В одной из самых захватывающих публикаций по редактированию генов, опубликованных в 2019 году, David Liu и др. (пионеры редактирования оснований, BE [1]) разработали "праймеров редактирование (PE) [2]", стерев несколько ограничений CRISPR, связанных с узкими местами в его терапевтической и биотехнологической применимости. Традиционные стратегии редактирования генов, направленные на внесение специфических изменений в саму последовательность генома, в основном основываются на общем шаге - создании двунитевого разрыва (DSB) для привлечения и использования механизмов пути репарации ДНК для выполнения желаемого ремонта. Эта необходимая "травма" клетки одновременно способствует многим проблемам, связанным с переносом системы редактирования генов в клинику. Именно здесь BE, а теперь и PE, представляют собой технологические точки улучшения на пути к дальнейшему продвижению лечения пациентов. Другими словами, прощайте DSBs и здравствуйте nicks (зарубки, щербинки). Таким образом, благодаря повышенному потенциалу точности PE мы можем еще больше ускорить переход к клиническому редактированию генов.

Система PE сохраняет специфичность нацеливания CRISPR, но несет с собой дополнительный груз в виде РНК матрицы , содержащей правки, как непрерывное продолжение направляюще РНК (известной как pegRNA), и обратной транскриптазы M-MLV (RT), слитой с С-концом никазы Cas9 (H840A). Использование никазы Cas9 позволяет избежать образования DSB, а просто перерезается некомплементарная нить ДНК на три основания выше по течению от сайта PAM. В результате образуется участок ДНК с 3' OH-группой, который соединяется с сайтом связывания праймера (PBS) матричной РНК, служа праймером для RT, который удлиняет 3' участок, копируя последовательность редактирования pegRNA (рис. 1). Несмотря на то, что термодинамически вероятность гибридизации этого расширенного 3' лоскута с неотредактированной комплементарной нитью ниже, чем у неотредактированного 5' лоскута, предпочтение эндогенной эндонуклеазы FEN1 вырезать 5' лоскуты приводит к тому, что гибридизация отредактированного 3' лоскута становится более предпочтительной, что приводит к высокоэффективному редактированию оснований. И это была PRIME версии 1.0.

Fig. 1: Prime editing in five steps.

Prime editing has just two components, a Cas9 nickase fused to a modified reverse-transcriptase (referred to as PE2) and a multifunctional prime editing guide RNA (pegRNA). 1 The Cas9-H840A/pegRNA complex binds to the desired target region and creates a nick 3?bp upstream of the PAM site. The nick must be upsteam of the first variant site (in this case a TGA stop codon) and occurs on the same strand as the PAM liberating a 3' flap. 2 This 3' flap forms a sequence-specific interaction with the 14-16 nt "primer binding site" located at the 3' end of the pegRNA. This RNA/DNA hybrid serves as the PRIMEr site for new DNA synthesis using the RNA "edit site" as a template; the modified RT polymerase copies the template thereby extending the 3' flap. 3 The edited 3' flap displaces the variant unedited 5' flap, which is removed by a cellular nuclease FEN1. 4 In this example, this leaves two MisMatches to be resolved, one in the edited codon (G???T), and one in the modified PAM (C???C) which can be introduced as an option to prevent further editing to the corrected sequence. 5 MisMatch Repair resolves the DNA resulting in either precisely edited DNA (with no indels), or the original variant sequence. In the latter case where the PAM sequence has not been modified, the Cas9-H840A/pegRNA complex can bind to the variant sequence again and have another attempt at PRIME editing. Key: Cas9-H40A nickase shown in Green, Reverse Transcriptase in yellow. The PAM site is highlighted in a grey box; the pegRNA in blue; the 3' edit site in red; the edited PAM site in bold; FEN1 in grey. For clarity, only part of the pegRNA is shown in step 1.

Путем внесения ряда изменений в последовательность RT (PE2) было отмечено значительное повышение эффективности редактирования при очень низком уровне случайных вставок/делеций (indels). Последним шагом в процессе редактирования является разрешение короткой гетеродуплексной области ДНК, которая возникает в результате прямого редактирования только одной нити ДНК. Этот участок может завершаться естественным образом в пользу желаемого процесса редактирования с достаточно высокой эффективностью. Но авторы показали, что совместная трансфекция стандартной gRNA, нацеленной на комплементарную нить, позволяет H840A Cas9 зацепить не редактируемую нить, и это смещает репарацию несоответствия ДНК в пользу редактируемой последовательности, используя редактируемую нить ДНК в качестве шаблона для завершения процесса. Единственным недостатком использования этой стратегии PE3 является небольшое увеличение образования indels из-за того, что обе нити ДНК nicked примерно в одно и то же время. Чтобы решить эту проблему, можно сконструировать gRNA, распознающую комплементарную нить ДНК только после того, как произошла правка PE3. В небольшом количестве протестированных случаев эта пересмотренная стратегия (PE3b) может увеличить частоту редактирования, но при этом уменьшить образование indels, практически до уровня, наблюдаемого при редактировании PE2.

Продуманное сочетание разработанных молекулярно-биологических компонентов дает ряд преимуществ, помимо высокой эффективности редактирования путем замены одного основания. В то время как предыдущие стратегии BE предусматривали механизм создания одиночных замен оснований для четырех переходов (C->T; T->C; A->G; G->A), а недавние исследования расширили этот механизм на два перехода (C->G и G->C [3-5]), PE охватывает все потенциальные 12 модификаций, включая восемь переходов. Это позволяет значительно ускорить процесс разработки терапевтического редактирования для любого заболевания, вызванного изменением одной пары оснований, а также дает исследователям возможность моделировать любой SNP in vitro. Кроме того, PE позволяет эффективно производить небольшие делеции и инсерции, расширяя сферу применения этого инструмента до устранения почти 90% мутаций, вызывающих заболевания. В одном случае было показано, что PE3 может вносить изменения одного основания на расстоянии до 34 п.н. вниз по течению от nicking сайта, в результате чего NGG PAM может быть расположен на значительном расстоянии от сайта-мишени. Это позволяет одной pegRNA исправлять различные мутации в "горячей точке" гена. Терапевтический смысл заключается в том, что одна и та же pegRNA может быть использована для коррекции небольшого числа вариантов, вызывающих заболевания у разных пациентов. Например, при муковисцидозе два из трех наиболее распространенных вариантов PTC, G542X и R553X (ни один из которых не поддается лечению имеющимися в настоящее время модуляторами CFTR), находятся всего в 33 нуклеотидах друг от друга в одном экзоне, поэтому одна pegRNA потенциально может исправить любой из вариантов.

Вторым важным преимуществом системы PE является то, что она устраняет необходимость в механизме репарации двунитевых разрывов (DSB), который, как известно, подвержен ошибкам. Liu et al. продемонстрировали, что indels были редким событием, достоверно превосходящим по количеству точные правки, измеряемые в процентах от общего числа чтений секвенирования - обратная ситуация по сравнению с классической гомологически-направленной репарацией Cas9 (HDR), где indels часто являются преобладающим результатом [6]. (Хотя indels все еще встречаются, их частота, по крайней мере, на один log меньше, чем при HDR). Более того, вне-целевые эффекты, наблюдаемые в предсказанных областях генома, были практически не-обнаружимы по сравнению с Cas9 DSB-зависимыми системами репарации. Эти результаты представляют значительный интерес, поскольку нежелательные изменения в геноме (вызванные как целевыми indels, так и вне-целевыми эффектами) являются серьезным препятствием для внедрения терапевтического редактирования генов в клинику.

Кроме того, в оригинальном исследовании описан захватывающий эксперимент, в ходе которого было преодолено значительное препятствие в восстановлении пост-митотических клеток. Поскольку почти все стратегии точного восстановления обычно требуют шаблонов для восстановления, они должны использовать эндогенный механизм HDR, ограниченный делящимися клетками. Это было узким местом в терапевтическом применении редактирования генов, особенно при многих неврологических заболеваниях, связанных с мутациями, которые поражают пост-митотические нейроны. Однако, поскольку PE обходит необходимость в механизме HDR, точные геномные замены наблюдались (хотя и с низкой частотой) в первичных кортикальных нейронах мыши. Поскольку многие заболевания, как показали доклинические испытания, могут быть облегчены путем преодоления минимального порогового уровня клеточного восстановления, даже скромные уровни коррекции генов могут привести к клиническому улучшению.

Когда эта основополагающая статья была опубликована, она считалась потенциально одним из самых многообещающих достижений в области редактирования генов с момента открытия CRISPR [7]. Однако по мере того, как исследователи по всему миру спешат приобрести плазмиды PE, появляются дополнительные данные о том, насколько этот изысканный молекулярный инструмент действительно подходит для терапевтической геномной инженерии, а также о некоторых трудностях, присущих применению системы PE. Например, даже в своей простейшей форме она является высокомодульной, что требует оптимизации множества компонентов. Кроме того, как и в случае со многими технологиями, специфичными для последовательности, требуется значительная оптимизация pegRNA.

В связи с этими и другими проблемами в ряде недавних исследований было изучено, как PE может быть использована для эффективного восстановления и моделирования вариантов, вызывающих заболевания, в клетках, органоидах и эмбрионах мышей, а также был разработан ряд новых онлайн-инструментов, помогающих конструировать pegRNA.