Недавние технологические и концептуальные достижения привели к появлению множества новых интересных вариантов аденоассоциированных вирусных векторов (AAV). Все они обладают уникальными характеристиками и возможностями. В данном обзоре обобщены данные разработки и их потенциал в лечении болезни Паркинсона (PD). Клинические испытания PD показали за последнее десятилетие, что AAV является безопасным и подходящим вектором для генотерапии, но это также средство, которое может значительно выиграть от улучшения специфичности и потенции.

Технология вирусных векторов для лечения болезни Паркинсона (PD) за последние два десятилетия претерпела три значительных поколения усовершенствований. То, что вначале было переносом генов ex vivo с помощью ретровирусных векторов, затем переросло в доказательную экспрессию генов in vivo с помощью аденовирусных, вирусов простого герпеса (HSV) или лентивирусных векторов [1]. Один лентивирусный вектор даже дошел до клинических испытаний по замене ферментов при PD [2]. Однако значительный прорыв произошел с применением адено-ассоциированных вирусных (AAV) векторов для генотерапии в ЦНС [3]. Вирус AAV обладает несколькими уникальными свойствами, благодаря которым он практически сразу стал предпочтительным вектором для клинической генотерапии в неделящихся клетках. Будучи зависимым вирусом (т.е. требующим для репликации ко-инфекции аденовирусом или HSV), он уже передал сложный компонент процесса репликации другим вирусам [4]. Эти механизмы, к счастью, можно было заменить переходной трансфекцией плазмид в производственной клеточной линии. Такой подход оставил необходимость экспрессии только двух основных генов (и двух минорных генов, экспрессируемых из той же генетической последовательности) из генома AAV. Они необходимы для репликации и упаковки вирусного генома (ген репликации Rep) и синтеза вирусного капсида (ген Cap).

Как и гены-помощники, полученные из аденовируса, гены Rep и Cap могут быть извлечены из генома AAV и помещены в третью плазмиду во время производства. В результате системы транзиторной трансфекции получается репликационно-дефицитный, "распотрошенный" вектор AAV, в геноме которого остаются только инвертированные терминальные повторы (ITR) [4]. Более полное представление о биологии AAV и жизненном цикле AAV см. в Vance et al. (2015) [5].

Пространство, образовавшееся после удаления генов Rep и Cap (между ITR), заполняется выбранным терапевтическим геном, включая промотор и необходимые регуляторные последовательности для стабильности мРНК. На сегодняшний день векторы AAV были использованы в 241 клиническом испытании (запланированных, текущих и проведенных, clinicaltrials.gov), включая испытания PD (15 испытаний), и более 10 000 пациентов получили вектор (более 400 в PD). На сегодняшний день только три препарата на основе AAV получили одобрение, два в США и Европе, а третий - только в Европе. Несмотря на обнадеживающие результаты, прогресс не был однозначным, и многие методы лечения потерпели неудачу или зашли в тупик на разных стадиях доклинических [6] и клинических испытаний [7, 8]. Тем не менее, до сих пор проводятся клинические испытания AAV-опосредованного про-лекарства AADC как при PD [9], так и у детей с недостаточностью AADC (NCT02852213) и нейропротекции GDNF при PD и множественной системной атрофии (NCT01621581 и NCT04680065 на сайте clinicaltrials.gov).

Хотя капсид и геном AAV остаются одними из самых низкоиммуногенных векторов генотерапии, разработанных на сегодняшний день, они не лишены риска осложнений [10]. У большинства пациентов имеются нейтрализующие антитела против одного или другого серотипа AAV. Общая серопозитивность по AAV имеет два существенных последствия [10]. Первым следствием является то, что не все пациенты одинаково подходят для конкретной терапии на основе AAV, и значительную часть пациентов, возможно, придется исключить. Второе последствие заключается в том, что это показывает, что наша иммунная система реагирует на AAV-инфекцию и может выработать сильный иммунитет против капсида AAV [11]. Таким образом, нам необходимо тщательно следить за иммунными реакциями и не ожидать, что терапевтический вектор может быть повторно введен тому же пациенту без изменений. Циркулирующие анти-AAV антитела не были широко представлены в клинических испытаниях с использованием AAV для лечения PD, но некоторые данные были представлены в контексте I фазы испытания GAD на основе AAV2 (NCT00195143) [8]. В этом испытании у семи из двенадцати пациентов были выявлены обнаруживаемые уровни анти-AAV антител, а у двух пациентов - очень высокие уровни. Это не оказало негативного влияния на профиль безопасности терапии, но пока неизвестно, повлияло ли это на эффективность трансдукции. Доклиническое исследование предполагает, что циркулирующие анти-AAV антитела могут быть не единственным фактором, препятствующим трансдукции в мозг [12].

К счастью, генная инженерия предоставляет новые возможности для решения этих проблем и способна произвести революцию в области генной терапии, не в последнюю очередь в PD [13].

Генная инженерия, экономичный и точный мультиплексный синтез генов [14], глубокое секвенирование и технологии быстрого производства [15] открыли совершенно новые возможности для инженерии AAV. За один раунд скрининга in vivo мы можем провести эксперименты, для которых раньше требовались годы направленной эволюции и итеративных улучшений [16].

Благодаря новому поколению эволюции AAV, участки поверхности капсида, отвечающие за клеточную адгезию и инфекционность, могут быть точно адаптированы в отношении клеточной специфичности или новых функциональных свойств (Таблица 1). Такими свойствами могут быть трафик через гематоэнцефалический барьер (BBB) [17] или ретроградный транспорт в аксонах [16, 18]. Однако инженерия капсидов не обязательно должна ограничиваться тропизмом или транспортом. Тот же подход может быть использован для систематического изменения каждой аминокислоты во всем капсиде и, таким образом, потенциально позволяет идентифицировать иммуноуничтожающие варианты или варианты капсида с повышенной упаковочной способностью (существенное ограничение для вариантов AAV дикого типа) [14]. Однако увеличение емкости упаковки может сопровождаться изменением эффективности трансдукции и профилей инфекционности, и для ответа на эти вопросы необходима дальнейшая работа.



Table 1

Один из подходов к эволюции AAV привел к созданию варианта AAV PHP.B/eB, который демонстрирует высокоэффективный транспорт через BBB у мышей C57/BL6 [17, 19, 20] (рис. 1). Будучи очень полезным исследовательским инструментом, он не имеет клинического применения при системных инъекциях, поскольку зависит от экспрессии рецептора Ly6A, который не встречается у высших видов (например, крыс и приматов), а также отсутствует у многих других штаммов мышей [21]. Однако недавние публикации с использованием PHP.B/eB показали эффективную трансдукцию в ЦНС у крыс и не-человекообразных приматов (NHP) после интратекальных инъекций [22, 23]. В связи с этим печальным открытием продолжается поиск столь же мощного варианта капсида для системных инъекций, пригодного для клинического применения [24-28]. Многообещающей разработкой является капсид TRACER 9P801, разработанный компанией Voyager therapeutic. На момент завершения данного обзора этот капсид был представлен только на заседании Американского общества клеточной и генной терапии, но уже продемонстрировал значительное улучшение в прохождении через BBB и трансдукции в ЦНС у NHP [29].



Fig. 1 Delivery routes and suitable AAV variants for gene therapy in Parkinson's disease. To target the basal ganglia, AAV vectors can be delivered through four different routes; Intranigral, striatal, intrathecal, or systemic. All routes have advantages but also present challenges. Fortunately, we now have engineered AAV-vector capsids suitable for most routes.

Мы применили другой подход в методологии капсидной инженерии BRAVE (Barcoded Rational AAV Vector Evolution) [16]. В рамках этого подхода мы вычислительным путем разрабатываем новые варианты капсида, вдохновленные другими вирусными белками или эндогенными белками/лигандами с желаемыми функциями, такими как тропизм типа клеток или транспортные характеристики. Используя этот подход, мы можем быть уверены, что выбранная последовательность белка будет эффективно синтезироваться в клетках человека, а потенциал межвидовой инфекционности увеличивается. Затем одну и ту же библиотеку можно охарактеризовать в многочисленных модельных системах, таких как клетки c дофамином (DA), полученные из hESC, органоиды, трансплантированные нейроны человека в мозг крысы и многие другие [30, 31]. Показания каждой модельной системы могут быть затем интегрированы для выявления новых вариантов капсидов, которые будут высокоэффективными и пригодными для человеческого мозга.

Используя этот подход, мы создали (среди многих других) вариант капсида MNM008 AAV с уникальной способностью достигать нейронов DA из окончаний (рис. 1). Однако потенциал этой системы на этом не исчерпывается. Она может позволить нам идентифицировать варианты капсида, которые потенциально могут перемещаться из лимфатической системы (через интратекальный путь доставки) [32] или через BBB (после внутривенной инъекции) [33] и попадать в нейроны DA. Благодаря новым подходам мультиплексного синтеза генов, такие усовершенствования можно проводить итеративно и систематически.

Однако для таких улучшений также потребуется развитие нашей способности предсказывать функции и экстраполировать их на основе больших массивов данных. Именно здесь могут оказаться незаменимыми последние достижения в области машинного обучения (ML) и машинного проектирования. В первом исследовании ML применялось для предсказания сборки капсида с использованием обучающих данных, полученных из библиотек AAV [34]. В совсем недавнем исследовании Bryant и др. ML был использован для конструирования вариантов AAV, которые могут значительно отличаться от любого известного серотипа AAV без потери способности к сборке и заражению [35]. Одной из областей, где такие значительные изменения необходимы, является уклонение от иммунитета.

Адаптивная иммунная система с предсуществующими нейтрализующими антителами и привлечение капсид-специфических цитотоксических Т-клеток является лишь одним из препятствий для введения или повторного введения AAVs. Более того, исследования также показывают различные уровни нейтрализующих антител к различным серотипам как у людей, так и у NHP [12, 36]. Необходима дополнительная работа по изучению того, как AAV могут уклоняться от циркулирующих антител. Тем не менее, в нескольких исследованиях этот вопрос был успешно решен и представлена ценная информация по данной теме [37, 38].

Врожденная иммунная система также может распознавать инфекционность AAV путем запуска Toll-подобного рецептора 9 (TLR9), опосредованного геномом AAV. Chan и др. недавно продемонстрировали захватывающую концепцию ингибирования TLR9 в терапевтическом геноме AAV [39]. Это достигается за счет использования короткой повторяющейся структуры, вдохновленной теломерами млекопитающих, с мотивом TTAGGG. Одно только это небольшое изменение значительно снижало активацию врожденного иммунитета у мышей и свиней, но с меньшим эффектом у NHP. Хотя это изменение требует дальнейших усовершенствований, прежде чем станет клинически значимым, оно дает важное представление об иммунитете AAV.

Искусственное преобразование капсида AAV открывает большие перспективы для повышения эффективности генной терапии при PD. Тем не менее, она не сможет достичь всех целей специфичности и регуляции. Не каждый тип клеток или состояние клеток будет иметь внешнее представительство на клеточной поверхности, которое может быть благоприятным для нацеливания AAV. Кроме того, поскольку генотерапия на основе AAV в ее нынешней форме необратима, существует множество сценариев, когда регулируемый терапевтический подход модулируется, например, состоянием воспаления или апоптическим каскадом.

Предыдущие попытки были сосредоточены на включении в AAV-геном промоторов, специфичных для клеточного типа, для обеспечения экспрессии трансгена. Однако изъятие промотора из его геномного контекста и его усечение, чтобы вписаться в ограниченное пространство AAV, привело к неутешительным результатам [40]. Специфичность обычно низкая и непредсказуемая и может даже резко меняться, например, от глиальных клеток к дофаминовым нейронам [41].

Перспективным альтернативным направлением является включение коротких усиливающих последовательностей перед минимальными промоторами. Последние достижения в секвенировании доступности хроматина в объемных тканях и отдельных ядрах позволили нам точно идентифицировать короткие энхансерные элементы с высокой специфичностью для клеточного типа и состояния клеток [42, 43]. Важно отметить, что такое картирование может быть достигнуто с разрешением в одно ядро и в образцах человеческого мозга после смерти [44]. Выявленные энхансерные элементы были использованы для создания геномов AAV с высокой специфичностью для подтипов нейронов коры головного мозга [45]. Вполне возможно, что аналогичный подход может быть использован для идентификации элементов усиления, имеющих отношение к PD. Такие векторы могут определять как соответствующие подтипы дофаминовых нейронов, так и состояние болезни и экспрессировать терапевтический трансген только в нужной клетке в нужное время и в физиологической дозе. Основной проблемой будет переносимость, поскольку состояние хроматина и функция энхансеров не гарантированы для разных видов и состояний болезни. Здесь важную роль будут играть гуманизированные животные, точные модели заболеваний и эффективные методы скрининга.

В сценариях, когда ограничение экспрессии терапевтического трансгена с помощью искусственного преобразования капсида или промотора не представляется возможным, усовершенствования в доставке могут обеспечить улучшенную специфичность к мишени. Одним из таких подходов является направленный ультразвук, когда BBB временно открывается в ограниченном участке мозга, чтобы позволить пройти AAV из кровотока [46, 47].

На сегодняшний день в клинике было использовано очень мало преобразованных AAV [48], но многие из них уже на горизонте. Искусственное преобразование AAV имеет потенциал для радикального улучшения целевой специфичности к мишени и, таким образом, снижения необходимой дозы и иммунного ответа. Инструментарий CRISPR развивается очень быстрыми темпами, появляются интересные инструменты для видоизменения генов. Одной из таких разработок является РНК-направляемая РНК-нуклеаза CasRx [49]. Эта система обеспечивает возможность видоизменения генов на уровне РНК без модификации генома или образования непредсказуемых вариантов белков, образующихся в результате NHEJ (негомологичного соединения концов). Было показано, что CRISPR-видоизменения обладают гораздо более высокой специфичностью по отношению к мишени, чем ранее использовавшиеся РНК-интерференции на основе shRNA/microRNA [49], что еще больше усиливает их трансляционную привлекательность. Недавно Zhou и др. добились in vivo перепрограммирования резидентной стриатальной глии в функциональные дофаминовые нейроны посредством CasRx-опосредованного замалчивания гена PTB [50]. Если этот опыт будет воспроизведен в других модельных системах, значит он имеет интригующий потенциал.

Еще одна область клинического применения, где инженерные AAV-векторы имеют большой потенциал, - это комбинация с клеточной терапией, использующей внешние источники клеток, такие как ESCs или IPS-клетки. Векторы AAV способны облегчить точную модуляцию функции трансплантата DA для усиления терапевтического результата [51], модулировать любые потенциальные неблагоприятные события [52] и адаптировать клетки, чтобы избежать иммунного отторжения [53]. В будущем, когда аутологичные источники клеток станут реальностью (будь то перепрограммирование in vivo или трансплантация), важным применением вирусных векторов будет исправление любых вызывающих болезнь изменений генов (например, избыточной экспрессии α-синуклеина) в клетках хозяина [54].

В будущем искусственно преобразованные AAVs могут стать настолько безопасными, целенаправленными и эффективными, что мы сможем начать использовать их для нейропротекции и профилактики заболеваний в широких массах, даже при пресимптоматической PD или у людей с повышенным риском развития PD. Пока еще очень рано, такие методы лечения могут быть направлены на макроавтофагию [55], замедление старения нейронов [56, 57] или даже омоложение дофаминовых нейронов [58].

Технологический прогресс оказал заметное влияние на развитие капсида AAV. Была поднята планка того, чего можно достичь с помощью генной терапии на основе вирусных векторов, и не в последнюю очередь в ЦНС. Искусственно преобразованные AAV и редактирование генома идеально подходят для новых клинических терапий. Мы ожидаем, что некоторые из представленных здесь капсидов будут использоваться в клинике при различных заболеваниях, не в последнюю очередь при PD. Несмотря на сложный путь, будущее у генотерапии большое, и мы увидим еще много новых капсидов с еще большим потенциалом.