Плюрипотентные стволовые клетки человека (hPSCs), включая эмбриональные стволовые клетки (ESCs) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), обладают способностью дифференцироваться в клетки, полученные из трех зародышевых слоев эмбриона. Возможность искусственного преобразования генома hPSCs привела к созданию мощных систем in vitro в области биологии развития, моделирования заболеваний, открытия лекарств и терапии на основе стволовых клеток (1-4).

Недавно была разработана система CRISPR-Cas9 как основной инструмент для редактирования генома. Эта система основана на настраиваемых РНК, которые направляют нуклеазу Cas9 на целевые последовательности ДНК мишени, что приводит к образованию двухцепочечного разрыва (DSB) (5-8); реакция систем восстановления клетки, таких как негомологичное соединение концов (NHEJ) или гомологично направленная репарация (HDR), приводит к целевому редактированию генома. Однако сообщалось, что даже один DSB может вызывать хромосомные перестройки, делеции или крупные нехватки (9,10), и, особенно в hPSCs, это может привести к активации пути p53, что приводит к апоптозу (11,12). Более того, эффективность редактирования генома с помощью CRISPR-Cas9-индуцированных DSBs в hPSCs обычно низка (8,13). В качестве альтернативы, редакторы оснований ДНК (BEs), включая редакторы оснований цитозина (CBEs) и адениновых оснований (ABEs), могут генерировать однонуклеотидные замены без вызывания DSB (14). Однако эти инструменты имеют потенциальные ограничения, такие как ограниченное окно редактирования, редактирование посторонних нуклеотидов и применение только для переходных мутаций (преобразования C-G в T-A для CBEs и A-T в G-C для ABEs) (15). Более того, несколько исследований выявили геномное CBE-опосредованное нецелевое редактирование ДНК, транскриптомное CBE- и ABE-опосредованное нецелевое редактирование РНК, а также нежелательное, неправильное редактирование, такое как ABE-опосредованное деаминирование цитозина (16-18). Недавно были разработаны инженерные редакторы оснований для уменьшения внецелевых эффектов в масштабах генома и транскриптома и для повышения активности редактирования, но они все еще имеют ограничения в отношении способности к редактированию (19-24).

Prime editors (PEs) - это недавно разработанные инструменты редактирования генома, которые могут вводить все типы преобразований между основаниями (т.е. преходящие и трансверсионные мутации), а также небольшие вставки и делеции (indels) без индукции DSBs (25). PE2 состоит из никазы Cas9 (nCas9), содержащей мутацию H840A, и сконструированной обратной транскриптазы. PE2 использует направляющую РНК редактирования праймера (pegRNA) для поиска сайта-мишени и обеспечивает желаемую правку в этом сайте.

PegRNA, представляющая собой модифицированную форму стандартной одиночной направляющей гид РНК (sgRNA), имеет расширенную последовательность на 3' конце, которая включает сайт связывания праймера (PBS), запускающий реакцию RT, и шаблон RT, кодирующий желаемую правку. Когда комплекс PE-pegRNA связывается с целевой ДНК, домен nCas9 делает вырезку (nicks) в нити, содержащей protospacer adjacent motif (PAM), и высвобождает 3' конец в сайте мишени. Затем освобожденный 3' конец гибридизируется с PBS pegRNA для запуска реакции RT, после чего RT встраивает желаемые последовательности в мишень, используя pegRNA в качестве матрицы. Отжиг вновь образованного 3' лоскута (flap) с не редактируемой нити приводит к образованию 5' лоскута, который впоследствии удаляется механизмом репарации ДНК (Дополнительный рисунок S1). Введение второй зарубки в противоположную нить с помощью дополнительной sgRNA (a nicking sgRNA) может еще больше повысить эффективность редактирования праймера; системы, включающие nicking sgRNA, обозначаются как PE3. Таким образом, и PE2, и PE3 способны копировать информацию непосредственно с pegRNA в целевую последовательность ДНК. Недавно в одном из исследований PEs использовали для редактирования гена-репортера в hiPSCs (26), но PEs не были широко протестированы или охарактеризованы в hPSCs.

Здесь мы создали индуцируемую лекарственными препаратами линию гESCs, экспрессирующую PE2. Мы продемонстрировали ценность этой платформы PE для введения небольших indels и всех типов нуклеотидных замен в целевых сайтах, протестировав 63 pegRNA. Кроме того, мы сравнили PEs с BEs для исправления мутации, вызывающей заболевание, в iPSCs, полученных от пациентов. Наконец, с помощью секвенирования всего генома (WGS) мы обнаружили, что длительная экспрессия PE2 в hPSCs не приводит к возникновению нежелательных мутаций в геноме.



Figure 1. Generation and characterization of H9-iPE2. (A) Schematic diagram of the strategy for TALEN-mediated targeting of the AAVS1 locus to generate H9-iPE2 cells, in which PE2 expression is induced by dox. The AAVS1 donor vector contains a cassette in which PE2 expression is under the control of the dox-inducible TRE3G promoter. SA, splice acceptor; 2A, self-cleaving 2A peptide; Neo, neomycin resistance gene; rtTA, dox-controlled reverse transcriptional activator; CAG, cytomegalovirus early enhancer/chicken ? actin promoter. (B) PCR-based confirmation that the iPE2 construct was targeted to the AAVS1 locus. A primer pair that flanks the AAVS1 knock-in site only amplifies a product in wild-type cells; lack of a product indicates that the H9-iPE2 clone used in this study is homozygous (left panel). Junction PCR confirmed on-target integration of the cassette into the AAVS1 locus (center and right panels). (C) Immunostaining of H9-iPE2 cells before and after 48 h of dox treatment with an anti-Cas9 antibody (green). Nuclei were stained with DAPI (blue). (D) Editing efficiency in H9-iPE2 cells. H9-iPE2 cells maintained in the presence of dox were electroporated with plasmids encoding a pegRNA and a nicking sgRNA (for PE3 system). The editing efficiency is indicated as the percentage of total sequencing reads that contain the intended edit and do not contain indels. Mean ± s.d. of n = 3 independent biological replicates.

Далее мы исследовали различные особенности PE3-опосредованного редактирования в клетках H9-iPE2. Известно, что эффективность PE-опосредованного редактирования зависит от длины шаблонов PBS и RT в pegRNA (25). Для изучения этого вопроса в клетках H9-iPE2 мы выбрали сайты-мишени в двух различных локусах, HEK3 и RNF2, и протестировали pegRNA с различной длиной PBS вместе с соответствующими nicking sgRNAs. В предыдущем исследовании с использованием клеток HEK293T группа Liu сообщила, что для эффективного праймирования сайта RNF2, который имеет относительно низкое содержание G/C (35%), требуется более длинная последовательность PBS, чем для эффективного прайм-редактирования сайта HEK3, который имеет содержание G/C в 71%. Аналогичным образом, мы обнаружили, что для эффективного редактирования праймера в сайте RNF2 требуется более длинная последовательность PBS, чем в сайте HEK3 (Рисунок 2A и B), что позволяет предположить, что оптимальная длина PBS зависит от последовательности и может быть консервативной среди типов клеток (Дополнительный рисунок S3). Кроме того, подобно результатам предыдущего исследования в клетках HEK293T, мы обнаружили, что PEs могут вводить как преходящие, так и трансверсионные замены в положениях от +1 до +33 сайта мишени HEK3 с различной эффективностью в hPSCs (Рисунок 2C и D). Мы также проверили способность PE3 вводить небольшие indels (1-3 п.н.) на сайтах HEK3 и RNF2 и обнаружили, что PE3 успешно генерирует нужные правки в позиции +10, но не в позициях +17 и +21 (рис. 2E и F). Наконец, мы продемонстрировали, что крупные делеции (до 80 п.н.) и инсерции (до 42 п.н.) были точно вызваны PE3 (Рисунок 2G и H). На основании этих результатов мы пришли к выводу, что PE3 может быть практическим инструментом для индукции широкого спектра мутаций в hPSCs.



Figure 2. Prime editing of genomic DNA in H9-iPE2 cells by PE3. (A, B) PE3 editing efficiencies at HEK3 and RNF2 genomic sites with pegRNAs containing varying PBS lengths. (C) Efficiencies of all 12 types of transition and transversion edits at the indicated positions in the HEK3 site. (D) Efficiencies of long distance edits at the HEK3 site using a 34-nt RT template. (E, F) Editing efficiencies for the generation of intended indels at the HEK3 and RNF2 genomic sites. Yellow, desired indel; purple, undesired indel. (G) Editing efficiencies for the generation of targeted deletions of 5-80 bp at the HEK3 site. (H) Editing efficiencies for the generation of targeted insertions of a His6 tag, Flag epitope tag, and loxP site at the HEK3 site. The editing efficiency is indicated as the percentage of total sequencing reads that contain the intended edit and do not contain unintended indels. Mean ± s.d. of n = 3 independent biological replicates.

Далее мы попытались понять, почему indels мутации генерируются системой PE3. Чтобы выяснить, какой фактор играет доминирующую роль в генерации таких indels, мы рассмотрели пять различных сценариев: (i) одиночный DSB, индуцированный Cas9 дикого типа (wt) и sgRNA, (ii) одиночный ник, индуцированный nCas9-RT и sgRNAs, (iii) двойной DSB, индуцированный wt Cas9 и двумя sgRNA, (iv) двойной ник, индуцированный с помощью nCas9-RT и двух sgRNA и (v) двойной ник, индуцированный nCas9-RT, одной pegRNA и одной sgRNA (т.е. система PE3) (рис. 3A). Мы проверили все эти возможности на сайтах HEK3 и RNF2. Расстояния между первым и вторым никами составили 63 и 41 нт для сайтов HEK3 и RNF2, соответственно. Для поддержания согласованности с системой PE3 мы дополнительно создали линию H9, в которой wt Cas9 экспрессировался в dox-индуцибельной манере, названной H9-iCas9 (Дополнительный рисунок S4). Мы также установили соотношение первой sgRNA и второй sgRNA на уровне 3:1.



Figure 3. Comparison of indel frequencies and endpoints after different DNA cleavage and nicking scenarios. (A) Schematic of enzymes and guide RNAs tested to compare indel frequencies. (B, C) Indel frequencies generated by the experimental set ups diagrammed in (A) at the HEK3 and and RNF2 genomic sites. (D, E) Deletion patterns obtained after single cuts, double cuts, and PE3-mediated base substitutions at the HEK3 and RNF2 sites. Each line designates the extent of a deletion. The five most frequent types of deletions are shown for each case. Mean ± s.d. of n = 3 independent biological replicates.

Сначала мы оценили частоту indels после введения одинаковых sgRNA в клетки H9-iCas9 и H9-iPE2. Данные высокопроизводительного секвенирования показали, что образующиеся одиночные DSB (сценарий i) приводили к высокой частоте indels (68% и 79%) на сайтах HEK3 и RNF2, соответственно, тогда как после введения одиночных ников (ii) значительной частоты indels не наблюдалось (Рисунок 3B и C). Мы также провели электропортацию пары sgRNAs, чтобы изучить эффекты двойных DSBs или ников. Данные секвенирования показали, что двойные DSBs (iii) приводили к высокой частоте indels, а двойные ники (iv) - нет (частота indels менее 2%), что говорит о том, что само по себе образование двойных ников не является основной причиной образования indels и что фермент RT в PE3 не может генерировать мутации indels самостоятельно. Однако, когда двойные ники образовывались после введения pegRNAи sgRNA (v), частота indels существенно возрастала (до 12%), что позволяет предположить, что комбинация фермента RT и pegRNA может вызывать мутации indels. Далее мы исследовали паттерны indels, возникающих после одиночного DSB (i), двойного DSB (iii) и двойных ников, вызванных PE3 (v). Для сравнения в каждой ситуации было получено пять повторяющихся моделей делеций. PE3 генерировал длинные делеции, которые включали область выше по течению от первого сайта DSB, тогда как одиночный DSB приводил к генерации небольших делеций вблизи сайта DSB, а двойные DSB обычно вызывали точную делецию области между двумя сайтами DSB (Рисунок 3D и E). Эти результаты также подтвердили наш вывод о том, что непреднамеренные indels вызываются не непосредственно двойным никированием как таковым, а комбинаторной активностью RT и pegRNA.

Далее мы сравнили активность PEs и BEs на двух геномных участках (HEK3 и FANCF) в hPSCs. Чтобы сделать условия эксперимента одинаковыми, мы создали линии H9-iCBE и H9-iABE, экспрессирующие AncBE4max и ABE8e, соответственно, под контролем dox (Дополнительный рисунок S5). Для линий H9-iPE2, H9-iCBE и H9-iABE мы провели вестерн-блот эксперименты для измерения уровня экспрессии белков PE2, CBE и ABE соответственно в присутствии dox и обнаружили, что PE и CBE показали сходные уровни, а уровень ABE был относительно низким, но сравнимым с ними (Дополнительный рисунок S5).

Сначала мы измерили активность AncBE4max, оптимизированного варианта CBE (28), на сайтах HEK3 и FANCF. Данные высокопроизводительного секвенирования показали, что несколько цитозинов в пределах окна редактирования редактировались с частотой до 75% на сайте HEK3 (рис. 4A) и 81% на сайте FANCF (рис. 4B), это указывает на побочные эффекты CBE. В отличие от этого, для эксперимента PE мы тестировали отдельные pegRNA, предназначенные для преобразования каждого цитозина на сайтах HEK3 и FANCF. Данные высокопроизводительного секвенирования показали, что каждая pegRNA приводила к точному редактированию целевого цитозина, хотя скорость преобразования PE обычно была ниже, чем CBE (рис. 4A и B). Мы также протестировали ABE8e, оптимизированный вариант ABE (29), на тех же сайтах-мишенях и обнаружили, что они проявляют такие же тенденции, как и CBEs (рис. 4C и D). В этих экспериментах мы обнаружили, что и CBEs, и ABEs в целом демонстрируют более высокую активность, чем PEs. Однако мы также обнаружили, что при наличии в мишени нескольких цитозинов или аденинов в окне редактирования преобразование побочных нуклеотидов с помощью BEs было неизбежным, в то время как PEs точно преобразовывали нуклеотиды мишени. Мы также измерили частоту indels во всех экспериментах и обнаружили, что PE3 ассоциировались с явными indels (с частотой от 2% до 13%) (рис. 4E-H). Хотя BEs индуцировали обнаруживаемые indels с частотой от 1% до 5%, они показали лучшее соотношение редактирование:indels, чем PEs. Наконец, мы провели спонтанную дифференцировку отредактированных клеток PE и BE и показали, что обе клеточные линии экспрессируют маркеры всех трех зародышевых слоев (Дополнительный рисунок S6). В целом, наши результаты показывают, что из-за высокой активности BE предпочтительнее PE для мишеней, в которых отсутствуют побочные нуклеотиды или когда побочные правки приемлемы. Однако PE редактируют единственное интересующее основание, используя индивидуальную pegRNA для каждого основания, хотя в случае системы PE3 может происходить генерация indels.



Figure 4. Comparison of prime editing and base editing outcomes at the same target sites. (A, B) CBE- and PE-generated frequencies of CoG-to-ToA edits at target nucleotides, highlighted in red, in the endogenous HEK3 and FANCF sites. Base positions are numbered relative to the PAM of the CBE sgRNA. The PAM nucleotides are numbered 21-23. (C, D) ABE- and PE-generated frequencies of AoT-to-GoC edits at endogenous HEK3 and FANCF sites. **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. for (A)-(D). (E, F) Indel frequencies from the experiments in (A) and (B). (G, H) Indel frequencies from the experiments in (C) and (D). Mean ± s.d. of n = 3 independent biological replicates.

Далее мы применили PEs и BEs для коррекции мутации, вызывающей заболевание, в линии iPSC, полученной от пациента и несущей гомозиготную мутацию PiZZ (1024 G > A, E342K) в гене члена 1 семейства серпинов A (SERPINA1), наиболее распространенной мутации, вызывающей дефицит α 1-антитрипсина (A1AT) (30,31). Сначала мы проверили способность ABE исправлять эту мутацию. В этом эксперименте мы использовали NG PAM-целевую ABEmax (названную NG-ABEmax) и выбрали sgRNA, в которой целевым нуклеотидом является седьмой аденин с 5-го конца (A7). Данные высокопроизводительного секвенирования из обработанных NG-ABEmax iPSCs показали, что этот ABE приводил к преобразованиям A-to-G с частотой 2,5%, с частотой 3,7% для побочного аденина в пятом положении, что в конечном итоге приводило к мутации Asp-to-Gly (рис. 5A). Если рассматривать частоту только желательной правки (т.е. исправление A7 без побочной правки), то она составила всего 0,85% (рис. 5B).



Figure 5. Repair of the PiZZ 1024 G > A mutation in induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from a patient with alpha-1-antitrypsin deficiency. (A) Schematic of the disease-associated 1024 G > A mutation in the SERPINA1 gene, the altered protein sequence (E342K), and the sgRNA used to correct the mutation with NG-ABEmax. (B) Frequencies of A-to-G conversions in the editing window induced by NG-ABEmax. (C) Frequences of A-to-G conversions at the G > A mutation site induced by NG-PE3 system. pegRNAs with varying RT lengths were tested. (D) Comparison of the frequencies of precise correction of the PiZZ mutation in patient-derived iPSCs by NG-PE3 and NG-ABEmax. Mean ± s.d. of n = 3 independent biological replicates.

Далее мы протестировали версию PE2, которая распознает канонический PAM (NGG) для коррекции мутации PiZZ. Мы сконструировали pegRNA с различной длиной PBS, с целевым аденином в положении +24. Затем мы провели электропортацию pegRNA с дополнительной никелирующей sgRNA (для системы PE3) в полученные от пациента iPSCs; однако мы не наблюдали никакого обнаруживаемого редактирования (Дополнительный рисунок S7), как и в предыдущем исследовании на органоидах печени (32). Поэтому мы также протестировали NG PAM-мишень PE2 (NG-PE2) с дополнительной nicking sgRNA , которая изменила положение редактирования с +24 на +3. Эта система PE3 привела к низкой, но обнаруживаемой частоте исправления генов (0,83%) (Рисунок 5C). Мы предполагаем, что низкая эффективность редактирования может быть вызвана низкой эффективностью трансфекции и/или низкой редактирующей активностью использованной pegRNA. Таким образом, в этом эксперименте PE и ABE продемонстрировали сопоставимую эффективность генерирования только желаемых правок (рис. 5D).

BEs и PEs похожи тем, что оба содержат домены nCas9 для связывания целевых последовательностей, но отличаются своими функциональными компонентами: BEs включают цитидин/аденозиндеаминазу, а PEs - RT. Ранее несколько групп сообщили, что цитидиндеаминазы в CBE могут генерировать sgRNA-независимые преобразования ДНК/РНК, в то время как аденозиндеаминазы в ABE могут генерировать sgRNA-независимые преобразования РНК (16-19). Аналогичным образом, мы задались вопросом, будут ли PE проявлять независимые от pegRNA эффекты ферментов RT. Насколько нам известно, о последствиях длительной экспрессии PE в hPSCs до сих пор не сообщалось. Поэтому мы задались целью выяснить, вызовет ли длительная экспрессия PE нежелательные мутации (рис. 6A). Клетки H9-iPE2 поддерживались в отсутствии или присутствии dox в течение 3 недель, после чего отдельные клоны были отобраны и культивировались в отсутствие doxycycline. После расширения клеток геномная ДНК была выделена и подвергнута секвенированию всего генома (WGS). Мы не обнаружили увеличения числа однонуклеотидных вариаций (SNVs) или indels в клонах, в которых избыточно экспрессировался PE2, по сравнению с контрольными клонами (рис. 6B и C). Мы также подтвердили, что большинство SNV (92,23%) были общими для всех клонов (Рисунок 6D), что позволяет предположить, что независимые от pegRNA нецелевые эффекты в ДНК могут быть незначительными в hPSCs.



Figure 6. PE does not lead to genome-wide off-target effects. (A) Schematic diagram of the experimental design for clonal expansion and whole genome sequencing analysis of H9-iPE2 cells with or without dox-induced PE2 expression for 3 weeks. (B, C) Numbers of mutations in uninduced and induced H9-iPE2 clones. The numbers represent all sequence variations, including indels and single nucleotide variations. (D) Venn diagrams showing the ratios of common SNVs in H9-iPE2 clones.

С момента первой демонстрации на раковых клетках и кортикальных нейронах мыши прайм-редактирование применялось к различным организмам и модельным системам, включая растения, органоиды кишечника и печени человека, дрозофилу, эмбрионы мыши и взрослых мышей (32-41). Здесь мы расширили этот список, включив в него hPSCs. В этом исследовании мы продемонстрировали прайм-редактирование в hESCs, используя dox-индуцибельную линию, экспрессирующую PE2. Проведя комплексные тесты и анализ активности PE3 на эндогенных мишенях, мы отметили несколько сильных и слабых сторон этой системы в hESCs, а именно: (i) PEs способны вызывать все типы замен оснований в позиции на 30 п.н. ниже по течению от сайта никинга (nicking) в hPSCs и показали тенденцию активности, сходную с той, которая наблюдается в других клеточных линиях человека, таких как HEK293T, но в целом эффективность прайм-редактирования в hPSCs ниже, чем в других клеточных линиях; (ii) по сравнению с PEs, BEs показали более высокую активность преобразования оснований, но генерировали побочные правки, (iii) PE3-опосредованная конверсия оснований обычно сопровождается генерацией indels, которые в основном вызваны комбинаторной активностью RT и pegRNA, а не стратегией двойного никинга как таковой, и (iv) результаты WGS показали, что долгосрочная избыточная экспрессия PE2 в hESCs не генерирует значительную частоту геномных SNVs или indels. Недавние исследования в органоидных модельных системах показали, что прайм-редактирование дает более высокое соотношение желаемых исправлений/indels, чем HDR, и что редактирование оснований превосходит прайм-редактирование по эффективности редактирования (32,37), что согласуется с нашими выводами.

Потенциальным ограничением использования канонических нуклеаз CRISPR в клинических приложениях является генерация нецелевых мутаций в сайтах с высокой гомологией с предполагаемым сайтом мишенью . Однако Anzalone и др. сообщили, что PE вызывают меньше нецелевых мутаций, чем нуклеазы Cas9, и предположили, что три этапа гибридизации, необходимые для праймирования [(i) между спейсером pegRNA и целевой ДНК мишенью для связывания Cas9, (ii) между pegRNA PBS и целевой ДНК для инициации обратной транскрипции и (iii) между продуктом RT и целевой ДНК во время устранения (resolution) заслонки (flap)] могут уменьшить нецелевой мутагенез. Эти наблюдения были подтверждены двумя исследованиями: nDigenome-seq показал, что PE обладают высокой точностью (42), а анализ WGS клональных органоидов кишечника, отредактированных праймерами, показал, что PE обладают высокой точностью (32). В соответствии с предыдущими исследованиями, с помощью WGS-анализа мы обнаружили, что длительная избыточная экспрессия PE2 приводит к незначительным нецелевым эффектам в hESCs. Эти результаты убедительно свидетельствуют в пользу дальнейшего применения PEs для терапевтического редактирования в клинических исследованиях (41,43,44).

Хотя потенциал нецелевого редактирования у PEs гораздо ниже, чем у нуклеаз Cas9, для PEs, особенно для системы PE3, были зарегистрированы нежелательные редактирования внутри мишени, такие как indels (25). В предыдущем исследовании PE3 приводил к большему количеству нежелательных результатов, чем предполагаемых правок в целевом сайте у эмбрионов мыши (40); двойной никинг, связанный с pegRNA и sgRNA при PE3, был предложен в качестве основной причины высокой частоты indels. В отличие от этого, основываясь на наших наблюдениях, обобщенных на рисунке 3, мы предполагаем, что основной причиной является комбинаторная активность RT и pegRNA, а не просто стратегия двойного никинга. Однако детальный механизм, ответственный за образование indels, не был выяснен в данном исследовании. Дальнейшая характеристика механизмов репарации, которые устраняют заслонку (flap) во время праймирования, может дать представление о причине высокой частоты образования indels, опосредованных PE3, и позволит нам манипулировать путем репарации для повышения точности праймирования.

Кроме того, несмотря на уникальные возможности PEs, сложность конструирования pegRNAможет быть потенциальным недостатком их использования. Необходимо определить оптимальную длину шаблона PBS и RT, поскольку эти последовательности могут оказывать существенное влияние на эффективность редактирования праймера. Недавно группа Kim разработала вычислительные модели для прогнозирования эффективности pegRNA и определила параметры, влияющие на активность pegRNA (45). Однако для каждой конкретной задачи редактирования необходимо протестировать несколько pegRNA.

В целом, прайм-редактирование добавляет новое измерение к подходам на основе CRISPR и расширяет сферу редактирования генома в hPSC, дополняя другие методы. Вполне вероятно, что понимание механизмов репарации, участвующих в редактировании праймера, и дальнейшее совершенствование PEs ускорит перевод этой технологии в клинику.