время присутствия в кровообращении [30]. За последние два десятилетия был разработан ряд терапевтических препаратов siRNA на основе NPs, которые в настоящее время исследуются в клинических испытаниях [31]. В этом разделе описаны последние достижения в области RNAi-терапии с использованием siRNA с акцентом на siRNA, которые в настоящее время проходят клинические испытания (табл. 1).



Таблица 1. Терапевтические препараты на основе siRNA на нано-носителях в клинических испытаниях для лечения рака поджелудочной железы.

Примерно 90% пациентов с PDAC имеют мутацию KRAS, которая играет важную роль в возникновении PDAC. Kamerkar и др. разработали экзосомы, полученные из нормальных мезенхимных клеток фибробластов, несущие siRNA или shRNA для подавления KRAS^G12D [37]. IP-инъекция этих разработанных экзосом подавляла рост опухоли и увеличивала выживаемость по сравнению с липосомами благодаря их CD47-опосредованной защите от фагоцитоза макрофагами и моноцитами. В настоящее время проводится исследование I фазы среди пациентов с метастатическим раком поджелудочной железы с мутацией KRAS^G12D (NCT03608631). Glutathione-S-transferase (GSTP) - это фермент II фазы детоксикации, связанный с поддержанием целостности клеток, окислительным стрессом и защитой от повреждения ДНК. Он является регулятором белков, участвующих в сигнальных путях RAS, и высоко экспрессируется при нескольких типах рака с мутацией KRAS, включая рак легких, колоректальный рак и рак поджелудочной железы [39]. NBF-006, лиофилизированные липидные NPs, состоят из ионизируемого, неиммуногенного, биоразлагаемого липида, обволакивающего GSTP siRNA. Лечение препаратом NBF-006 значительно подавляет рост опухоли в моделях ксенотрансплантатов немелкоклеточного рака легких (NSCLC) с мутацией KRAS и увеличивает выживаемость мышей с хирургически имплантированной ортотопической опухолью легких без токсичности [38]. Недавно препарат вступил в I фазу испытаний для ранее леченного NSCLC с мутацией KRAS и ранее леченного прогрессирующего или метастатического NSCLC, рака поджелудочной железы и колоректального рака (NCT03819387).

Khvalevsky et al. разработали первую локальную пролонгированную систему доставки siRNA (названную Local Drug EluteR, или LODER), которая представляет собой миниатюрную биоразлагаемую полимерную матрицу, высвобождающую siRNA в течение нескольких месяцев после введения в опухоли [40]. Лечение инкапсулированной в LODER анти-KRAS^G12D siRNA (siG12D LODER) подавляет пролиферацию раковых клеток и эпителиально-мезенхимный переход со значительным снижением уровня KRAS, а также подавляет рост ортотопической опухоли поджелудочной железы и продлевает выживаемость мышей in vivo. В клиническом исследовании фазы 1/2a, включавшем 15 пациентов с неоперабельной PDAC, лечение стандартной химиотерапией после введения siG12D LODER в опухоль с помощью иглы во время процедуры эндоскопической ультразвуковой биопсии привело к стабилизации болезни у 10 пациентов и частичному ответу у 2 пациентов с благоприятными данными по безопасности (NCT01188785) [35]. В текущем исследовании, которое началось в 2017 году, 80 пациентов с неоперабельным или погранично операбельным локально распространенным раком поджелудочной железы были назначены для получения повторных доз 2,8 мг siG12D LODER с химиотерапией (гемцитабин и паклитаксел nab или FOLFIRINOX) или только химиотерапии (NCT01676259).

Ribonuclease reductase M2 subunit (RPM2) коррелирует с биологическим поведением опухолевых клеток, включая пролиферацию, инвазию, миграцию, клеточный цикл и апоптоз, и играет важную роль в опухолевом генезе при нескольких типах рака [41]. CALLA-01, система целевых NPs, состоит из циклодекстрин-содержащего полимера, полиэтиленгликоля (ПЭГ), человеческого трансферрина в качестве целенаправленно действующего лиганда для связывания рецепторов трансферрина и siRNA, предназначенной для снижения экспрессии RPM2 с целью ингибирования опухоли и/или уменьшения ее размеров. В 2008 году компания начала первое испытание I фазы на людях с системным введением siRNA пациентам с солидным раком, включая PDAC (NCT00689065). Эти NPs были успешно доставлены в раковые клетки, и это было подтверждено наличием раковых клеток, содержащих наночастицы, в биоптатах опухолей у пациентов с меланомой после системного введения. Кроме того, экспрессия мРНК и белка RPM2 снижается у пациентов, получающих самые высокие дозы, что позволяет предположить, что специфическое ингибирование генов с помощью RNAi может быть одним из методов лечения рака [42]. В испытании фазы Ia/Ib CALLA-01 продемонстрировал сходный профиль безопасности у 24 пациентов с различными видами рака по сравнению с животными [32].

Atu027 - это терапевтическая формула RNAi на основе катионных липидов. Она содержит нейтральные фузогенные, PEG-модифицированные липидные компоненты и молекулы siRNA, которые специфически нацелены на протеинкиназу N3 в эндотелии сосудов, эффектор нижележащего звена сигнального пути фосфоинозитол-3-киназы [43]. Atu027 ингибирует рост опухоли и метастазирование в лимфатические узлы в ортотопических мышиных моделях рака простаты и поджелудочной железы, а также гематогенное метастазирование в мышиных моделях спонтанного рака легких [43,44]. В первом клиническом испытании I фазы этого соединения на человеке (NCT01808638) 24 пациентам с распространенными солидными опухолями были введены 10 всё увеличивающихся доз Atu027 в виде однократного внутривенного введения, а затем дважды в неделю в течение 28-дневного цикла. Лечение было безопасным и привело к стабилизации опухоли у 41% пациентов. Кроме того, у большинства пациентов был снижен растворимый вариант рецептора-1 фактора роста эндотелия сосудов, что говорит о его потенциале в качестве биомаркера [33]. В исследовании II фазы 23 пациента с метастатическим раком поджелудочной железы получали комбинированное лечение гемцитабином и Atu027 (NCT01808638). Лечение было безопасным и введение дважды в неделю Atu027 приводило к значительному улучшению выживаемости без прогрессирования [34].

Polo-like kinase 1 (PLK1), важный белок клеточного цикла, играет многочисленные роли в митозе и цитокинезе. Она избыточно экспрессируется при различных видах рака и негативно влияет на исход заболевания. Кроме того, ингибирование экспрессии PLK1 вызывает остановку митоза и апоптоз, что приводит к подавлению роста опухоли [45]. Стабильные липидные частицы нуклеиновых кислот (SNALPs) являются эффективной системой доставки siRNA и не нуждаются в активных целенаправленно воздействующих соединениях благодаря пассивному нацеливанию на место заболевания. В доклинической модели опухоли печени SNALP-содержащая смесь PLK1 siRNA (TKM-080301) продемонстрировала мощную противоопухолевую активность и не вызвала заметной иммунной реакции, что свело к минимуму возможные неспецифические эффекты [36]. Клиническое исследование I фазы TKM-080301 было проведено среди пациентов с печеночными метастазами колоректального рака, рака поджелудочной железы, желудка, молочной железы и яичников, но оно было прекращено без сообщения о результатах (NCT01437007).

Уникальная ТМО PDAC затрудняет доставку терапевтических агентов к опухолевым клеткам и вызывает необходимость разработки новой терапии. Хотя роль индуцирующего гипоксию фактора 1 (HIF1, включая HIF1α и HIF1β) в механизмах развития PDAC до конца не изучена, стабилизация HIF1α в гипоксической ТМЕ связана с транскрипционной активацией многочисленных сигнальных путей, участвующих в регуляции выживания клеток, инвазии опухоли, ангиогенеза и метаболизма [46]. Zhao и др. разработали липидно-полимерные гибридные NPs (LENPs), которые состоят из однослойной или бислойной липидной оболочки вокруг полимерного ядра из катионного сополимера ε-полилизина (ENPs) [47]. Отрицательно заряженный si-HIF1 поглощается на поверхности ENPs, а гемцитабин инкапсулируется в гидрофильное ядро. LENPs защищают NPs от агрегации, имеют длительное время жизни с периодом полураспада более 3 ч и улучшают высвобождение лекарственного средства за счет усиления эффекта формирования сосудистого русла в опухолевых тканях. Лечение LENP-Gem-si-HIF1α приводит к эффективному глушению HIF1α как in vitro, так и in vivo, а также к значительному синергическому ингибированию роста опухоли. Другой основной транскрипционный фактор, связанный с гипоксией, HIF2α (также называемый эндотелиальным PAS доменным белком 1 [EPAS1]) при раке поджелудочной железы, был направлен на NPs с siRNA, загруженной в полиэтиленимин-поли(лактид-когликолид) (PLGA)/полоксамер [48]. Лечение подавляло пролиферацию клеток PDAC путем индукции апоптоза в гипоксических условиях in vitro, а также значительно подавляло образование микрососудов и рост опухоли у ортотопических мышей с PDAC.

Цитоскелет, включающий микротрубочки, состоит из гетеродимеров α- и β-тубулина. Повышенная экспрессия βIII-тубулина связана с плохой OS и лекарственной устойчивостью к различным типам рака, включая рак поджелудочной железы, а подавление βIII-тубулина с помощью shRNA приводит к ингибированию роста опухоли и повышению чувствительности к химиотерапии in vitro и in vivo, что предполагает возможность создания новой терапевтической мишени для PDAC [49]. Ограничения использования высоко-заряженных катионных NPs в качестве системы доставки siRNA включают их токсичность и возможность взаимодействия с сывороточными белками в кровотоке. Чтобы преодолеть эту проблему, Teo и др. разработали звездчатые полимеры с различной длиной боковых частей катионного поли(диметиламиноэтилметакрилата) и различным количеством поли(олиго(этиленгликоль) метилового эфира метакрилата), которые хорошо накапливались в ортотопических опухолях PDAC у мышей и обнаруживали эффективность замалчивания в 80% на генном и белковом уровнях [50].

CRISPR функционирует как иммунная система у E. coli [51,52]. Недавно системы CRISPR были разработаны как инструменты генотерапии и показали хорошую специфичность к генам мишеням, высокую эффективность редактирования и простоту исследования по сравнению с нуклеазой цинковых пальцев и нуклеазой транскрипционного активатор-подобного эффектора [53,54]. CRISPR/Cas9 - это РНК-направляемая эндонуклеаза, состоящая из белка Cas9 и сгРНК со специфичностью к последовательности мишени для расщепления ДНК. Повреждения ДНК, индуцированные Cas9, восстанавливаются с помощью негомологичного соединения концов ДНК или гомологично-направленного пути репарации (HDR), которые являются клеточными механизмами репарации ДНК [55,56]. На основе этой системы были разработаны варианты CRISPR. Система редактирования оснований (редактор цистеиновых и адениновых оснований) состоит из одноцепочечной ДНК-никазы и деаминазы, которая может применяться для лечения заболеваний, связанных с точечной мутацией [57,58,59]. Cas13 (ранее называвшийся C2C2) редактирует РНК и снижает риск повреждения ДНК из-за внецелевого воздействия [60,61]. В процессе прайм-редактирования участвуют ДНК-никаза и фермент обратной транскриптазы, который генерирует новую ДНК путем дублирования внешней матрицы РНК [57,62]. Это может привести к образованию indels (инсерций, делеций) и преобразований оснований без двухцепочечных разрывов ДНК или матрицы донорской ДНК. Однако для лечения рака необходима соответствующая система доставки. Вирусные векторы (ретровирус, аденовирус, адено-ассоциированный вирусный вектор) популярны в области генотерапии [63,64,65], но их клиническое применение ограничено рядом факторов, таких как повышенный адаптивный иммунный ответ от нейтрализующих антител капсидов адено-ассоциированного вируса, потенциальная иммуногенность и мутации генов в результате их хромосомной инсерции [66-70]. Поэтому идеальное средство должно обладать целевой специфичностью, минимизировать эффективность вне мишени и сохранять неиммуногенность.

Системы CRISPR могут быть применены в генотерапии PDAC с использованием трех типов нано-носителей: плазмидной ДНК (плазмида Cas9/sgRNA), транскрибированной in vitro мРНК Cas9/sgRNA и предварительно собранного комплекса рибонуклеопротеина (RNP) (рис. 1). В целом, для успешной доставки трех форм требуются катионные покрытия для их полной конденсации [71]. Отрицательно заряженные плазмидные ДНК, мРНК и РНП покрываются катионными молекулами для образования комплексов со структурной стабильностью. Комплексы связываются с клеточными мембранами посредством электростатических взаимодействий и попадают в клетки путем эндоцитоза. Обычно катионные полимеры на основе липидов (полиэтиленимин, PEI) и пептидов (протамин) образуют положительно заряженные частицы, которые повышают эффективность доставки и стабильность in vivo. NPs на основе катионных липидов обладают дополнительными свойствами, такими как нацеливание на опухоли, совместное инкапсулирование химиотерапевтических агентов и другими [72-75]. PEI и протамин также являются наиболее часто используемыми катионными молекулами in vitro и in vivo. Они в основном состоят из аминных групп высокой плотности, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами или РНК. Они повышают эффективность внутриклеточной доставки и выхода из эндосом при более низком рН за счет эффекта протонной губки [76,77]. Кроме того, неорганические материалы, такие как золотые (Au) NPs, являются привлекательными для доставки РНК и донорской ДНК в клетки для восстановления HDR. Au NPs легко модифицируются тиол-терминированной одноцепочечной ДНК и связывают РНК посредством неспецифических электростатических сил [78,79].



Figure 1. The cell delivery pathway of CRISPR/Cas9 encapsulated-nanoparticles. The CRISPR systems can be applied for gene therapy with non-viral carriers in three forms that include: plasmid DNA (Cas9/sgRNA plasmid), in vitro transcribed Cas9 mRNA/sgRNA, and pre-assembled ribonucleoprotein (RNP) complex. Such nanoparticles can take several forms, including PEGylated- or cationic lipid-NPs (liposome), cell-mediated exosome, cationic polymers (polyethyleneimine, PEI; protamine, PA), and cationic lipid- or polymer-coated gold NPs. The plasmid DNA, mRNA and RNP of NPs may enter the cell via endocytosis and endosome escape, processing the RNP expression and gene editing.

Хотя вирусные векторы, такие как аденовирусы и лентивирусы, являются эффективными системами доставки ДНК CRISPR, их иммуногенность делает их потенциальными канцерогенами, и они имеют значительный молекулярный вес [80]. Кроме того, доставка мРНК и белков CRISPR/Cas9 остается сложной задачей из-за проблем, связанных со стабильностью, эффективностью инкапсуляции и высокой стоимостью их производства. Доставка CRISPR/Cas9 плазмидами используется из-за низкой стоимости, стабильности при хранении и возможности длительной экспрессии. Однако при доставке плазмид существует риск геномной интеграции, клеточного стресса и внецелевых эффектов из-за длительной экспрессии трансгена [81,82].

Кодируемая плазмидной ДНК нуклеаза Cas9 и sgRNA-инкапсулированные в NPs на основе липидов были успешно изучены in vivo для лечения PDAC. Li и др. сообщили о системе доставки плазмиды CRISPR/Cas9 на основе липидов, направленной на опухоль, разработанной для подавления HIF-1α (Рисунок 2a) [71]. Они синтезировали пептид R8-dGR (Cys-RRRRRRRRRRRRRdGR), связанный с интегрином αvβ3 и neuropilin-1 в избыточно экспрессирующих опухолевых клетках, и он усиливал in vivo нацеливание на рак поджелудочной железы. Пептид был использован для снижения плотности заряда катионной липосомы на основе DOTAP. Кроме того, этот проникающий в клетки пептид повышал интернализацию клеток и эффективность трансфекции (Рисунок 2b). Избыточная экспрессия HIF-1α в опухолях связана с аберрантным p53 и повышает уровень ангиогенеза и сигналов, связанных с метастазированием, таких как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и матричная металлопротеиназа 9 (MMP9) [83,84]. Поэтому комплекс Cas9-HIF-1α плазмидной ДНК/протамин и липосома с паклитакселом (PTX) для усиления анти-метастатического эффекта могли подавлять рост опухоли in vivo (Рисунок 2c,d). Соответственно, R8-dGR-Lip/pHIF-1α и PTX снижали уровень HIF-1α и его молекул VEGF и MMP-9, что приводило к подавлению метастазирования в печень и легкие (рис. 2e,f).



Figure 2. R8-dGR peptide modified and loaded CRISPR/Cas9-HIF-1? and paclitaxel cationic liposome for targeted pancreatic treatment. (a) Scheme of the structure of the R8-dGR-Lip/pHIF-1? and paclitaxel (PTX) delivery in pancreatic cancer cells. (b) Cellular internalization of with or without the R8-dGR peptide (Cys-RRRRRRRRdGR) on BxPC-3 cells. scale bar: 100 ?m. (c) Tumor volume of BxPC-3 xenograft models treated with different formulations (mean ± SD, n = 10, * p < 0.05). (d) In vivo downregulation of HIF-1? by pHIF-1α in tumor tissues. (e,f) MMP9 expression in liver (e) and lung (f) of mice. Scale bar: 100 µ:m (adapted from Ref. [71]).

Экзосомы естественным образом высвобождаются в наноразмерные внеклеточные везикулы из всех клеток и содержат ДНК, РНК, метаболиты, белки клеточной поверхности и липиды в зависимости от происхождения клетки [85]. В отличие от синтетических нано-носителей, экзосомы, происходящие из клеток, обладают такими преимуществами, как биосовместимость, неиммуногенность и нецитотоксичность [86]. Кроме того, они содержатся в различных плазматических мембранах и обладают повышенной полужизнью [87]. Поэтому они подходят в качестве переносчиков внутреннего груза в клетки-реципиенты. Недавно McAndrews и др. сообщили, что экзосомы могут быть успешно сконструированы для инкапсуляции плазмидной ДНК CRISPR/Cas9 и доставки ее в опухолевые клетки. Экзосомы были получены из МСК, полученных из костного мозга, и не показали токсичности от повторной дозы [86]. Они подавляли мутантный онкоген KRAS^G12D, что привело к подавлению роста опухоли в сингенной модели аллотрансплантации и ортотропной модели (рис. 3) [88].



Figure 3. . Exosome mediated treatme nt of CRISPR/Cas9 in as allograft and orthotropic model of pancreatic cancer. (a,b) Tumor volume (a) and tumor weight (b) after exosomes-Cas9/KRASG12D sgRNA intravenously administration in allograft models (KPC689 cells) every other day for 2 weeks (n = 8 mice in each group). (c) Cas9 mRNA expression levels in tumor tissues by quantitative PCR (normalized to 18S, n = 5 mice per group). (d) Tumor growth by bioluminescent imaging after exsomes-Cas9/KRASG12D sgRNA Intraperitoneal injection in orthotopic models (KPC689-GFP-Luciferase cells) every other day for 3 weeks. (e) KRASG12D mRNA expression levels at the end point in orthotropic tumor tissues (mean ± SD, * p < 0.05, ** p < 0.01) (adapted from Ref. [88]).

Доставка мРНК CRISPR/Cas9 имеет преимущества перед плазмидной ДНК. mRNA не интегрируется в геном мишени, что предотвращает нецелевые эффекты [65,89,90]. Кроме того, мРНК приводит к быстрой и скоротечной экспрессии белка Cas9 в цитоплазме. Однако мРНК имеют большой размер, нестабильны и подвержены деградации во время доставки [91].

CRISPR/Cas9 RNP не нужно переводить в клетки. Он непосредственно переносится в ядро и редактирует ген мишень. Кроме того, он обладает низкой токсичностью, высокой эффективностью редактирования генов, низкими нецелевыми эффектами вне мишени и отсутствием возможности интеграции в геном клеток-реципиентов [65,89,92,93]. Белок Cas9 и sgRNA можно просто смешать ex vivo для доставки в клетки. Комплекс белок Cas9/sgRNA заряжен отрицательно. Комплекс может быть положительно заряжен путем модификации для облегчения сродства к клеточной мембране и интернализации [92,94-97]. Кроме того, биоредуцируемые дисульфидные связи нано-носителей могут быть изменены для улучшения деградации и выхода из эндосом [98]. Кроме того, белок Cas9 может быть модифицирован для повышения эффективности инкапсуляции NPs [99,100].

Zhao и др. исследовали эффекторный белок CRISPR-Cas13a, доставленный в клетки рака поджелудочной железы с помощью lipofectamine CRISPRMAX, и обнаружили, что комплекс Cas13a-sgRNA связывается с целевой РНК и расщепляет ее, а также создали модель ксенотрансплантата путем внутри-опухолевой инъекции (рис. 4a) [101]. Система CRISPR-Cas13a снижает экспрессию мРНК в клетках млекопитающих и демонстрирует повышенную эффективность и специфичность по сравнению с РНК-интерференцией [60,61]. Система снижает экспрессию мРНК KRAS^G12D с эффективностью нокдауна до 70% (Рисунок 4b-d), что приводит к апоптозу и ингибированию роста опухоли (Рисунок 4e,f) [101].



Figure 4. CRISPR/Cas13a-lipofectamine CRISPRMAX delivery for KRAS mutated pancreatic cancer treatment. (a) The scheme of Cas13 system differentiates wild type (WT, normal cells) and mutated KRAS genes (cancer cells). (b) crRNA sequences of the crRNA19-target sequence in KRAS-G12D and KRAS WT. (c) qRT-PCR analysis of KRAS-G12D mRNA expression after crRNA19-14 delivery into KRAS-G12D mutated cells. (d) qRT-PCR analysis of KRAS-WT mRNA expression after crRNA19-14 delivery into KRAS-WT cells. (e) The tumor volumes of subcutaneous AsPC-1 xenograft after administration with repeated intratumoral injections of the Cas13a-lipofectamine for 21 days. (f) Staining for apoptotic cells in tumor tissues (green fluorescence). Scale bar: 50 µ:m. (mean ± SD, * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001) (adapted from Ref. [101]).

Недавно наша группа разработала нацеленную на опухоль нано-липосому (NL[Cas9/ABE]-Ab), которая одновременно инкапсулирует белки CRISPR/Cas9 и аденинового основания редактор (ABE) для двойного редактирования генов (рис. 5) [15]. Белки Cas9 и ABE модифицированы белком his-tag для повышения эффективности NL-инкапсуляции. Кроме того, мы использовали PEG--связанный липид для стабильности структуры и усиления рецептор-опосредованного эндоцитоза. Гемцитабин используется в качестве химиотерапии первой линии при PDAC, но его применение ограничено тем, что у большинства пациентов с PDAC развивается устойчивость к нему [102]. Мутация KRAS и потеря P53 вызывают стабилизацию HIF-1, который является главным регулятором метаболизма глюкозы и основным фактором химио-резистентности к гемцитабину при PDAC [103,104]. Совместное назначение NL(Cas9/ABE)-Ab и гемцитабина заметно подавляет пролиферацию опухоли в ксенотрансплантате PANC1 (Рисунок 5c). NL(Cas9/ABE)-Ab подавляет мутации KRAS и TP53 и регулирует HIF-1α-связанный гликолиз, что способствует повышению чувствительности к гемцитабину in vivo (Рисунок 5d-f). Таким образом, инструмент двойного редактирования мутантных генов KRAS и TP53 может преодолеть лекарственную устойчивость в PDAC [15].



Figure 5. Dual-gene editing nanoliposome system as an overcoming drug-resistance for PDAC. (a) Graphical summary of NL(Cas9/ABE)-Ab composition. (b) Dynamic distributions of tumor targeting efficiency by NL with or without Ab in vivo. Mice were injected intraperitoneally once with NL-Ab labeled with RITC. PANC1 xenograft tumor was marked as white circles. (c) The scheme of PANC1 xenografts co-administrated with NL(Cas9/ABE)-Ab and gemcitabine. The NL(Cas9/ABE)-Ab was injected intraperitoneally once (red arrow) and then gemcitabine (50 mg/kg) was administered twice a week for 4 weeks. Mean ± SEM, n = 3 per group, * p < 0.05, *** p < 0.001. (d) Immunofluorescence with mutant P53 and KRAS on the tumor sections. Scale bar: 50 µm. (e) Immunostaining with HIF1α-related glucose metabolism and gemcitabine transporter (GLUT1, TKT, CTPS and ENT1) on the tumor. Scale bar: 50 µm. (f) Immunostaining with apoptotic cells (TUNEL assay and Ki67) by NL(Cas9/ABE)-Ab and gemcitabine on the tumor. Scale bar: 100 µm (adapted from Ref. [15]).

Предпосылками для успешной генной терапии являются быстрый, простой и легкий синтез, безопасность и эффективная доставка. Генная терапия с использованием RNAi-терапии и редактирования генома CRISPR является многообещающей и может улучшить точную доставку генов в опухолевую ткань. Несмотря на значительные успехи в разработке генной терапии для лечения PDAC, еще есть много возможностей для улучшения фармакокинетики, фармакодинамики и методов повышения безопасности. Терапия на основе RNAi имеет ряд препятствий (например, необходимо улучшить системную циркуляцию и адресную доставку, минимизировать внецелевые эффекты и т.д.), поэтому необходимо продолжать разработку безопасных, биосовместимых и биоразлагаемых терапевтических средств на основе NPs для клинического применения. EPR носители на основе наночастиц облегчает их накопление в опухолевых клетках. Однако внеклеточные и внутриклеточные барьеры в PDAC являются препятствиями, которые необходимо преодолеть. Наночастицы с соответствующим размером частиц, их химические модификации и функционализация таргетными лигандами необходимы для повышения поглощения в опухолевых клетках и решения других биологических проблем, таких как внутриклеточный трафик и внутриклеточный выход siRNA [105]. Кроме того, комбинированное лечение химиотерапией и терапией на основе RNAi или стратегия, сочетающая молекулы RNAi и противораковые препараты, поможет преодолеть лекарственную устойчивость и барьеры TME.

Редактирование генома CRISPR/Cas9 широко используется не только в разработке моделей рака и в качестве инструмента для идентификации и валидации терапевтических мишеней, но и как потенциальная терапия рака [106]. Область иммунотерапии рака является наиболее продвинутым клиническим применением. В первом испытании I фазы из Китая, включавшем 22 пациента с NSLC, использовались CRISPR-Cas9 PD-1-редактированные Т-клетки из крови пациентов, лечение было безопасным и показало определенную терапевтическую эффективность (NCT02793856) [107]. В настоящее время проводится несколько клинических испытаний, чтобы продемонстрировать эффективность более мощных химерных антигенных рецепторных Т-клеток с использованием CRISPR для выключения иммунных коингибиторных путей или сигнальных молекул [108]. Однако, прежде чем редактирование генома CRISPR/Cas9 можно будет использовать в клинической практике, необходимо преодолеть несколько препятствий, включая потенциальные внецелевые эффекты и вопросы безопасности. Для эффективной доставки, точного нацеливания на нужные клетки, эффективного редактирования генов, а также для минимизации внецелевых эффектов и иммунных реакций необходим новый терапевтический подход. Хотя несколько клинических испытаний генной терапии не увенчались успехом, прогресс в понимании ТМО PDAC и генной терапии на основе нано-медицины может позволить улучшить клинические исходы у пациентов с PDAC.