Посещений:
АУТОСОМНО ДОМИНАНТНЫЙ ПИГМЕНТНЫЙ РЕТИНИТ



Генотерапия

Gene Therapy for Rhodopsin-associated Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa
Michael T. Massengill, and Alfred S. Lewin,
Int Ophthalmol Clin. 2021 Fall; 61(4): 79–96. Published online 2021 Sep 28. doi: 10.1097/IIO.0000000000000383



Retinitis pigmentosa (RP) страдает от 1 из 3000 до 1 из 4000 человек и от 1,77 до 2,35 миллионов человек во всем мире (https://rarediseases.org/rare-diseases/retinitis-pigmentosa/). Заболевание характеризуется гибелью палочковидных фоторецепторных клеток, что приводит к дефектам темновой адаптации и ночной слепоте. Обычно RP прогрессирует до потери периферического зрения и, в конечном итоге, до потери центрального зрения в течение десятилетий. Половина случаев заболевания встречается у людей без семейного анамнеза, но от 25 до 30% случаев наследуются по аутосомно-доминантному типу.1 Мутации в RHO, гене родопсина, затрагивают четверть пациентов.
Родопсин - это рецептор, связанный с G-белком, с 7 мембранными доменами, который инициирует каскад фототрансдукции в клетках фоторецепторов палочек. Он также является самым многочисленным белком в фоторецепторах, составляя 10% от общего количества белка и требуя огромного потока в синтезе белка и транспорте из внутреннего сегмента в наружный сегмент фоторецепторов. Родопсин плотно упакован в виде димеров в мембранах дисков наружных сегментов.2 Поэтому неудивительно, что мутации, влияющие на синтез, транспорт, укладку и каталитическую функцию родопсина, приводят к гибели фоторецепторных клеток и потере зрения. Действительно, более 150 мутаций в RHO приводят к аутосомно-доминантному пигментному ретиниту (adRP) (www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar), а некоторые другие приводят к врожденной стационарной ночной слепоте. Только 2 миссенс-мутации в RHO связаны с аутосомно-рецессивным RP.3,4
Связь генотип-фенотип мутаций RHO была изучена биохимически на животных моделях и клеточных линиях,5 а также клинически у пациентов с RP.6 Определение последствий дефектов RHO особенно важно для терапевтических подходов, направленных на поддержание жизнеспособности фоторецепторов без исправления основной мутации. Мутации, приводящие к адRP, были разделены на два класса в зависимости от того, синтезируются ли они на уровне дикого типа и восстанавливаются с 11-цис-ретиналем в культуре клеток (класс I) или накапливаются в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) и плохо восстанавливаются (или вообще не восстанавливаются) хромофором (класс II).7,8 С открытием дополнительных мутаций RHO группа Cheetham классифицировала мутации с большей детализацией, в зависимости от того, приводят ли мутации к неправильной укладке белка, дефектам в пост-Гольджи трафике белка, изменениям в пост-трансляционной модификации, конститутивной активации, нарушению везикулярного трафика, эндоцитозу и изменению димеризации белка.9,10 Несмотря на такое внимание к деталям, клеточные последствия более половины известных мутаций RHO остаются неопределенными или неизученными.
Клинический фенотип мутаций RHO особенно важен для генотерапии, поскольку подход к доставке генов зависит от наличия жизнеспособных клеток, в которые можно доставить гены. На основании клинического описания можно выделить 2 основных класса пациентов с adRP.11 У пациентов класса А отмечается потеря ночного зрения в более молодом возрасте и гибель фоторецепторов палочек по всей сетчатке. Любая остаточная зрительная функция обеспечивается выжившими колбочковидными фоторецепторами. У пациентов класса В заболевание протекает в более легкой форме. Длина наружных сегментов лучше сохранена, а кинетика активации родопсина нормальная. У пациентов класса В дефекты зрительного цикла палочек зависят от конкретной мутации. Гибель палочковых клеток ограничена участками сетчатки, но фоторецепторы сохраняются в соседних областях.12,13 Медленное прогрессирование заболевания у пациентов с адRP класса В представляет собой проблему для определения эффективности генотерапии, но серийное измерение сохранения фоторецепторов с помощью оптической когерентной томографии в спектральной области может стать подходящей мерой оценки результатов.14
Animal and Organoid Models of adRP


Наличие животных моделей adRP стало ключевым фактором для тестирования векторов генотерапии этого заболевания. Единственной встречающейся в природе мутацией RHO, приводящей к адRP, является мутация T4R RHO собаки, первоначально обнаруженная у английских мастифов.15,16 Эта мутация делает собак чрезвычайно чувствительными к повреждению сетчатки при освещении.17,18 Наиболее распространенные модели адRP RHO были созданы на грызунах. Они включают трансгенные модели адRP, вызванные мутациями P23H, T17M, P347S и S334Ter.19-22 Мутагенез мышей привел к созданию линий мышей, несущих мутации в локусе Rho.23 Sakami et al24 создали линию knock-in, несущую P23H Rho, а Sancho-Pelluz et al25 создали линию мышей knock-in с мутацией D190N. В обоих случаях были получены хорошие фенокопии человеческого адRP. Также были получены свиные модели адRP26 , но большие размеры домашних свиней затрудняют работу с ними во взрослом возрасте. Росс и др.27 описали инбредную линию миниатюрных свиней, несущих человеческий трансген P23H. С этими свиньями легче работать, чем с домашними свиньями, но при рождении у них нет наружных сегментов палочек и не снимается электроретинограмма (ЭРГ) с палочек.28
В отсутствие достоверной животной модели заболевания сетчатки органоиды сетчатки, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, представляют собой альтернативную платформу для тестирования векторов генной терапии.29-35 Органоиды сетчатки, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, имеют то преимущество, что из них можно получить клетки сетчатки человека. Для терапии на основе нуклеиновых кислот, такой как РНК-интерференция (RNAi) и CRISP/Cas9, использование последовательностей генов человека необходимо для оценки эффективности и внецелевых эффектов. Органоиды особенно ценны, если они созданы из клеток пациента и воспроизводят фенотип дегенерации сетчатки.36 Органоиды сетчатки экспрессируют родопсин, однако формируются только рудиментарные наружные сегменты палочек, и взаимодействие между фоторецепторами и пигментным эпителием сетчатки не может быть изучено с помощью существующих экспериментальных систем. Эти ограничения, несомненно, будут преодолены в ходе дальнейших исследований. В США Управление по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) стремится использовать альтернативные методы проверки лекарств и биологических препаратов (www.fda.gov/science-research/about-science-research-fda/advancing-alternative-methods-fda), так что доказательство эффективности в органоидах сетчатки вскоре может стать достаточным для продвижения генотерапии к клиническим испытаниям.
Gene Delivery to Photoreceptor Cells


Адено-ассоциированные вирусные векторы (AAV) в настоящее время являются лучшим выбором для доставки генов в фоторецепторы.37 Аденовирусные векторы приводят только к преходящей экспрессии доставленных генов и стимулируют воспалительную реакцию. Лентивирусные векторы на основе вируса иммунодефицита человека 1 или вируса инфекционной анемии лошадей трансдуцируют пигментный эпителий сетчатки, но трансдуцируют фоторецепторы только вблизи места инъекции. AAV2/5 и AAV2/8 приводят к эффективной трансдукции фоторецепторных клеток после субретинальных инъекций.38 (Такая терминология указывает на то, что сигналы упаковки генома вектора получены от AAV2, но геномы упакованы в капсидные белки AAV5 или AAV8). Замена некоторых капсидных остатков на другие аминокислоты (например, фенилаланина вместо тирозина) предотвращает деградацию вирусных частиц протеасомой внутри клетки и повышает эффективность продуктивной инфекции (трансдукции).39 Использование этих модифицированных по капсиду векторов повышает трансдукцию фоторецепторов.40-43 Неделящиеся клетки, трансдуцированные AAV, продолжают экспрессировать доставленные гены в течение всей жизни клетки. Поэтому обработка фоторецепторов AAV должна производиться только один раз в жизни для каждого глаза.
Несмотря на усилия по модификации капсида AAV путем многоступенчатой селекции,44,45 в настоящее время невозможно эффективно получить доступ к фоторецепторам путем введения AAV в стекловидное тело, поэтому обычно используются субретинальные инъекции. Это сложная процедура у грызунов и хирургическая операция у более крупных животных, включая человека. Область сетчатки, которая отделяется при субретинальной инъекции, называется волдырем (bleb), и заражение фоторецепторов AAV2, 2/5 или 2/8 ограничивается этой областью. Недавно, однако, новый серотип AAV, AAV44.9, был протестирован путем субретинальной инъекции у грызунов и макак.46 Гены, доставленные с помощью AAV2/44.9, широко распространились за пределы bleb, так что более обширные области сетчатки могут быть доступны с меньшим количеством рекомбинантного вируса.
Одним из ограничений AAV является то, что большинство людей естественным образом подвергались воздействию 1 или более серотипов AAV, и предыдущее воздействие может снизить трансдукцию в контексте генотерапии.47,48 Другим недостатком AAV является ограничение размера генов, которые он может доставлять (не более 4,7 kbp). Использование двойных векторов позволило преодолеть ограничение по размеру для доставки некоторых больших генов.49-51 Размер не является проблемой для кДНК RHO размером 1 kbp, но точная регуляция экспрессии родопсина нуждается в последовательности элементов в интронах гена RHO и во фланкирующих последовательностях. Это побудило Han и его коллег разработать стратегии с использованием наночастиц для доставки больших участков геномной последовательности RHO.52-54 Они обнаружили, что доставка геномного RHO превосходит доставку кДНК RHO в смысле сохранения фоторецепторов нокаутных мышей RHO. Долговечность реакции остается проблемой при доставке наночастиц, и эта технология все еще находится в стадии разработки.
Rhodopsin-directed Therapy


Наиболее прямой путь к лечению RHO adRP - это преодоление экспрессии мутантного родопсина. Для рецессивных мутаций, которые встречаются относительно редко, может быть достаточно дополнения недостающего гена, но для доминантных мутаций родопсина может потребоваться подавление мутировавшего аллеля. Wilson и его коллеги, однако, продемонстрировали, что 1 мутация класса В, P23H, вызывает доминантно-негативный, а не токсичный эффект от усиления функции палочковых фоторецепторов, предполагая, что она может вмешиваться в сборку или функцию мембран дисков фоторецепторов.55,56 Следуя их примеру, мы использовали AAV2/5 для избыточной экспрессии мышиного родопсина у P23H RHO трансгенных мышей на фоне мышиного Rho +/+.57 Мы наблюдали защиту как функции сетчатки по данным ЭРГ, так и структуры по данным гистологии. Недавно Orlans и др.58 использовали AAV, экспрессирующий кДНК RHO человека, для лечения мышей P23H Rho knock-in, но не наблюдали сохранения структуры сетчатки по данным OCT или функции по данным ЭРГ, несмотря на устойчивую экспрессию человеческого родопсина. Поэтому остается спорным вопрос о том, достаточно ли будет добавок для лечения мутаций RHO, приводящих к адRP, включая P23H RHO. Кроме того, избыточная экспрессия родопсина может быть токсичной для клеток палочек, поэтому, вероятно, необходим точный контроль экспрессии родопсина57,59.
В качестве альтернативы простой добавке, доставка генов RHO может быть сопряжена с ингибированием синтеза эндогенного родопсина. Подавление синтеза может происходить на уровне ДНК путем разрушения гена, на транскрипционном уровне путем подавления синтеза мРНК или на пост-транскрипционном уровне с помощью анти-смысловых методов, таких как RNAi или антисмысловые олигонуклеотиды (ASO). Из-за гетерогенности мутаций adRP нокдаун генов или РНК, специфичных для аллелей, не подходит, поскольку для каждой пораженной семьи придется изготовлять новые направляющую РНК (gRNA), короткую шпилечную РНК (shRNA) или ASO.
Gene Editing of RHO


Для редактирования генов используется несколько технологий, включая нуклеазы с цинковыми пальчиками, нуклеазы, похожие на эффекторы активаторов транскрипции, и кластерные регулярно перемежающиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR) в паре с Cas9 или аналогичными нуклеазами. Система CRISPR/cas9 является наиболее универсальной и пользуется наибольшей поддержкой сообщества.60 Tsai и коллеги61 использовали технологию CRISPR/Cas9 в стратегии генотерапии с использованием двух векторов AAV в двух различных мышиных моделях RHO adRP. Один вектор AAV доставлял ген Cas9 из Streptococcus pyogenes (SpCas9), а второй вектор кодировал 2 gRNAs, предназначенные для прямого расщепления мышиного Rho и копии человеческого гена RHO. Несовпадения между последовательностями ДНК человека и мыши делали замещающий ген устойчивым к расщеплению CRISPR/Cas9. Доставка gRNA в том же векторе, что и замещающий ген RHO, означала, что расщепление ДНК эндогенного Rho не происходило в клетках, не получивших также замещающий ген. Субретинальная инъекция обоих векторов привела к снижению мРНК Rho на 25% у мышей дикого типа. Когда они лечили модель мыши P23H Rho adRP путем субретинальной инъекции, гистология показала сохранение 6-8 рядов ядер в наружном ядерном слое (ONL) по сравнению с 3-4 рядами в контрольных глазах, получавших фосфатно-буферный физраствор, через 3 месяца после инъекции. Реакция ЭРГ также значительно улучшилась благодаря двухвекторной системе абляции и замены. Группа из EDITAS medicine также сообщила об эффективности CRISPR/Cas9-опосредованной абляции Rho и одновременной замене геном дикого типа на ежегодном собрании Американского общества генной и клеточной терапии в 2020 году (обзор Meng et al62). Несколько групп сообщили о редактировании специфических мутаций родопсина с помощью технологии CRISPR,63,64 но, как отмечалось, клинический перевод этого подхода может быть ограничен количеством пациентов, несущих мутантный аллель.
Transcriptional Repression


Принципы конструирования ДНК-связывающих цинковых доменов хорошо известны.65 Mussolino и его коллеги создали серию транскрипционных репрессоров, блокирующих экспрессию родопсина, путем конструирования цинковых доменов, нацеленных на различные 18-нуклеотидные сегменты восходящей области RHO. Эти домены были объединены с репрессивным доменом KRAB (Krüppel-associated box repressor) и впоследствии проверены в культуре ткани, а затем на мышах.66 Самый активный репрессор был закодирован и доставлен путем субретинальной инъекции AAV2/8 мышам, несущим трансген P347S человеческого RHO на фоне Rho+ /Rho+. Через 60 дней после инъекции транскрипция мРНК RHO была снижена на 26%, а амплитуда b-волны ЭРГ была увеличена почти на 30% в обработанных глазах. Ингибитор транскрипции не влиял на продукцию мышиного родопсина. В аналогичной методике для подавления транскрипции в сетчатке мыши использовался AAV-доставляемый CRISPR/Cas9, слитый с доменом KRAB, хотя этот подход не был применен конкретно к гену родопсина.67 Для терапии adRP подавление эндогенного RHO должно сочетаться с доставкой гена RHO, промотор которого модифицирован таким образом, чтобы быть устойчивым к ингибитору транскрипции. Однако в случае токсичных мутантов RHO с усиленной функцией возможно, что снижение уровня как мутантного, так и родопсина дикого типа сохранит жизнеспособность фоторецепторов.
ASO


Murray et al68 описали разработку и скрининг серии химерных олигонуклеотидов из 20 остатков с фосфоротиоатной основой. Эти олигонуклеотиды были дополнительно модифицированы 2'-O-метоксиэтилрибозой в положениях с 1 по 5 и с 15 по 20 и не-модифицированными дезоксирибонуклеотидами в положениях с 6 по 14. Модификации рибозы служат для стабилизации ASO, в то время как образование гибридов РНК:ДНК в центре ASO приводит к деградации РНК, опосредованной клеточной РНКазой H. При тестировании на мышах однократная инъекция в стекловидное тело наиболее активного ASO приводила к 70% снижению мРНК родопсина, которое сохранялось по крайней мере 60 дней после этого. Лечение крыс P23H, которые экспрессируют мышиный трансген P23H Rho, привело к значительному улучшению реакции ЭРГ палочек (a-волна) и небольшому увеличению толщины ONL по сравнению с глазами, обработанными контрольным ASO. Клиническое использование аллель-специфических ASO имеет тот же недостаток, что и аллель-специфические CRISPR/cas9 подходы, - ограниченный контингент пациентов. Однако разработка, тестирование и производство ASO намного быстрее и проще, чем разработка и производство других форм генотерапии. Кроме того, при возникновении неблагоприятных эффектов терапию легко прервать. В настоящее время проводится клиническое испытание одного из таких ASO (QR-1123) для лечения АДRP, вызванного мутацией P23H RHO (идентификатор ClinicalTrials.gov: NCT04123626). ASO, способствующие пропуску экзонов, также тестируются для лечения синдрома Ашера69 и рецессивной макулярной дистрофии Штаргардта.70 Пропуск экзонов может быть использован для снижения экспрессии RHO через нонсенс-опосредованный распад в условиях адRP.
RNA Replacement


Нокдаун РНК может быть достигнут несколькими методами, включая РНК-инструменты, такие как рибозимы,71 малые интерферирующие РНК (siRNAs),72 искусственные микроРНК (a-miRNAs),73 и нуклеазы, такие как РНК-направленные CRISPR/Cas974 или Cas13a.75 РНК-инструменты малы (менее 75 нуклеотидов) и могут быть легко объединены с заменой гена родопсина (1047 нуклеотидов) на векторах типа AAV с ограниченной кодирующей способностью. AAV-векторные шпилечные и молоточковые (hammerhead) рибозимы были успешно протестированы для аллель-специфического и аллель-независимого нокдауна мРНК родопсина.76-80 Тем не менее, siRNA, доставляемые AAV как shRNAs, более эффективны, чем рибозимы, в снижении мРНК родопсина в животных моделях. siRNA также проще в разработке и могут быть приобретены на коммерческой основе для целей скрининга.81 Используя преимущества этой технологии, исследователи из Тринити-колледжа в Дублине использовали 2 вектора AAV для доставки гена shRNA, управляемого промотором РНК-полимеразы III H1, и кДНК замещающей родопсин, управляемой гибридным промотором Rho мыши.82-84 Используя флуоресцентные маркерные гены, они впервые установили, что совместное введение 2 векторов AAV привело к двойной инфекции большинства фоторецепторов. Субретинальная инъекция векторов shRNA и замены Rho привели к улучшению реакции b-волны ЭРГ в обработанных глазах через 5 месяцев после инъекции, по сравнению с базовой реакцией в глазах, обработанных в контроле. В отличие от двухвекторного подхода, мы использовали один вектор доставки AAV (AAV-RS301) для доставки RHO-специфической shRNA под контролем промотора H1 и устойчивого гена Rho под контролем проксимального промотора опсина мыши. Эта стратегия обеспечивает кодовую доставку элементов shRNA и кДНК RHO. Устойчивый ген Rho содержал немые мутации в целевом сайте siRNA для ингибирования связывания siRNA при сохранении аминокислотной последовательности. shRNA в этом векторе связывалась с мРНК родопсина мыши и человека и приводила к снижению общего количества родопсина на 50% благодаря человеческим трансгенам у мышей P23H RHO. Глаза, обработанные AAV-RS301, имели 2-кратное увеличение общего содержания родопсина по сравнению с необработанными глазами и оказывали устойчивый защитный эффект на сетчатку (80% от нормального ответа ЭРГ) до 9 месяцев после инъекции.85
На основе успеха, достигнутого на мышах, мы сконструировали одиночный вектор замены РНК для лечения быстрой дегенерации сетчатки, вызванной воздействием света, у собаки с родопсином T4R.86 Из-за различий в последовательности генов RHO человека и собаки, shRNA301, используемый AAV-RS301, не подходила для этой цели, и новый набор shRNA был проверен на уровень нокдауна. shRNA, которая приводит к расщеплению мРНК человеческого и собачьего RHO в положении 820, вызвала 95% деградацию мРНК человеческого RHO в культивируемых клетках и была включена в новый комбинированный вектор, клонированный в само-комплементарный AAV и обозначенный scAAV2/5-hOP-RHO 820-H1-shRNA 820. Лечение собак T4R этим вектором привело к защите от дегенерации сетчатки, связанной с воздействием света, в течение более 30 недель и при 4 повторных воздействий света после инъекции. Этот вектор был лицензирован для клинической разработки компанией Iveric Bio Inc.
Альтернативный подход к доставке siRNA с помощью вирусного или плазмидного вектора заключается во встраивании последовательности siRNA в сигнал обработки (фланкирующие последовательности и последовательность петли) a-миРНК.87 Самое большое преимущество этого подхода заключается в том, что a-миРНК может быть произведена под контролем промотора РНК-полимеразы II, что означает возможность использования промотора, специфичного для типа клеток или регулируемого промотора, в отличие от высокоактивных, но неспецифичных промоторов pol III, используемых для производства shRNA. Этот подход оказался эффективным при лечении доминантно наследуемой дегенерации печени, вызванной мутациями в α-1-антитрипсине.88,89 Кодирующая последовательность а-миРНК обычно вставляется в интрон или 3'-UTR гена, кодирующего белок. По сравнению с shRNA, нацеленными на те же последовательности, а-миРНК стимулируют меньшее воспаление и неспецифический нокдаун (нецелевые эффекты).73,90 Greenwald и коллеги использовали этот подход для лечения мышей, трансгенных по человеческому трансгену P347S RHO, с помощью двойной системы векторов AAV2/9 для экспрессии специфической для RHO а-миРНК и устойчивой кДНК RHO. Мыши, которых лечили с помощью этой двойной векторной системы, показали улучшение ЭРГ-ответа, несмотря на тяжелую дегенерацию, наблюдаемую в модели P347S RHO.91
Любая из технологий на основе нуклеиновых кислот имеет потенциал неспецифического (внецелевого) воздействия. ASOs, gRNAs, рибозимы, микроРНК (miRNAs) или shRNAs могут иметь последовательности мишени, достаточно комплементарные с непредусмотренными мишенями, что может привести к разрушению или редактированию непредусмотренных последовательностей мРНК или ДНК. Эта проблема особенно актуальна для shRNA или а-миРНК, которые могут вмешиваться в процессинг и транспорт эндогенных миРНК, насыщая эндогенный механизм RNAi или стимулируя воспалительную реакцию при чрезмерной экспрессии. siRNAs, поставляемые в виде shRNA или а-миРНК, могут связываться с 3'-UTR мРНК и блокировать трансляцию генов вне мишени посредством миРНК92. Существуют биоинформационные инструменты, позволяющие избежать подобных проблем81,93 , но в конечном итоге требуется экспериментальное доказательство специфичности.
Photoreceptor Survival Therapy
Neurotrophic Factors


Содействие выживанию клеток является альтернативой исправлению или замене мутантного родопсина. CNTF (цилиарно-производный нейротрофический фактор) и GDNF (глиально-производный нейротрофический фактор) были протестированы в животных моделях адRP. GDNF является членом семейства трансформирующего фактора роста-бета, и его рецепторы обычно экспрессируются в сетчатке.94 У трансгенных крыс, несущих мутацию S334Ter в родопсине, субретинальное введение AAV2-GDNF замедлило дегенерацию фоторецепторов на основании измерения толщины ONL и реакции ЭРГ.95 AAV-GDNF также замедлил дегенерацию сетчатки в двух других моделях дегенерации сетчатки, не вызванной мутациями родопсина,96 что демонстрирует универсальность воздействия на пути обеспечения жизнеспособности. Поскольку рецепторы для GDNF присутствуют на глиальных клетках Müller, но не на фоторецепторах, GDNF, вероятно, защищает фоторецепторы косвенно, действуя через клетки Müller.94 Wu et al97 лечили крыс дикого типа Sprague-Dawley AAV-GDNF и не обнаружили вредных эффектов или влияния на функцию сетчатки в течение 1 года. Поэтому, похоже, что GDNF, доставляемый с помощью AAV, может быть безопасным и эффективным средством для продления выживания фоторецепторов при адRP.
CNTF, член семейства интерлейкинов (IL)-6, был доставлен в сетчатку с помощью имплантируемого устройства, содержащего клетки млекопитающих.98 Этот белок также привлек внимание в области генотерапии. Трансгенным крысам S334ter и P23H RHO в стекловидное тело вводили AAV-CNTF, что замедлило дегенерацию фоторецепторов, но подавило а-волновой и b-волновой реакции в ЭРГ.99 Уменьшение ответов ЭРГ также наблюдалось при использовании имплантируемых устройств, выделяющих CNTF,100 что позволяет предположить, что этот нейротрофический фактор может быть непригоден для долгосрочной экспрессии путем доставки генов из-за ослабления функции фоторецепторов.
Наиболее перспективный нейротрофический фактор, протестированный на сегодняшний день, вырабатывается в сетчатке. Rod-derived cone viability factor (RdCVF), тиоредоксин-подобный белок, лишенный оксидоредуктазной активности, способствует выживанию фоторецепторных клеток колбочек.101,102 RdCVF действует через трансмембранный белок базигин (basigin), способствуя транспорту глюкозы в фоторецепторные клетки.103 У трансгенных крыс P23H Rho инъекция RdCVF увеличила плотность колбочек почти на 20%.104 Dalkara et al105 использовали интравитреальную инъекцию AAV7m8, варианта AAV, выделенного путем селекции для пан-ретинальной трансдукции, для лечения мышей P23H Rho knock-in.106 Они сообщили о повышении амплитуды ЭРГ колбочек в обработанных глазах по сравнению с контрольными глазами через 1 и 4 месяца, но не через 6 месяцев после лечения. Интравитреальная доставка в этих экспериментах позволяет предположить, что генотерапия с помощью AAV7m8-RdCVF может быть легко перенесена в клинику. Однако субретинальное введение вектора AAV, нацеленного на фоторецепторы, может оказаться более эффективным и долговременным.
Suppression of the Unfolded Protein Response (UPR)


Многие мутации класса II в RHO приводят к образованию неправильной формы белка, который накапливается в ER.10,107-109 Такой неправильной формы родопсин стимулирует путь стресса ER, называемый UPR, который отвечает на дисбаланс между синтезом белка и его транспортировкой или деградацией. Три трансмембранных белка действуют как проксимальные сигнальные молекулы UPR: IRE1 (инозитол-требующий фермент 1), ATF6 (активирующий транскрипционный фактор 6) и PERK (протеинкиназа R-подобная ER протеинкиназа).110 Постоянная активация UPR, и в частности пути PERK, который снижает синтез белка, приводит к гибели клеток путем апоптоза. Стимуляция UPR мутацией T17M родопсина также увеличивает выработку воспалительных цитокинов, таких как IL-1β, IL-6 и MCP1, которые могут способствовать потере соседних фоторецепторов.111 Все три пути UPR поддерживаются в неактивном состоянии за счет связывания шапероном BiP/Grp78 семейства HSP70.112 Grp78 связывается с каждым из трансдукторов ER стресса (IRE1, ATF6 и PERK) и действует как датчик изменений гомеостаза ER, таким образом, увеличение экспрессии Grp78 может уменьшить гибель фоторецепторов при adRP. С этой целью Gorbatyuk и др113 использовали AAV2/5 для доставки гена Grp78 в сетчатку P23H Rho трансгенных крыс посредством субретинальной инъекции и обнаружили улучшение а-волновых и b-волновых ответов ЭРГ, а также структурной целостности центральной части сетчатки в течение 3 месяцев. Эти изменения были связаны с уменьшением апоптоза в сетчатке, обработанной Grp78, по сравнению с контролем. Следовательно, терапевтическую ценность для лечения адRP может представлять воздействие на вышележащие пути UPR или подавление нижележащих сигнальных путей107,114.
miRNA Gene Therapy


МиРНК - это ~22 нуклеотидные РНК, которые регулируют биологические процессы, контролируя экспрессию генов путем связывания с мРНК.115 Ряд заболеваний человека был связан с нарушениями регуляции экспрессии миРНК, и это справедливо и для сетчатки.116,117 С этой целью Loscherи др.118 сообщили об изменении уровней нескольких миРНК (miR-96, -183, -1 и -133) в сетчатке трансгенных мышей P347S RHO. Кроме того, Conte и др.119 выявили мутацию в важной области (нуклеотиды 2-7) miR-204, которая сегрегационно связана с одной из форм дистрофии сетчатки и колобомы у людей. Та же группа использовала вектор AAV2/8, экспрессирующий предшественник мышиного miR-204 (pre-miR-204) под контролем cytomegalovirus immediate-early промотора в P247S RHO трансгенных мышах. При введении препарата новорожденным мышам авторы наблюдали статистически значимое увеличение амплитуд a-волны и b-волны ЭРГ, хотя явных различий в толщине ONL не было. Когда мышам вводили препарат на более поздних стадиях дегенерации сетчатки (P30), они наблюдали увеличение b-волны, которое продолжалось до P60. Эти исследователи сообщили об аналогичном положительном результате, когда они использовали AAV для доставки miR-211, паралога miR-204. Для анализа механизма защиты, обеспечиваемого AAV-miR-204, они провели анализ последовательности РНК и обнаружили увеличение экспрессии генов, участвующих в зрительном восприятии, и снижение экспрессии генов, связанных с врожденным иммунитетом и воспалением. Они также показали сохранение структуры сетчатки при рецессивно наследуемой дегенерации сетчатки (Aipl1 -/-). Эта работа позволяет предположить, что доставка генов с помощью миРНК может быть полезной при различных наследственных заболеваниях сетчатки за счет стимуляции общих путей, способствующих выживанию.
Delivery of Opsins to Surviving Cells


В тяжелых случаях адRP, связанных с мутациями RHO класса А, и даже в некоторых случаях мутаций класса В, клинический диагноз и генетическая характеристика могут быть поставлены слишком поздно, чтобы спасти фоторецепторные клетки. Поэтому перенос генов в эти клетки невозможен. Однако при некоторых формах адRP внутренняя часть сетчатки серьезно поражается только на поздних стадиях заболевания.120,121 Несколько групп исследовали перенос каналов, управляемых фотопереключателями122-124, или реагирущих на свет белков125-132 в выжившие нейронные клетки сетчатки. Эта тема рассматривалась в других источниках, а также стала предметом недавнего сборника статей.133,134 Перенос опсинов или каналов в колбочковидные фоторецепторы нецелесообразен, поскольку в тяжелых случаях АДRP колбочковые фоторецепторы также погибают, и мозаика колбочек изменяется.121,135,136 С точки зрения кинетики и чувствительности к слабому свету, перенос генов человеческого колбочковидного опсина средней длины волны представляется отличным вариантом. После интравитреальной инъекции AAV2, экспрессирующего колбочковый опсин 1-2-месячным мышам rd1, Berry и его коллеги обнаружили, что экспрессия опсина средней длины волны в 45% ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) сделала эти клетки чувствительными к вспышкам света. Сетчатка этих мышей была так же чувствительна к свету в помещении, как у мышей, обработанных AAV2-кодирующим родопсином, и в 1000 раз более чувствительна, чем у мышей, обработанных другими светочувствительными молекулами, включая канальный родопсин или галородопсин. По сравнению с трансдукцией retinal ganglion cells (RGCs) родопсином, мыши, экспрессирующие MW-опсин, демонстрировали более быструю кинетику и меньшее снижение сигнала после повторных вспышек. Более того, трансдукция RGCs с средней длины волны опсином позволила мышам rd1 различать световые узоры на ЖК-экране и выполнять управляемые зрением действия в условиях внешней освещенности. Эксперименты по восстановлению зрения у мышей, лишенных фоторецепторных клеток, многообещающи и привели к клиническим испытаниям (NCT02556736, NCT03326336), но для устранения сигналов от эндогенных фоторецепторов эксперименты проводились в основном на мышах Pde6B rd1 или на тройном мутанте, у которого на момент лечения отсутствует световая чувствительность. Эксперименты с использованием этой методики еще предстоит провести на животных моделях адRP, связанных с мутациями родопсина. Поскольку у большинства пациентов с RP сохраняется некоторая светочувствительность фоторецепторов, лечение этих пациентов с помощью AAV, экспрессирующих светочувствительные молекулы, усложнит интерпретацию результатов клинических испытаний и может вызвать у пациентов непоследовательные, субъективные зрительные реакции.
Conclusions


Первая точечная мутация в RHO, приводящая к адRP, была идентифицирована в 1990 году.137 В то время, и, действительно, в течение многих лет после этого, советы, данные пациентам с адRP и их семьям, включали аккомодацию к снижению зрения и некоторую оценку скорости снижения зрения. Последние достижения, кратко изложенные выше, позволяют обсудить потенциальные генные методы лечения родопсин-ассоциированной адRP и подтверждают необходимость генетической и фенотипической характеристики пациентов, чтобы выбрать подходящее лечение и использовать подходящие клинические показатели.